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문제 정의
- 이 연구는 부유성 어란으로부터 얻은 COI 유전자의 PCR산물을 RFLP 방법을 이용하여 부유성 어란을 우선 그룹화한 다음, 각 그룹을 대표하는 개체를 대상으로 염기서열 결정을 한 후 종동정을 실시하였으며, 이 결과를 바탕으로 제주도 사계연안 부유성 어란의 종조성, 출현시기, 출현량을 조사함으로써 이 해역의 초기 생활사에 관련된 어류 격월별 자원의 동태 파악 및 관리를 하기 위한 기초 자료를 확보하기 위해서 실시하였다.
- , 2006)에도 사용된 바 있다. 이 연구에서는 현장 채집 시에 다수 어종의 어란이 대량으로 채집될 경우, PCR-RFLP 방법을 이용한 전단계 스크리닝(pre-screening)을 통하여 이들 어란 개체들의 동일종 유무를 우선 확인함으로써 염기서열 결정에 드는 노력과 비용을 최소화하고자 연구를 진행하였다.
제안 방법
- DNA의 농도와 순도는 분광광도계 Unicam UV/VIS Spectrometer (Heλios β, Unicam Ltd., UK)를 이용하여 흡광도를 측정하여 확인하였다.
- HinfI 반응은 50 mM Tris-HCl (pH 7.6)과 10 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 10 ng PCR 산물, 1 U HinfI을 포함하여 최종 volume을 15 μL로 실시하였다.
- PCR 반응은 최종 volume을 40 μL로 하였으며, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3)과 50mM KCl, 2 mM MgCl2, 0.2 mM dNTP mix, 0.5 mM of each primer, 50 ng template DNA solution, 1 U Ex Taq DNA polymerase (Takara, Japan)를 포함하여 TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice (TP600, Takara Bio Inc.)를 이용하여 실시하였다.
- )를 이용하여 실시하였다. PCR 반응은 최초 denaturing step으로 94℃에서 1분 동안 1회 반응시켰으며, 그 후 94℃에서 30초, primer annealing을 위해 54℃에서 1분, primer extension을 위하여 72℃에서 1분 50초의 조건으로 총 34회의 반복주기를 주었으며, 최종적으로 72℃에서 7분 동안 extension을 실시하였다. PCR 산물은 1X TAE buffer에 0.
- PCR 산물은 1X TAE buffer에 0.5 mg/μL ethidium bromide가 첨가된 0.8% agarose(LE agarose, Cambrex co.) gel에서 전기영동하여 확인하였다.
- PCR 증폭은 COI 유전자 주변 tRNA서열에 기초하여 디자인 된 forward primer (Asn_F, 5'-YGATCCYRCAAAHWCTTAGTTAACAGCTAA-3')와 reverse primer (Ser_R, 5'-GGGGTTCDAYTCCYYCCTTTCT-3')를 사용하였다.
- ) gel에서 전기영동하여 확인하였다. PCR 증폭이 확인된 산물은 AccuPrep Gel Pruification Kit (Bioneer Inc., Korea)를 이용하여 정제하였다.
- ) gel에서 전기영동하여 band 양상을 확인하였다. 동일한 band 양상을 보이는 어란 개체들을 동일한 종으로 간주하여 그룹화 하였으며, 그룹화된 PCR 증폭산물 중 하나를 선택하여 염기서열 결정을 한 후 종동정에 사용하였다.
- 부유성 어란의 출현량은 해당 해역에서의 어류의 생산력과 관련이 있다고 생각된다. 따라서 연구기간 동안 사계연안에서 채집한 어란의 출현개체수를 다른 연구결과와 비교하기 위하여 전체 출현개체수를 조사 횟수와 정점수로 나누어 평균 출현개체수로 나타내었다(Table 2). 채집시기와 기간이 서로 다르고 출현어종에 따라 산란량에 차이가 있어 다른 지역의 연구결과와 직접적인 비교는 어려우나, 사계연안에서의 평균 출현개체수가 932개체로, 기존 보고된 영일만 574개체(Han et al.
- 어란채집을 위해 봉고 네트(직경 0.6 m, 길이 2 m, 망목 333 μm)를 2-3 knots의 속도로 약 10분간 표층에서 예인하였으며, 어란의 단위면적당 출현개체수는 채집 시 네트 입구에 유량계(HYDRO-BIOS flowmeter)를 부착하여 해수 1,000 m3당 개체수(ind./1,000 m3)로 환산하여 나타내었다.
- 염기서열은 PCR-RFLP로 그룹화된 어란 중 하나의 PCR 산물을 Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kits와 ABI 3730xl DNA Analyzer (Applied Biosystems, USA)를 이용하여 결정하였다. 이를 통해 얻은 COI (약 1,551 bp) 염기서열들은 DNAssist program 2.
- 1 Cycle Sequencing Kits와 ABI 3730xl DNA Analyzer (Applied Biosystems, USA)를 이용하여 결정하였다. 이를 통해 얻은 COI (약 1,551 bp) 염기서열들은 DNAssist program 2.2 (Patterton and Graves, 2000)를 이용하여 다중 정렬한 후 육안으로 확인하였다. 종동정(species identification)은 어란으로부터 얻은 염기서열과 성어의 염기서 비교를 통해 실시하였으며 종수준의 분류가 어려울 경우에는 일부 GenBank database를 활용하여 채집 어란으로부터 얻은 염기서열과의 유전적 거리와 작성된 계통수에서의 계통분류학적인 위치를 고려하여 종(species), 속(genus), 과(family)또는 목(order) 수준까지 분류를 실시하였다.
- (2007)에 의한 650 bp, Lee and Kim (2014a)의 510 bp, Lee and Kim (2016)의 515 bp로 비교적 짧은 길이를 사용하였다. 이번 연구는 PCR-RFLP band양상으로 prescreening이 가능하도록 하기 위하여 기존의 연구에서 증폭해서 사용한 길이의 2-3배 이상의 크기인 약 1,550 bp의 증폭산물을 얻고자 COI 전체 유전자를 포함하도록 프라이머를 제작하였다.
- 정제된 COI 유전자 증폭산물은 제한효소 HinfI (Bioneer Inc., Korea)와 Hpy188I (NEB Inc., UK)을 이용하여 처리하였다. HinfI 반응은 50 mM Tris-HCl (pH 7.
- 제한효소 반응산물은 1X TAE buffer에 0.5 μg/μL ethidium bromide가 첨가된 2% agarose (LE agarose, Cambrex co.) gel에서 전기영동하여 band 양상을 확인하였다.
- 채집된 시료는 선상에서 70% ethanol로 고정한 후 실험실로 운반하였다. 조사 기간 동안 조사 해역 내 환경 요인의 시기별 변동을 관찰하기 위해서 채집시기마다 수질측정기(YSI, USA)를 이용하여 표층수온 및 염분농도를 측정하였다.
- 종동정(species identification)은 어란으로부터 얻은 염기서열과 성어의 염기서 비교를 통해 실시하였으며 종수준의 분류가 어려울 경우에는 일부 GenBank database를 활용하여 채집 어란으로부터 얻은 염기서열과의 유전적 거리와 작성된 계통수에서의 계통분류학적인 위치를 고려하여 종(species), 속(genus), 과(family)또는 목(order) 수준까지 분류를 실시하였다.
- 4%)을 얻을 수 있었다. 증폭된 PCR산물을 대상으로 RFLP를 이용하여 그룹화한 다음, 염기서열 분석을 통해서 종을 동정을 하였다. 그 결과, 조사기간 동안 채집된 어란의 출현 현황은 Table 1에 나타내었다.
- 채집시기에 따른 어란의 출현종수와 단위면적당 출현개체수를 바탕으로 종다양성지수, 균등도지수, 우점도지수를 구하였으며 그 결과는 Fig. 4에 나타내었다. 먼저 종다양성지수는 1.
대상 데이터
- 이번 조사는 제주도 사계 연안(33°13′N, 126°19′E)에서 2009년 4월부터 2010년 2월까지 격월로 실시하였다(Fig. 1).
데이터처리
- 조사기간 동안 채집된 어란의 출현종과 단위면적당 출현개체수를 토대로 종다양도지수(Shannon and Weaver, 1963), 균등도지수(Pielou, 1966), 우점도지수(McNaughton, 1967)를 계산하여 비교 분석하였으며, 수온과 염분이 어란의 출현종수나 출현개체수에 미치는 영향을 알아보기 위해서 SPSS (Ver 14.0 SPSS Inc.)를 이용하여 피어슨 상관관계 값(Pearson correlation coefficient 또는 Pearson’s r)을 구하고, 이들 값의 통계학적인 유의성 검증을 실시하였다.
- 환경요인인 수온과 염분이 채집된 어란의 출현개체수와 종수에 미치는 영향을 알아보기 위하여 Pearson’s r값으로 나타낸 상관계수와 유의성 검증을 실시하였다.
이론/모형
- 종동정(species identification)은 어란으로부터 얻은 염기서열과 성어의 염기서 비교를 통해 실시하였으며 종수준의 분류가 어려울 경우에는 일부 GenBank database를 활용하여 채집 어란으로부터 얻은 염기서열과의 유전적 거리와 작성된 계통수에서의 계통분류학적인 위치를 고려하여 종(species), 속(genus), 과(family)또는 목(order) 수준까지 분류를 실시하였다. 유전적 거리 차이는 Kimura-2-parameter distance model (Kimura, 1980)로 계산하였으며, 계통수는 MEGA6 (Tamura et al., 2013)의 NeighborJoining 방법(Saitou and Nei, 1987)을 이용하였다.
- , Korea)으로 옮겨주었다. 이후의 과정은 Accuprep Genomic DNA Extraction Kit (Bioneer Inc., Korea)에 제시한 방법을 따랐다. DNA의 농도와 순도는 분광광도계 Unicam UV/VIS Spectrometer (Heλios β, Unicam Ltd.
성능/효과
- 그 외에도 청어목(Cupeiformes), 첨치목(Ophidiiformes), 대구목(Gadiformes), 쏨뱅이목(Scorpaeniformes), 복어목(Tetraodontiformes) 어류가 출현하였다. 과(Family)수준에서는, 놀래기과(Labridae) 어류가 7종으로 가장 많이 출현하였고, 그 다음으로는 도미과(Sparidae) 어류가 3종으로 출현하였다. 그 외에 매퉁이과(Synodontidae), 돌대구과(Moridae), 옥돔과(Malacanthidae), 다동가리과(Cheilodactylidae), 돛양태과(Callionymidae) 어류가 각각 2종씩 출현하였으며, 나머지 과들은 모두 1종씩 포함하였다.
- 그 결과 수온과 출현개체수는 상관계수가 0.897로 양의 상관관계를 나타내었으며(P<0.05), 염분과 출현개체수는 -0.910으로 유의한 음의 상관관계를 보였다(P0.05).
- 3%를 차지하였다. 다음으로 멸치(Engraulis japonicus)가 2009년 4월, 8월과 2010년 2월에 총 668개체(11.9%), 무점황놀래기(Pseudolabrus eoethinus)가 2009년 10월과 12월에 총 631개체(11.3%), 아홉동가리(Goniistius zonatus)가 2009년 10월에 388개체(6.9%), 놀래기(Halichoeres tenuispinis)가 2009년 10월과 12월에 총 359개체(6.4%)로 출현하여, 이들 상위 5종이 전체 출현개체수의 52.8%를 차지하였다.
- 8%). 또한 종수준에서 정확하게 동정되지 못한 8종 가운데 2종은 과(family)까지, 그리고 1종은 목(order)까지 동정할 수 있었으나, 5종은 미동정되었다. 출현어란을 분류군으로 구분하면 목(Order)수준에서 농어목(Perciformes) 어류가 14과 24종(미동정 1종)으로 가장 많았으며, 다음으로는 가자미목(Pleuronectiformes) 어류가 2과 3종(미동정 1종), 홍메치목(Aulopiformes) 어류가 2과 3종의 순으로 출현하였다.
- 수온과 염분의 상관관계를 조사한 결과 이들은 매우 강한 음의 상관관계를 보였다(r=-0.916, P<0.01).
- 시기별로 채집된 어란의 분류군수는 2009년 6월에 14개의 분류군(12종)으로 가장 많은 분류군이 출현하였고, 2009년 10월에는 11개의 분류군(10종), 2009년 8월과 2010년 2월에는 동일하게 10개 분류군(9종)이 채집되었으며, 2009년 4월과 12월에는 각각 8개의 분류군(6종)과 5개의 분류군(4종)이 출현하였다. 채집된 어란 가운데 출현개체수에 있어서 가장 많은 어종은 옥돔(Branchiostegus japonicus)으로 2009년 8월에 912개체가 출현하였으며, 전체 출현개체수의 16.
- 어류군집의 특성을 밝히는데 중요하게 사용되는 생태지수 중우점도지수의 경우에는 단위면적당 출현개체수가 적고 특정 어류의 개체수 많았던 2009년 12월과 4월에 각각 0.81과 0.74로 높은 값을 나타내었으며, 출현종수가 가장 많았던 6월에 0.37로 가장 낮게 나타났다. 종다양성지수의 경우에는 우점도지수와 상반된 형태로 변화하였고, 출현종수가 가장 많았던 2009년 6월(H′=2.
- 분자동정에 있어서 유전자의 PCR 증폭성공률은 어란의 종동정 가능성을 높이는 것과 직접적으로 연관되어 있다. 이 연구에서 종동정을 위해 사용한 COI 유전자의 증폭 성공률은 94.7%로 cytochrome b (cyt b) 유전자를 이용한 PCR 증폭성공률인 68.3% (Han et al., 2015)보다 높게 나타났다. 이는 cyt b 유전자의 증폭을 위해서 유전자 주변 tRNA 지역(glutamic acid tRNA의 5' 말단과 threonine 또는 proline tRNA의 3' 말단)의 염기서열에 기초하여 디자인한 프라이머 위치에 일부 어종에서 tRNA의 유전자 재배열(Inoue et al.
- 그 결과, 조사기간 동안 채집된 어란의 출현 현황은 Table 1에 나타내었다. 이들 어란들은 전체 43개의 분류군으로 구분되었고, 이중 35종(8목 23과 32속)은 종수준까지 동정이 이루어졌다(81.8%). 또한 종수준에서 정확하게 동정되지 못한 8종 가운데 2종은 과(family)까지, 그리고 1종은 목(order)까지 동정할 수 있었으나, 5종은 미동정되었다.
- 이번 조사에서 채집된 어란들의 출현시기와 단위면적당 출현개체수(Table 1) 그리고 채집 시 수온(Fig. 2)을 종합하여 기술하면, 노랑벤자리는 2009년 4월, 6월, 12월, 2010년 2월에 총 4회 출현하였으며, 14.9-18.4℃ 수온범위에서 출현하였다. 멸치의 경우, 2009년 4월, 8월, 2010년 2월에 총 3회 출현하였고, 가장 넓은 수온범위(14.
- 3과 Table 1에 나타내었다. 전체 단위면적당 출현개체수는 5,590개체였으며, 시기별로 2009년 8월에 2,344개체로 가장 많은 어란이 채집되었고, 다음으로는 2009년 10월에 1,693개체, 2010년 2월에 675개체, 2009년 6월에 406개체, 12월에 254개체, 4월에 219개체가 채집되어 상대적으로 고수온기인 8월과 10월에 많은 출현개체수를 보였다.
- 채집시기별로는 2009년 4월에 가장 많은 개체가 채집된 종은 노랑벤자리(Callanthias japonicus)로 4월에 98개체(44.7%)가 출현하였으며, 6월에는 돌돔(Oplegnathus fasciatus)과 놀래기가 동일하게 76개체씩 출현하였고, 각각 6월 출현개체수의 18.7%를 차지였다. 8월에는 전체 출현개체수에서도 가장 많았던 옥돔 912개체(38.
- 또한 종수준에서 정확하게 동정되지 못한 8종 가운데 2종은 과(family)까지, 그리고 1종은 목(order)까지 동정할 수 있었으나, 5종은 미동정되었다. 출현어란을 분류군으로 구분하면 목(Order)수준에서 농어목(Perciformes) 어류가 14과 24종(미동정 1종)으로 가장 많았으며, 다음으로는 가자미목(Pleuronectiformes) 어류가 2과 3종(미동정 1종), 홍메치목(Aulopiformes) 어류가 2과 3종의 순으로 출현하였다. 그 외에도 청어목(Cupeiformes), 첨치목(Ophidiiformes), 대구목(Gadiformes), 쏨뱅이목(Scorpaeniformes), 복어목(Tetraodontiformes) 어류가 출현하였다.
- 형태학적 구분이 비교적 쉬운 멸치어란을 제외하고, 조사기간 동안 사계 연안에서 채집된 전체 301개의 어란 가운데 275개로부터 COI PCR 증폭산물(91.4%)을 얻을 수 있었다. 증폭된 PCR산물을 대상으로 RFLP를 이용하여 그룹화한 다음, 염기서열 분석을 통해서 종을 동정을 하였다.
후속연구
- (1991)은 제주도 북부 연안에서도 총 64종의 자치어가 출현한다고 보고한 바 있다. 따라서, 제주도 주변해역은 어류의 산란장 뿐만 아니라 자치어의 성육장으로도 중요한 역할을 하고 있다고 생각되며, 이 해역에서의 초기 생활사에 관련된 어류 자원의 동태 파악 및 관리를 위해서 앞으로 보다 다양한 장소와 시기를 대상으로 지속적인 관련 자료 축적이 필요하다고 생각된다.
- , 2015) 보다 많아서 비교 대상인 다른 지역보다 상대적으로 높은 어란 밀도를 나타내었다. 이러한 결과는 사계 연안 어류군집에 관한 연구(Kim et al., 2014)의 결과에서 볼 수 있듯이 삼중자망에 어획된 단위면적당 생체량(kg/1,000 m2)으로 환산한 CPUE(Catch Per Unit Effort)값이 제주 용수리, 포항, 거성, 거제에 비해서 사계에서 높게 나타난 점을 고려할 때 사계지역에서의 높은 어류서식 밀도와 관련이 있을 것으로 추정되지만 어류의 서식밀도와 부유성어란의 출현량과의 관계는 앞으로 보다 세밀한 조사가 이루어져야 하겠다.
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