[논문]궤양성 대장염 유발 생쥐에 투여한 계지가용골모려탕의 치료효과

강아미; 임성우

doi:10.22246/jikm.2017.38.6.1021

궤양성 대장염 유발 생쥐에 투여한 계지가용골모려탕의 치료효과
Therapeutic Effects of Gaejigayonggolmoryo-tang on Dextran Sodium Sulfate-induced Ulcerative Colitis in Mice 원문보기

대한한방내과학회지 = The journal of internal Korean medicine, v.38 no.6, 2017년, pp.1021 - 1034

강아미 (동국대학교 한의과대학 비계내과학교실) , 임성우 (동국대학교 한의과대학 비계내과학교실)

Abstract ▼ AI-Helper

Objectives: The aim of this study was to investigate the effects of Gaejigayonggolmoryo-tang (GYT) on ulcerative colitis induced by dextran sodium sulfate (DSS) in mice. Methods: Colitis was induced by free drinking of 5% DSS in six-week-old male ICR mice. The experimental groups were the sample group, the control group, and the normal group. The sample group was treated with GYT for three days after being was given 5% DSS for five days. The control group was given water, instead of GYT, for three days after the five days of 5% DSS. The normal group was untreated (not given 5% DSS), for comparison purposes. Results: Cellular experiments showed that GYT inhibits the expression of the inflammatory enzymes COX-2 and iNOS, and the production of NO. Based on the primary cellular experiments, the effects of GYT on ulcerative colitis induced by DSS of mouse tissues were investigated. GYT reduced tissue damage and apoptosis by inhibiting the expression of the inflammatory enzymes $NF-{\kappa}B$ p65, COX-2, and iNOS. In the cellular experiment, GYT was more effective in inhibiting the expression of COX-2 than in inhibiting the expression of iNOS. GYT was evidently effective in tissues in inhibiting the expression of COX-2. Conclusions: Based on the results here, GYT may have therapeutic effects on ulcerative colitis induced by DSS. GYT is worthy of research and development as a COX-2 inhibitor and a potential drug for inflammatory bowel diseases from natural products. Further investigations for exact mechanisms will be needed.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

DSS로 유도된 대장염에서 apoptosis 유도 및 그 영향에 대해 연구하였다. Apoptosis는 단백질 합성과 활성을 위해 에너지가 요구되는 과정으로 고도로 조절되며, 광학현미경으로 보이는 apoptosis 현상의 특징은 세포수축, 세포질과 염색질의 응축, 세포표면의 수포현상, 그리고 자연 살해된 세포의 파편 등이다.
이에 저자는 桂枝加龍骨牡蠣湯 구성 약물의 항염효과 보고에 참고하여, Dextran sulfate sodium(DSS)으로 생쥐에게 유발한 궤양성 대장염에 桂枝加龍骨牡蠣湯 투여 후 대장 점막의 형태적 변화, 상피세포 보호 효과, 염증성 발현인자 억제효과, 세포자연사 억제 효과에서 조직 면역학적 유의성 있는 결과를 얻었기에 보고 한다.

제안 방법

桂枝加龍骨牡蠣湯(GYT)이 dextran sodium sulfate(DSS)로 유발된 생쥐의 궤양성 대장염에 미치는 영향을 실험적으로 규명하기 위해 GYT를 투여한 후 세포 생존력 검사, NO 생성 억제 효과, 염증효소 유전자 발현 억제 효과, 조직화학적 변화, 면역조직화학적 변화, 세포자연사를 영상분석 및 통계 처리를 이용하여 측정하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
염증성 발현인자 억제효과를 확인하기 위해 예방 효과에서 확인한 것처럼 NF-κB p65, COX-2 그리고 iNOS 항체의 발현을 조직에서 확인하였다.
DSS는 물에 타서 생쥐들이 음용할 수 있도록 하였으며, 약물은 존대를 이용하여 구강투여 하였다. 치료 효과를 확인은 5% DSS를 5일 동안 음용시킨 뒤 3일 동안 약물 투여한 군 Sample group(S), 그리고 5% DSS를 5일 동안 음용시킨 뒤 3일 동안 생수를 투여한 군Control group(C)으로 나누었으며, 무처치군을 Normal group(N)으로 하였다.

대상 데이터

桂枝加龍骨牡蠣湯의 구성약물은 ≪金櫃要略≫에 준하여 ◯◯대학교 부속한방병원 약제실에서 공급받아 사용하였다. 첩 당 처방의 내용과 용량은 다음과 같다(Table 1).
실험에 사용된 동물은 오리엔트바이오로부터 구입한 ICR계 평균 체중 30 g의 6주령 수컷 생쥐이며, 일주일 동안 온도 22±1 ℃, 습도 55±3%인 실험실 환경에서 12시간 밤낮 주기로 적응시킨 후 실험군당 5-7마리씩 나누어 사용하였다.
실험에 사용한 세포주는 마우스의 RAW264.7 세포를 KCLB(Korean Cell Line Bank)에서 구입하였다. 세포는 37 ℃, 5% CO² incubator에서 10% Fetal Bovine Serum(FBS; Sigma, USA)이 함유된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM; Welgin, Korea)에 배양하고, 오염방지를 위해 항생제 100 unit/ml penicillin(Sigma, USA)와 100 μg/ml streptomycin(Gibco/BRL, USA)을 첨가하여 사용하였다.

데이터처리

실험군 간의 유의성 검증을 위해 SPSS(ver. 20.0) program을 이용하였으며, one-way ANOVA로 분석하고 Duncan으로 사후 검증하였다. 유의수준은 p<0.

이론/모형

GYT가 RAW264.7 세포에 미치는 독성 범위를 확인하고자 XTT assay를 하였다. 그 결과 GYT 농도 1.
역전사중합효소연쇄반응법(Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)을 실시하였다. RAW264.
절편된 조직 표본을 xylene을 이용하여 탈파라핀한 후 가수화(rehydration)하여 조직화학적 염색으로는, 일반적으로 시행하는 H&E 염색과 산성점액다당류를 청색으로 염색시키는 alcian blue, 혈구 염색법으로 Wright를 시행하였다. 또한 면역조직화학적 염색으로는 탈파라핀한 후 가수화시킨 표본을 proteinase K(20 μg/ml)에 5분 동안 proteolysis 과정을 거친 후 3% H₂O₂로 5분간 처리하여 조직 내의 내인성 과산화효소를 제거하고, 1차 항체 (Table 3)를 처리하여 4 ℃ humidified chamber에서 24시간 동안 반응시켰다.

성능/효과

1. 세포실험을 통한 염증효소 억제 효과에서 桂枝加龍骨牡蠣湯이 COX-2와 iNOS 발현을 모두 억제하였으며 NO생성도 억제하였고, COX-2의 발현 억제 보다 iNOS 발현 억제 효과가 뚜렷하게 나타났으며 조직 손상에 직접 미치는 영향은 COX-2의 억제 효과가 더 우수했다.
2. 생쥐에게 DSS로 유도된 궤양성 대장염에 조직의 손상과 염증인자발현, 그리고 세포자멸사에 모두 억제하는 효과를 나타냈다.
RAW264.7 세포에 LPS를 처리한 후 GYT의 염증효소 유전자 중 iNOS와 COX-2 mRNA 발현억제 효과를 확인한 결과, iNOS mRNA는 0.5 mg/ml의 농도에서부터 현저한 발현억제 효과를 보였으며 농도 비례적인 억제 효과가 나타났다. COX-2mRNA 역시 0.
7 세포에 미치는 독성 범위를 확인하고자 XTT assay를 하였다. 그 결과 GYT 농도 1.0 mg/ml의 농도까지 세포에 독성을 나타내지 않았으며, 1.5 mg/ml의 농도부터 유의적인 세포 독성이 확인 되었으므로 GYT는 1.0 mg/ml의 농도까지 안전한 것으로 판명되었다(Fig. 1).
본 연구 결과에서도 DSS로 유도된 대장염의 Control group에서 apoptosis 증가를 보였으나 GYT 투여로 인한 감소 현상을 나타내어, GYT가 apoptosis에 의한 상피 손상도 억제하고 있음을 확인하였다. 그러나 DSS 음용 5일 후 희생시킨 Control group과 DSS 음용 후 3일 동안 물을 투여한 Control group을 비교했을 때, 염증 진행은 DSS 음용 후 3일 동안 물을 투여했을 때 염증이 더욱 진행되고 있었으나 apoptosis의 증가는 비례하지 않았다.
염증유발물질로 주로 사용되는 Lipopolysaccharides를 RAW264.7 세포에 처리하면서 GYT를 농도별(0, 0.125, 0.25, 0.5, 1.0 mg/ml)로 같이 처리한 결과 LPS만 처리한 것을 NO 생성 100% 기준으로 했을 때, LPS만 처리된 것에는 NO 생성이 매우 높은 증가량을 나타내었으나 0.5와 1.0 mg/ml 농도의 GYT를 처리했을 때 유의하게 감소하였다(Fig. 2).
9). 염증이 진행되면서 세포자멸사도 증가하는 결과는 얻지 못하였으나 GYT의 세포자연사를 억제하는 효과는 나타났다.
이상 DSS로 유도된 급성궤양성대장염에서 GYT가 NF-κB p65 유전자 발현을 억제함으로써 염증인자인 iNOS와 COX-2 발현을 억제하였으며, 특히 COX-2의 발현 억제효과가 현저히 증가되어 염증 완화 효과가 있음을 보여주었고 세포의 apoptosis 길항물질조절에 긍정적으로 영향을 미쳤음을 보여주었다. 향후 궤양성 대장염, 크론씨병 등과 같은 만성 대장질환에 임상적 연구 효용성 입증을 목표로 처방을 구성하는 각 약물의 분자 생물학적 분석에 의한 발전적 연구 방향 등이 지속되어야 할 것으로 사료된다.

후속연구

이상 DSS로 유도된 급성궤양성대장염에서 GYT가 NF-κB p65 유전자 발현을 억제함으로써 염증인자인 iNOS와 COX-2 발현을 억제하였으며, 특히 COX-2의 발현 억제효과가 현저히 증가되어 염증 완화 효과가 있음을 보여주었고 세포의 apoptosis 길항물질조절에 긍정적으로 영향을 미쳤음을 보여주었다. 향후 궤양성 대장염, 크론씨병 등과 같은 만성 대장질환에 임상적 연구 효용성 입증을 목표로 처방을 구성하는 각 약물의 분자 생물학적 분석에 의한 발전적 연구 방향 등이 지속되어야 할 것으로 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	궤양성 대장염이란 무엇인가?	궤양성 대장염은 대장점막을 침범하는 원인미상의 만성 염증성 장 질환으로, 혈변과 설사가 주 증상과 함께 점액변, 이급후중, 변실금, 복통 등이 나타나기도 하며 피로감, 식욕부진, 체중감소 등 전신 증상이 동반되는 만성적 경과가 특징인 질환이다1.
	대장에 존재하는 술잔세포로 생산된 점액의 역할은 무엇인가?	조직학적으로는 대장에 존재하는 술잔세포가 대장내의 점액을 생산하는 주된 세포로서, 생산된 점액은 점막을 보호하는 중요한 역할을 한다. DSS로 대장염이 유도된 Control group에서는 창자샘의 많은 부분이 침식되어 없어지면서 그 벽을 이루던 술잔세포를 비롯한 여러 세포가 없어졌으며, 상피탈락현상 그리고 염증세포의 침윤 등 심하게 손상된 모습을 나타내었다.
	궤양성 대장염의 치료에는 어떤 방법이 있는가?	57명에 이른 것으로 보고되었다2. 치료는 식사요법, 약물요법, 백혈구 제거요법, 외과치료 등이 있으나 일반적으로 환자의 영양상태 개선과 함께 염증 매개 억제와 숙주의 방어기전을 증가 시키는 악물 치료가 유지 된다3.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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