암모니아 급성노출에 의한 바이오플락 사육 넙치(Paralichthys olivaceus)의 혈액학적 성상 및 항산화반응의 변화 Alterations in Hematological Parameters and Antioxidant Responses in the Biofloc-reared Flatfish Paralichthys olivaceus Following Ammonia Exposure원문보기
Flatfish Paralichthys olivaceus raised in biofloc system (mean length $27.6{\pm}3.1cm$, mean weight $280.4{\pm}26.5g$) were exposed for to different concentrations of ammonia (0, 8, 16, 32, and $64mg\;{NH_4}^+/L$) for 7 days. Following ammonia exposure, hematological...
Flatfish Paralichthys olivaceus raised in biofloc system (mean length $27.6{\pm}3.1cm$, mean weight $280.4{\pm}26.5g$) were exposed for to different concentrations of ammonia (0, 8, 16, 32, and $64mg\;{NH_4}^+/L$) for 7 days. Following ammonia exposure, hematological parameters such as hemoglobin and hematocrit were significantly reduced. Plasma components such as magnesium, glucose, aspartate aminotransferase (AST), and alanine aminotransaminase (ALT) were significantly altered by ammonia exposure, whereas there were no significant changes in calcium, cholesterol, or total protein. Antioxidant responses, such as superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) levels were significantly elevated following ammonia exposure. The results of this study indicate that ammonia exposure induces significant changes in hematological parameters and antioxidant responses in biofloc-reared Paralichthys olivaceus as a toxic response.
Flatfish Paralichthys olivaceus raised in biofloc system (mean length $27.6{\pm}3.1cm$, mean weight $280.4{\pm}26.5g$) were exposed for to different concentrations of ammonia (0, 8, 16, 32, and $64mg\;{NH_4}^+/L$) for 7 days. Following ammonia exposure, hematological parameters such as hemoglobin and hematocrit were significantly reduced. Plasma components such as magnesium, glucose, aspartate aminotransferase (AST), and alanine aminotransaminase (ALT) were significantly altered by ammonia exposure, whereas there were no significant changes in calcium, cholesterol, or total protein. Antioxidant responses, such as superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) levels were significantly elevated following ammonia exposure. The results of this study indicate that ammonia exposure induces significant changes in hematological parameters and antioxidant responses in biofloc-reared Paralichthys olivaceus as a toxic response.
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제안 방법
노출에 사용된 암모니아는 NH4 Cl (Sigma Chemical, St. Louis, MO, ≥99.0%)를 이용하여, 암모니아 표준원액 10,000 mg NH4+/L를 제조 후, 0, 8, 16, 32 및 64 mg NH4+/L의 농도로 노출하였다.
사전 노출실험을 실시하여, 바이오플락 사육수에 의한 암모니아의 감소 시간을 확인한 결과, 3일째 암모니아 농도의 감소가 확인되었다. 따라서, 바이오플락 사육수에 의한 암모니아 제거효과에 대한 간섭을 막기 위해, 사육수는 2일에 한번 완전 환수 후, 암모니아 농도를 다시 조정하여 노출실험을 실시하였다. 암모니아 노출 후, 실제 측정된 암모니아 농도는 해양환경공정시험기준(2010)에 따라 측정하였다.
암모니아 노출 후, 실제 측정된 암모니아 농도는 해양환경공정시험기준(2010)에 따라 측정하였다. 실험 완료 후, 생존개체는 동물실험 윤리에 따라 ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate salt를 이용하여 완전 마취하여 채혈 및 조직을 분리하였다.
항산화반응을 확인하기 위해 항산화효소인 superoxide dismutase (SOD)와 catalase (CAT)를 분석하였다. 항산화효소를 측정하기 위해, 간과 아가미 조직을 분리 후, 0.
혈액은 헤파린 처리한 1 mL 일회용 주사기를 이용하여, 미부정맥에서 채혈 후 분석하였다. 혈액학적 성상인 hemoglobin 농도는 임상용 kit (Asan Pharm.
혈장 성분 분석을 위해 채취한 혈액은 4°C에서 10,000 rpm 로 10분간 원심분리 후, 혈장을 분리하였다. 혈장 무기성분으 로 calcium과 magnesium을 측정하였다. Calcium은 OCPC 법, magnesium은 Xylidyl blue-I법에 따라 임상용 kit (Asan Pharm.
, Ltd)를 이용하여 측정하였다. 혈장 유기성분으로 glucose, cholesterol, total protein을 측정하였다. Glucose는 GOD/POD법, cholesterol은 enzyme method, total protein은 Biuret법에 따라 임상용 kit (Asan Pharm.
, Ltd)를 이용하여 측정하였다. 혈장효소 성분인 AST (Aspartate aminotransferase), ALT (Alanine aminotransminase), ALP (Alkaline phosphatase)를 측정하였다. AST와 ALT는 505 nm에서 ReitmanFrankel법, ALP는 King-King법으로 500 nm에서 임상용 kit (Asan Pharm.
대상 데이터
0%)를 이용하여, 암모니아 표준원액 10,000 mg NH4+/L를 제조 후, 0, 8, 16, 32 및 64 mg NH4+/L의 농도로 노출하였다. 실험어는 150 L 원형수조에 각 5마리씩 총 25마리를 수용하였고, 노출환경 및 노출 수조의 실제 암모니아 농도는 Table 1-2와 같다. 사전 노출실험을 실시하여, 바이오플락 사육수에 의한 암모니아의 감소 시간을 확인한 결과, 3일째 암모니아 농도의 감소가 확인되었다.
평균 무게 6.8±1.1 g의 치어를 분양 받아, 바이오플락 사육환경에서 6개월간 양식한 넙치(평균 체장 27.6±3.1 cm, 평균 체중 280.4±26.5 g)를 본 실험에 사용하였다.
데이터처리
험 분석 결과에 대한 통계학적 유의성은 SPSS 통계 프로그램(SPSS Inc.)을 이용하여 ANOVA test를 실시하고, 사후검정으로 Duncan’s multiple range test를 통해 P<0.05일 때 유의성이 있는 것으로 간주하였다.
이론/모형
혈장효소 성분인 AST (Aspartate aminotransferase), ALT (Alanine aminotransminase), ALP (Alkaline phosphatase)를 측정하였다. AST와 ALT는 505 nm에서 ReitmanFrankel법, ALP는 King-King법으로 500 nm에서 임상용 kit (Asan Pharm. Co., Ltd)를 이용하여 분석하였다.
Louis, MO)를 이용하여 측정하였다(Kim and Kang, 2015a). CAT 활성은 CAT assay kit (Sigma Chemical, St. Louis, MO)를 이용하여 측정하였다(Kim and Kang, 2017a). 각 조직의 단백질 농도는 bovine plasma albumin (Sigma Chemical, St.
혈장 무기성분으 로 calcium과 magnesium을 측정하였다. Calcium은 OCPC 법, magnesium은 Xylidyl blue-I법에 따라 임상용 kit (Asan Pharm. Co., Ltd)를 이용하여 측정하였다. 혈장 유기성분으로 glucose, cholesterol, total protein을 측정하였다.
혈장 유기성분으로 glucose, cholesterol, total protein을 측정하였다. Glucose는 GOD/POD법, cholesterol은 enzyme method, total protein은 Biuret법에 따라 임상용 kit (Asan Pharm. Co., Ltd)를 이용하여 측정하였다. 혈장효소 성분인 AST (Aspartate aminotransferase), ALT (Alanine aminotransminase), ALP (Alkaline phosphatase)를 측정하였다.
균질화한 뒤 4°C에서 10,000 rpm로 30분간 원심분리하여 상등액을 분석에 사용하였다. SOD 활성은 WST-1의 환원반응에 대한 50% 억제 비율을 측정하는 방법의 SOD assay kit (Sigma Chemical, St. Louis, MO)를 이용하여 측정하였다(Kim and Kang, 2015a). CAT 활성은 CAT assay kit (Sigma Chemical, St.
각 조직의 단백질 농도는 bovine plasma albumin (Sigma Chemical, St. Louis, MO)을 기준으로 하여 Bradford’s method (1976)를 사용하여 측정하였다.
따라서, 바이오플락 사육수에 의한 암모니아 제거효과에 대한 간섭을 막기 위해, 사육수는 2일에 한번 완전 환수 후, 암모니아 농도를 다시 조정하여 노출실험을 실시하였다. 암모니아 노출 후, 실제 측정된 암모니아 농도는 해양환경공정시험기준(2010)에 따라 측정하였다. 실험 완료 후, 생존개체는 동물실험 윤리에 따라 ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate salt를 이용하여 완전 마취하여 채혈 및 조직을 분리하였다.
혈액은 헤파린 처리한 1 mL 일회용 주사기를 이용하여, 미부정맥에서 채혈 후 분석하였다. 혈액학적 성상인 hemoglobin 농도는 임상용 kit (Asan Pharm. Co., Ltd)를 이용하여 Cyanmethemoglobin법으로 측정하였으며, hematocrit는 모세관 내로 혈액을 넣어, Microhematocrit centrifuge (VS-12000, 한국)에서 12,000 rpm, 10분간 원심분리 후 Micro-hematocrit reader를 이용하여 측정하였다.
성능/효과
간 조직의 CAT 활성은 암모니아 16 mg NH4+/L 이상의 노출에서 유의적으로 증가하였으며(P<0.05), 아가미 조직의 CAT 활성은 암모니아 32 mg NH4+/L의 노출에서 유의적으로 증가하였다(P<0.05).
본 실험에서 바이오플락 사육수에서 사육된 P. olivaceus의 암모니아 노출은 32 mg NH4+/L에서 유의적인 혈액학적 성상의 변화를 초래하였으며, 16 mg NH4+/L 이상의 농도에서 유의적인 항산화효소의 변화를 나타내었다. 이러한 결과는 바이오플락 사육수에서 생물을 양성하는 과정에서 사육지표에 대한 기준을 제시해 줄 것이다.
, 1991; Rama and Manjabhat, 2014). 본 실험에서 암모니아의 노출은 P. olivaceus 에서 AST 및 ALT의 유의적인 증가를 초래하였다. 많은 연구에서 암모니아 노출에 따른 carp Cyprinus carpio; black sea bream Acanthopagrus schlegelii; sablefish Anoplopoma fimbria의 AST와 ALT 유의적 증가를 보고 하였으며(Jeney et al.
항산화효소는 생물의 항산화상태를 나타나기에, 산화스트레스에 대한 바이오마커 역할을 하며, SOD와 CAT 활성은 수생생물의 항산화 방어 상태의 지표로 사용된다 (Rama and Manjabhat, 2014). 본 실험에서 암모니아의 노출은 P. olivaceus의 간과 아가미 조직의 SOD와 CAT 효소의 활성을 유의적으로 증가시켰다. Cheng et al.
, 2017c). 본 연구에서 P. olivaceus의 암모니아 노출은 항산화효소의 증가를 유발함을 확인하였다.
이러한 glucose의 증가는 어류에 가해지는 스트레스가 catecholamine의 분비를 활성화시키기 위해 adrenaline과 nor-adrenaline을 방출시키고, 분비된 catecholamine은 간에서 glycogen이 glucose로의 전환을 증가시키기 때문이다. 본 연구에서, 암모니아 노출은 P. olivaceus의 혈장 glucose의 유의적 증가를 초래하였다. 혈중 cholesterol은 세포막의 중요한 구조성분이며, 모든 스테로이드 호르몬의 전구체이며, 스트레스 지표로 주로 사용된다(Firat and Kargin, 2010).
혈장의 무기성분인 calcium과 magnesium은 삼투압 변화를 나타내는 주요한 지표이며, 다양한 환경변화에 의해 증가하거나 감소할 수 있다(Kim and Kang, 2014). 본 연구에서, 암모니아 노출은 P. olivaceus의 혈장 magnesium의 유의적 감소를 초래하였으며, 이는 암모니아 노출로 인한 이온조절 변화에 의한 것으로 판단된다. Kim et al.
, 2017b). 본 연구에서, 암모니아에 노출된 flatfish Paralichthys olivaceus의 hemoglobin 농도와 hematocrit 수치에서 유의적 감소가 나타났으며, 이는 암모니아 노출에 의한 저산소 상태에서 조혈세포 손상에 따른 것으로 판단된다. Das et al.
실험어는 150 L 원형수조에 각 5마리씩 총 25마리를 수용하였고, 노출환경 및 노출 수조의 실제 암모니아 농도는 Table 1-2와 같다. 사전 노출실험을 실시하여, 바이오플락 사육수에 의한 암모니아의 감소 시간을 확인한 결과, 3일째 암모니아 농도의 감소가 확인되었다. 따라서, 바이오플락 사육수에 의한 암모니아 제거효과에 대한 간섭을 막기 위해, 사육수는 2일에 한번 완전 환수 후, 암모니아 농도를 다시 조정하여 노출실험을 실시하였다.
, 2010). 따라서 암모니아 노출에 따른 산화스트레스에 대한 방어기작인 항산화효소의 활성은 암모니아 산화스트레스와 독성을 평가하는 기준이 될 것이다.
, 2004). 따라서, 헤모글로빈(hemoglobin)과 적혈구용적(hematocrit)와 같은 혈액성상 및 다양한 혈장성분에 대한 분석은 암모니아 독성에 따른 생물의 생리적 변화를 평가하는 좋은 지표가 될 것이다.
그 중 양식장 환경에서 자연적으로 발생하는 암모니아에 대한 기준 및 지표 마련은 무엇보다 시급한 과제이다. 우리나라 어류양식 산업에서 넙치의 중요성, 수중 암모니아의 독성영향 및 사육환경 지침 마련 등의 중요성을 고려해볼 때, 본 실험에서 조사하고자 하는 암모니아 노출에 따른 넙치의 혈액성상 및 항산화효소의 변화는 암모니아 독성에 대한 사육기준 마련 및 암모니아 독성 정도를 판단하는 의미 있는 지표가 될 것이다.
olivaceus의 암모니아 노출은 32 mg NH4+/L에서 유의적인 혈액학적 성상의 변화를 초래하였으며, 16 mg NH4+/L 이상의 농도에서 유의적인 항산화효소의 변화를 나타내었다. 이러한 결과는 바이오플락 사육수에서 생물을 양성하는 과정에서 사육지표에 대한 기준을 제시해 줄 것이다. 향후 일반 유수식에서 사육된 넙치와 바이오플락에서 사육된 넙치의 암모니아 노출에 따른 비교분석 실험을 통한 실험을 통해 사육수 환경에 따른 비교분석도 수행되어야 할 것이다.
이러한 결과는 바이오플락 사육수에서 생물을 양성하는 과정에서 사육지표에 대한 기준을 제시해 줄 것이다. 향후 일반 유수식에서 사육된 넙치와 바이오플락에서 사육된 넙치의 암모니아 노출에 따른 비교분석 실험을 통한 실험을 통해 사육수 환경에 따른 비교분석도 수행되어야 할 것이다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
수계환경에서 암모니아는 어떤 물질인가?
수계환경에서 암모니아는 농업 폐수 및 폐기물 분해 뿐만 아니라, 양식장에서 남은 사료 및 생물의 배설물 등을 통해서 자연적으로 발생하는 물질이다(Randall and Tsui, 2002; Kim et al., 2017a).
이온형태의 암모니아(NH4+)는 어떤 문제는 일으킬 수 있는가?
일반적으로 암모니아(NH3)는 비극성이며, 지질에 쉽게 용해 되기 때문에, 이온형태의 암모니아(NH4+) 보다 매우 높은 독성을 나타낸다. 하지만, 암모늄 이온(NH4+) 역시, Na+ -K+ ATPase 와 Na+ /K+ /2Cl- 공동 수송에서 칼륨이온(K+) 이온을 대체함으로써 어류의 수분조절 및 이온 균형에 영향을 미치며, 이러한 신경세포의 전기 화학적 구배교란에 의해 흥분, 과잉행동 유발, 경련과 사망을 초래한다(Roumieh et al., 2013).
의높은 농도 암모니아 노출은 어떤 문제를 일으키는가?
높은 농도의 암모니아 노출은 수계 생물에게 치명적이며, 일반적으로 고밀도의 양식장환경에서 많이 발생할 수 있다. 높은 수준의 암모니아 노출은 수중생물의 중추신경계에 독성을 발휘할 뿐만 아니라, 호흡곤란, 평형상실, 경련, 삼투 및 이온조절 실패와 과민반응 등을 유발한다(Kim et al., 2015).
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