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다양한 작물에서 세균검은점무늬병을 일으키는 Acidovorax valerianellae의 병원성이 다른 2그룹
Two Pathogenic Groups in Acidovorax valerianellae Causing Bacterial Black Spot on the Various Crop Plants 원문보기

Research in plant disease = 식물병연구, v.23 no.4, 2017년, pp.314 - 321  

김혜성 ((주)농우바이오) ,  김영탁 ((주)농우바이오) ,  박경수 ((주)농우바이오) ,  이지혜 ((주)농우바이오) ,  이혁인 (농림축산검역본부) ,  차재순 (충북대학교 식물의학과)

초록
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Acidovorax valerianellae는 콘샐러드에서 세균검은점무늬병(bacterial black spot)을 일으키는 병원균으로 2003년 프랑스에서 최초로 보고되었고, 2011년에 국내의 수박에서 동일한 병을 일으키는 병원균으로 보고되었다. 본 연구에서는 콘샐러드 분리균주와 수박 분리균주의 2 그룹 사이에 기주특이성을 확인하고 비교하였다. 병원성검정 결과 수박 분리 5균주는 박과 6가지 작물에서 병원성을 보였으나 콘샐러드에서는 병원성이 없었고, 콘샐러드 분리 4균주는 콘샐러드에서만 병원성을 나타내었다. Biolog 기질이용성에서는 총 95개 기질 중 4개(Malonic Acid, ${\alpha}-Hydroxybutyric$ Acid, ${\alpha}-Keto$ Butyric Acid, Glycyl-LGlutamic Acid)의 기질에서 차이를 나타냈다. 16S rDNA 염기 서열을 이용하여 계통수를 작성하고 균주 간 유연관계를 분석한 결과, 모든 A. valerianellae 균주는 Acidovorax속의 다른 종과는 별개의 한 개의 clade로 그룹화되었다. 그 clade 내에서 수박 분리균주들과 콘샐러드 분리균주들이 서로 다른 2개의 소그룹으로 나뉘었다. REP-PCR 결과 또한 2개 그룹 사이에 차이를 보여주었다. 기주특이성, 기질이용성 그리고 일부 유전적 특성들은 A. valerianellae 내에 병원성이 다른 2가지 그룹 즉 수박 분리균주 그룹과 콘샐러드 분리균주 그룹이 존재함을 보여주고 있다.

Abstract AI-Helper 아이콘AI-Helper

Acidovorax valerianellae had been reported a causal agent of bacterial black spot disease on corn salad in France, 2003 and on watermelon in Korea 2011. In this study, difference in host specificity between 2 groups, corn salad strains and watermelon strains, of Acidovorax valerianellae was recogniz...

주제어

AI 본문요약
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제안 방법

  • 16S rDNA의 염기서열에 따른 유연관계 분석.

  • GN/GP Inoculating Fluid에 600 nm에서 52% T 농도가 되도록 현탁하였고, 이 현탁액을 Biolog plate의 각 well에 150 ml씩 분주하여 30°C에서 24시간 동안 배양한 후 변색에 따라 그 기질이용 여부를 조사하였다.
  • anthurii, A. caeni 등의 균주들의 16S rDNA 염기서열을 수집하여 본 연구에서 얻은 A. valerianellae 9균주의 16S rDNA 염기서열들과 비교 분석하였다. 본 연구에서 얻은 A.
  • 각 식물의 종자를 원예용 상토 식물세계® (Nongwoobio. Co., Ltd., Yeoju, Korea)가 담긴 50구 연결포트에 파종하여 온실에서 재배하였으며, 본엽 1엽이 완전히 전개된 유묘에 병원균을 접종하였다.
  • 병원균들은 King's B 배지에 도말하여 28°C에서 48시간 배양시킨 후 멸균수에 현탁하고, 현탁액의 흡광도를 분광광도계(Mecasys, Deajeon, Korea)로 OD600nm에서 0.1 (2×108 cfu/ml)로 조절하였다.
  • 본 연구에서는 국내의 수박에서 분리한 A. valerianellae 균주의 병원성이 기주식물에 따라 콘샐러드로부터 분리된 균주의 병원성과 다름을 인지하고, 수박 분리균주와 콘샐러드 분리균주의 병원성, 표현형 및 유전적 특성을 비교하여 A. valerianellae에 기주에 따라 병원성이 다른 2가지 그룹이 있음을 확인하였다.
  • 분리기주가 다른 A. valerianellae 9균주의 16S rDNA 염기서열을 이용하여 계통수(phylogenetic tree)을 작성하여 균주 간 유연관계를 비교하였다. 계통수 작성에는 본 연구에서 사용한 A.
  • 분리기주가 다른 A. valerianellae 9균주의 유전적 다양성을 비교하기 위해 ERIC 2/ERIC 1R 프라이머를 이용한 REP-PCR을 실시하였다. REP-PCR 결과 수박으로부터 분리된 A.
  • 분리기주에 따른 A. valerianellae 균주별 기질이용성의 차이를 Biolog GN2 Microplate (Biolog Inc., Haywood, CA, USA)를 이용하여 조사하였다. 수박으로부터 분리된 3균주와 콘샐러드로부터 분리된 2균주를 BUG (Biolog Universal Growth) agar에 스트리크(streak)하여 30°C에서 24시간 배양하였다.
  • 분리기주에 따른 A. valerianellae 균주별 박과식물과 콘샐러드에 대한 병원성의 차이를 알아보고자 A. valerianellae 9균주를 박과 8가지 작물인 수박(Citrullus lanatus cv. bravoggul), 멜론(Cucumis melo cv. earthtalent), 오이(Cucumis sativus cv. salim), 참외(Cucumis melo cv. chamsarang), 애호박(Cucurbita moschata cv. nongwooae), 쥬키니호박(Cucurbita pepo cv. sunnyhouse), 대목용 호박(Benincasa cerifera cv. rspower), 대목용 박(Lagenaria leucantha cv. shinhwachangzo)과 콘샐러드(Valerianella locusta)의 유묘에 접종하였다. 각 식물의 종자를 원예용 상토 식물세계® (Nongwoobio.
  • 분리된 기주식물에 따른 A. valerianellae 균주별로 기질이용성의 차이를 Biolog GN2 Microplate (BIOLOG)를 이용하여 조사하였다. 수박으로부터 분리된 3균주(NWB SC185, NWB SC190, KACC16997)와 콘샐러드로부터 분리된 2균주(CFBP4723, CFBP6480)의 기질이용성을 비교한 결과, 95개의 기질 중에서 29개(Tween 20, Tween 80, D-Fructose, Pyruvic Acid Methyl Ester, Succinic Acid Mono-Methyl-Ester, Acetic Acid, D-Gluconic Acid, b-Hydroxybutyric Acid, a-Keto Glutaric Acid, a-Keto Valeric Acid, D,L-Lactic Acid, Propionic Acid, Sebacic Acid, Succinic Acid, Bromosuccinic Acid, Succinamic Acid, D-Alanine, L-Alanine, L-Alanylglycine, L-Asparagine, L-Aspartic Acid, L-Glutamic Acid, L-Leucine, LPhenylalanine, L-Proline, L-Pyroglutamic Acid, L-Serine, Urocanic Acid, Glycerol)에 대해서 수박 및 콘샐러드로부터 분리된 5균주 모두 이용하는 것(양성 반응)으로 나타났으며, 8개 기질(L-Arabinose, γ-Hydroxybutyric Acid, a-Keto Butyric Acid, Malonic Acid, L-Histidine, Glycyl-LGlutamic Acid, L-Threonine, γ-Amino Butyric Acid)에 대해서는 5균주별 이용성의 차이를 보였으며, 수박으로부터 분리한 3균주와 콘샐러드로부터 분리한 2균주 사이에서는 4개 기질(Malonic Acid, a-Hydroxybutyric Acid, a-Keto Butyric Acid, Glycyl-LGlutamic Acid)의 이용성 차이를 보였다(Table 3).
  • 세균 균주들을 28°C에서 48시간 동안 King's B 배지에 배양한 후 자동핵산분리기(ROCHE, Basel, Switzerland)를 이용하여 DNA를 분리하였으며, 분리된 DNA는 10 ng/ml로 정량한 후 -20°C에 보관하며 사용하였다.
  • 수박으로부터 분리한 A. valerianellae 5균주와 콘샐러드로부터 분리한 A. valerianellae 4균주를 포함하여 Acidovorax속 균주들 사이의 16S rDNA 염기서열을 비교하였다. 본 연구에 사용한 A.
  • 이 병원균 현탁액을 유묘에 분무 접종하고, 접종한 식물체를 28°C 생장실(상대습도 95%)에서 24시간 보관한 후 온실(24-30°C)로 옮겨 관리하였다. 접종 후 3주까지 병징의 변화를 관찰하며 발병주율을 조사하였다. 각 처리 별 50주 씩 3반복으로 실험하였으며, 결과는 SAS (SAS Institute, Inc.
  • 각각의 염기서열은 NCBI의 GenBank에 등록된 서열 중 가장 유사도가 높은 서열과 비교하였으며, CLUSTAL W 프로그램을 이용하여 다중정열 하였다(Thompson 등, 1994). 정열 된 각 염기서열의 evolutionary distance matrix는 K2P (Kimura 2-parameter)로 구하였고, phylogenetic tree algorithm은 MLE (Maximum Likelihood)을 이용하여 계통도를 그렸으며, 지지도를 확인하기 위하여 1,000번의 부트스트랩(bootstrap)을 수행하여 500 이상의 값을 표기하였다.
  • 프라이머는 bacterial repetitive elements 중 ERIC sequence를 기반으로 만든 ERIC 2[5'-AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGC G-3']와 ERIC 1R[5'-ATG TAA GCT CCT GGG GAT TCA C-3']을 사용하였으며, Ex Taq PCR kit (GENETBIO, Daejeon, Korea)를 이용하여 세균의 genomic DNA (gDNA) 10 ng를 포함한 반응액 20 ml로 PCR을 수행하였다.

대상 데이터

  • valerianellae 9균주의 16S rDNA 염기서열을 이용하여 계통수(phylogenetic tree)을 작성하여 균주 간 유연관계를 비교하였다. 계통수 작성에는 본 연구에서 사용한 A. valerianellae 9균주의 rDNA 염기서열 외에 NCBI GenBank에 등록된 A. valerianellae 그리고 A. valerianellae 유사한 균주의 16S rDNA 염기서열을 포함시켰다. 계통수 작성에 사용한 모든 A.
  • 농촌진흥청 농업유전자원센터 미생물은행(Korean Agricultural Culture Collection, KACC, Wanju, Korea)에서 수박분리 1균주, ㈜농우바이오(Nongwoobio. Co., Ltd., Yeoju, Korea)에서 수집한 수박분리 4균주, 그리고 농림수산검역검사본부의 금지품국가수입허가절차를 거쳐 프랑스 균주은행(Collection Francaise de Bacteries Phytopathogenes, CFBP, Beaucouze, France)으로부터 콘샐러드(corn salad)로부터 분리한 4균주를 분양을 받아 사용하였다(Table 1).
  • 본 연구에 총 9개의 A. valerianellae 균주들이 사용되었다. 농촌진흥청 농업유전자원센터 미생물은행(Korean Agricultural Culture Collection, KACC, Wanju, Korea)에서 수박분리 1균주, ㈜농우바이오(Nongwoobio.
  • 사용된 균주들은 King's B 액체배지(Peptone 20.0 g, MgSO4·7H2O 1.5 g, K2HPO4 1.5 g/l)에 글리세롤을 15%가 되도록 첨가한 세균 보관용 용액에 현탁하여 -80°C에서 보관하여 사용하였다.

데이터처리

  • bValues denoted by the same letter are not significantly different by Duncan’s multiple range test (P≤0.05), each treatments were 3 replications.
  • 각 처리 별 50주 씩 3반복으로 실험하였으며, 결과는 SAS (SAS Institute, Inc., Cary, NC, USA) 프로그램으로 DMRT (Duncan’s multiple range test) 분석하였다.
  • 1, Tom Hall, Carlsbad, CA, US) 프로그램을 이용하여 분석하였다. 각각의 염기서열은 NCBI의 GenBank에 등록된 서열 중 가장 유사도가 높은 서열과 비교하였으며, CLUSTAL W 프로그램을 이용하여 다중정열 하였다(Thompson 등, 1994). 정열 된 각 염기서열의 evolutionary distance matrix는 K2P (Kimura 2-parameter)로 구하였고, phylogenetic tree algorithm은 MLE (Maximum Likelihood)을 이용하여 계통도를 그렸으며, 지지도를 확인하기 위하여 1,000번의 부트스트랩(bootstrap)을 수행하여 500 이상의 값을 표기하였다.
  • valerianellae 9균주의 16S rDNA 염기서열들과 비교 분석하였다. 본 연구에서 얻은 A. valerianellae 9균주들의 16S rDNA 염기서열과 NCBI에 등록된 다른 대조균주의 16S rDNA 유전자 염기서열의 상동성은 Mega (version 5.05, Pennsylvania, USA)와 BioEdit (version 7.0.1, Tom Hall, Carlsbad, CA, US) 프로그램을 이용하여 분석하였다. 각각의 염기서열은 NCBI의 GenBank에 등록된 서열 중 가장 유사도가 높은 서열과 비교하였으며, CLUSTAL W 프로그램을 이용하여 다중정열 하였다(Thompson 등, 1994).

이론/모형

  • 국내의 수박에서 분리된 A. valerianellae 5균주와 콘샐러드에서 분리된 A. valerianellae 4균주의 유전적 다양성을 비교하기 위하여 REP-PCR을 실시하였다(Louws 등, 1998). 프라이머는 bacterial repetitive elements 중 ERIC sequence를 기반으로 만든 ERIC 2[5'-AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGC G-3']와 ERIC 1R[5'-ATG TAA GCT CCT GGG GAT TCA C-3']을 사용하였으며, Ex Taq PCR kit (GENETBIO, Daejeon, Korea)를 이용하여 세균의 genomic DNA (gDNA) 10 ng를 포함한 반응액 20 ml로 PCR을 수행하였다.
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질의응답

핵심어 질문 논문에서 추출한 답변
수박의 세균검은점무늬병을 검사할 때의 문제점은? 국내에서는 2011년 수박에서 이 병이 발생하였고(Han 등, 2012), 수박의 세균검은점무늬병은 유묘기 초기에는 떡잎에 검은색 점무늬가 나타나고 병이 진전되면서 갈색 반점이 생기고 잎 전체가 검게 변하는 특징을 보이며, 28°C 전후 다습한 조건에서 발생한다(Han 등, 2012). 특히, 이 병은 수박에서 Acidovorax citrulli이 일으키는 과일썩음병(BFB, bacterial fruit blotch)의 병징 및 병원균과 유사하기 때문에 이 2가지 병의 구별이 쉽지 않다. 실제로 과일썩음병의 병징으로 의심되던 병반에서 A.
Acidovorax valerianellae는 무엇인가? Acidovorax valerianellae는 콘샐러드에서 세균검은점무늬병(bacterial black spot)을 일으키는 병원균으로 2003년 프랑스에서 최초로 보고되었고, 2011년에 국내의 수박에서 동일한 병을 일으키는 병원균으로 보고되었다. 본 연구에서는 콘샐러드 분리균주와 수박 분리균주의 2 그룹 사이에 기주특이성을 확인하고 비교하였다.
수박의 세균검은점무늬병은 어떤 특징을 나타내는가? valerianellae가 차나무(Camellia sinensis)에서 병을 일으킨다고 보고되었고(Tomihama 등, 2006), 그 후 박과식물에서도 세균검은점무늬병의 발생이 보고되었다(Takikawa 등, 2008). 국내에서는 2011년 수박에서 이 병이 발생하였고(Han 등, 2012), 수박의 세균검은점무늬병은 유묘기 초기에는 떡잎에 검은색 점무늬가 나타나고 병이 진전되면서 갈색 반점이 생기고 잎 전체가 검게 변하는 특징을 보이며, 28°C 전후 다습한 조건에서 발생한다(Han 등, 2012). 특히, 이 병은 수박에서 Acidovorax citrulli이 일으키는 과일썩음병(BFB, bacterial fruit blotch)의 병징 및 병원균과 유사하기 때문에 이 2가지 병의 구별이 쉽지 않다.
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참고문헌 (15)

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  2. Grimault, V., Olivier, V., Guyot, L., Valette, N., Viallevieille, F. and Lybeert, H. 2006. Seed transmission of Acidovorax valerianellae on corn salad. Proceedings of the 3rd International Seed Health Conference, 6-8 September 2006, Bydgoszcz, Poland. 

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  7. Louws, F. J., Bell, J., Medina-Mora, C. M., Smart, C. D., Opgenorth, D., Ishimaru, C. A., Hausbeck, M. K., de Bruijn, F. J. and Fulbright, D. W. 1998. rep-PCR-mediated genomic fingerprinting: a rapid and effective method to identify Clavibacter michiganensis. Phytopathology 88: 862-868. 

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  9. Rat, B. and Gardan, L. 1993. Mache - la tache bacterienne due a un Pseudomonas sp. Fruits et Legumes 111: 42-43. 

  10. Song, J. Y., Park, S. Y., Seo, M. W., Nam M. H., Lim, H. S., Lee, S. C., Lee, Y. S. and Kim, H. G. 2015. Genetic characteristics of Acidovorax citrulli population causing bacterial fruit blotch against cucurbits in Korea. Res. Plant Dis. 21: 82-88. 

  11. Takikawa, Y., Tsujimoto, H., Kusumoto, S., Kawada, H., Yamamoto, K., Kobayashi, M., Makino, T. and Nakata, T. 2008. A comparative study of Acidovorax valerianellae strains isolated from various hosts. Jpn. J. Phytopathol. 74: 255. (Abstract, In Japanese) 

  12. Tomihama, T., Nonaka, T., Nakamura, M., Iwai, H. and Arai, K. 2006. Bacterial spot of tea caused by Acidovorax valerianellae. Jpn. J. Phytopathol. 72: 185-190. (In Japanese) 

  13. Willems, A., Falsen, E., Pot, B., Jantzen, E., Hoste, B., Vandamme, P., Gillis, M., Kersters, K. and De Ley, J. 1990. Acidovorax, a new genus for Pseudomonas facilis, Pseudomonas delafieldii, E. Falsen (EF) group 13, EF group 16, and several clinical isolates, with the species Acidovorax facilis comb. nov., Acidovorax delafieldii comb. nov., and Acidovorax temperans sp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 40: 384-398. 

  14. Willems, A., Goor, M., Thielemans, S., Gillis, M., Kersters, K. and De Ley, J. 1992. Transfer of several phytopathogenic Pseudomonas species to Acidovorax as Acidovorax avenae subsp. avenae subsp. nov., comb. nov., Acidovorax avenae subsp. citrulli, Acidovorax avenae subsp. cattleyae, and Acidovorax konjaci. Int. J. Syst. Bacteriol. 42: 107-119. 

  15. Young, J. M. 2010. Taxonomy of Pseudomonas syringae. J. Plant Pathol. 92: S1.5-S1.14. 

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