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문제 정의
- 따라서 본 연구는 홍삼박으로부터 최적 추출 용매를 선정하여 산성다당체를 추출하고 이온교환수지 및 투석을 이용하여 분리, 정제하고 항산화 특성을 보여주는 산성다당체를 가지고 화학구조에 대한 분석을 수행하였다.
- 본 실험에서는 홍삼 추출의 부산물인 홍삼박을 이용하여 산성다당체의 추출과 분리 그리고 정제를 통해 항산화 활성 및 구조를 분석하는 연구를 진행하였다. 다양한 용매로부터 산성다당체를 추출하였을 때 ethanol 이 각각의 용매들 중 선택성과 수율이 높았고 식품공정에서의 안정함에 따라 침전용매로 사용하였다.
제안 방법
- Column 하여 모은 용액 중 4 ∼ 14번(증류수), 17 ∼27번(0.1 M NaCl), 40 ∼ 50번(0.5 M NaCl)을 100 mL 둥근바닥플라스크에 모아 주었다.
- JNM-AL400 NMR spectrometer(Jeol, Japan) 로 ¹H NMR(400MHz)과 ¹³C NMR 스펙트럼(100MHz)을 측정하였다.
- NMR은 ¹H NMR(400MHz)과 ¹³C NMR 스펙트럼(100 MHz) 두가지를 측정했다.
- 5 mg(100:1)로 섞어 막자사발에 갈아 준 후 KBr 펠렛(pellet)을 만들고 ATR 장치 위에 올려 고정하여 주었다. VERTEX 80v FT-IR(Bruker, USA)로 흡광도를 측정하였다. NMR은 ¹H NMR(400MHz)과 ¹³C NMR 스펙트럼(100 MHz) 두가지를 측정했다.
- 다양한 용매로부터 산성다당체를 추출하였을 때 ethanol 이 각각의 용매들 중 선택성과 수율이 높았고 식품공정에서의 안정함에 따라 침전용매로 사용하였다. ethanol을 침전용매로 농도에 따라 산성다당체를 추출하였을 때 10%의 농도가 가장 적합하다 판단되어 분리 및 항산화 활성을 통해 구조 특성을 진행하였다. 이온교환수지 컬럼을 사용하여 산성다당체를 분리하였을 때 3가지 피크가 나타났고, 각각의 피크에 나온 용액을 모아 dialysis membrane을 사용하여 정제하였다.
- 가장 항산화 활성이 높은 피크에 해당하는 용출량을 합하여 동결 건조한 샘플을 산성 다당체를 구성하는 당의 특정 작용기를 분석하기 위해서 FT-IR를 이용하였다. 분석한 결과 크로마토그램(Fig.
- 분획 샘플은 자동분획기 Retriever 500(Teledyne ISCO, USA)를 사용하였으며, 시험관에 용출액은 5 mL 씩 수집하였다. 각각의 용출액의 다당체를 측정하고 항산화 활성을 측정 하였다. Column 하여 모은 용액 중 4 ∼ 14번(증류수), 17 ∼27번(0.
- 조산성다당체로부터 항산화능을 보여주는 다당체를 분리 및 정제를 하기 위해서 양이온 교환수지를 사용하였다. 계속해서 유사한 위치에서 용출되는 샘플들은 합하여 투석을 수행하였다. 투석을 하여 염이 제거된 샘플들은 동결 건조를 하여 후속 실험에 사용을 하였다.
- 70%로 증류수(A)에서 항산화능이 가장 높게 측정되었다. 본 실험 결과로부터 용출액을 증류수로 사용하여 분리한 A가 DPPH의 활성이 가장 높게 나타나서 산성다당체 구조분석 시료를 A로 사용하여 측정하였다.
- 용매 별 산성다당체 추출 수율을 비교하여alcohol를 최적 용매로 선택을 하였다. 본 실험은 홍삼박 농도를 달리하여 조산성다당체 추출 수율 및 추출 양을 비교하였다. 결과는 Fig.
- 다른 연구결과를 보면 미국 인삼에서 항산화 기능가진 다당체의 분리 실험에서는 두가지의 피크를 나타내었다 [17,18]. 본 연구에서는 세 가지의 패턴으로 나타난 피크를 가지고 DPPH라디칼 소거능을 계산하였다. DPPH 라디칼 소거능은 phenolic acids, 플라보노이드 및 기타 페놀성 화합물에 의한 항산화 작용이며, 이런 물질의 환원력이 클수록 DPPH 라디칼 소거활성이 크다고 하였다[19].
- , Australia)를 이용하여 흡광도를 측정하였으며, 증류수를 동일하게 처리하여 대조구의 흡광도를 동일한 조건에서 측정하였다. 비교구로 ascorbic acid를 이용하여 위와 동일한 방법으로 전자공여 능을 측정하여 시료군 과 비교하였고, 각 시험은 3회 반복하여 수행하였다. 전자공여능은 아래의 식을 이용하여 산출하였다.
- 용매 별 산성다당체 추출 수율을 비교하여alcohol를 최적 용매로 선택을 하였다. 본 실험은 홍삼박 농도를 달리하여 조산성다당체 추출 수율 및 추출 양을 비교하였다.
- , Seoul, Korea)를 10,000 rpm × 10분의 조건으로 수행을 하였다. 용매별(Ethanol, methanol, propanol, acetone, butanol)로 산성다당체를 분리하기 위하여 상등액에 50% (v/v) 비율로 용매를 첨가를 하였다. 침전된 조산성다당체를 분리하기 위하여 원심분리를 수행하였다.
- 5 M NaCl)을 100 mL 둥근바닥플라스크에 모아 주었다. 용출액 10개, 즉 50 mL를 3개로 각각 모아 rotary evaporator로 용매를 날려준 후 증류수 5 mL를 넣고 잘 녹여준 후 dialysis membrane에 넣고 6시간 정도 교반하여투석(dialysis)해 주었다. 투석한 용액을 -50 ℃하에 얼린 후 동결건조기로 동결 건조하였다.
- 이온교환수지 Dowexⓡ 1×2, 200수지를 column(2.5 × 100 cm)에 평형화 시켰으며, 평형화 된 수지에 10 %의 산성다당체 1 mL을 주입시켰다.
- ethanol을 침전용매로 농도에 따라 산성다당체를 추출하였을 때 10%의 농도가 가장 적합하다 판단되어 분리 및 항산화 활성을 통해 구조 특성을 진행하였다. 이온교환수지 컬럼을 사용하여 산성다당체를 분리하였을 때 3가지 피크가 나타났고, 각각의 피크에 나온 용액을 모아 dialysis membrane을 사용하여 정제하였다. 정제 후 산성다당체의 항산화능을 측정하였을 때, 증류수에서 67.
- 조산성다당체로 부터 항산화 활성 산성다당체를 분리하기 위하여 이온 교환수지를 이용하였다. 이온교환수지 Dowexⓡ 1×2, 200수지를 column(2.
- 조산성다당체로부터 분리 및 정제한 것을 사용하여 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) 라디칼 소거능에 대한 전자공여능(electron donating ability, EDA)을 측정하였다. 즉 0.
- 조산성다당체로부터 항산화능을 보여주는 다당체를 분리 및 정제를 하기 위해서 양이온 교환수지를 사용하였다. 계속해서 유사한 위치에서 용출되는 샘플들은 합하여 투석을 수행하였다.
- 조산성다당체로부터 분리 및 정제한 것을 사용하여 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) 라디칼 소거능에 대한 전자공여능(electron donating ability, EDA)을 측정하였다. 즉 0.1mM DPPH 용액을 제조하여, 투석해서 얻은 용액을 사용하여 0.5 mL와 증류수 0.5mL, 0.1 M NaCl 0.5 mL, 0.5 M NaCl 0.5 mL 각 농도의 시액을 DPPH 용액과 동일한 양으로 혼합한 후암실에서 30분간 반응 시키고 517 nm에서 UV-1601 spectrophotometer(Shimaszu Co., Australia)를 이용하여 흡광도를 측정하였으며, 증류수를 동일하게 처리하여 대조구의 흡광도를 동일한 조건에서 측정하였다. 비교구로 ascorbic acid를 이용하여 위와 동일한 방법으로 전자공여 능을 측정하여 시료군 과 비교하였고, 각 시험은 3회 반복하여 수행하였다.
- 용매별(Ethanol, methanol, propanol, acetone, butanol)로 산성다당체를 분리하기 위하여 상등액에 50% (v/v) 비율로 용매를 첨가를 하였다. 침전된 조산성다당체를 분리하기 위하여 원심분리를 수행하였다. 침전된 조산성다당체의 양을 측정하고 50 ℃ 의 열풍건조기에서 건조시켰다.
- 건조 홍삼박을 425 mesh 체 분리기를 이용하여 불순물을 제거하였다. 홍삼박 분말과 정제수를 이용하여 0.1 g , 0.5 g, 1.0 g, 1.5 g, 2.0 g 의 농도로 10 ml 용액을 제조 하였다. 산성다당체를 추출하기위해서 40 ℃ 와 130 rpm의 조건으로 2시간 추출 하였다.
- 홍삼박(10%, w/v)을 정제수에 현탁을 시키고 고형분을 분리하기 원심분리기(Supra R30, Hanil Scientific., Seoul, Korea)를 10,000 rpm × 10분의 조건으로 수행을 하였다.
- 홍삼박으로부터 용매 종류에 따른 산성다당체의 추출량을 정량하기 위하여 펙틴을 대표물질로 하여 표준 곡선을 정하고 다당체의 양에 따른 흡광도를 측정하여 평가를 하였다[14,15]. 표준곡선식에 따라 평가된 산성다당체 추출은 Fig.
- 홍삼알코올 추출물에 함유되어있는 산성다당체는 pectin 정량에 상용되는 carbazole sulfuric acid 방법으로 측정하였으며 대조구에는 carbazole을 사용하였다. 건조된 파우더에 증류수 10 mL 첨가하여 잘 용해하였다.
대상 데이터
- FT-IR은 표면반사 적외선 분광기를 사용했다. 샘플 준비는 KBr 150 mg에 시료 1.
- 건조 홍삼박을 425 mesh 체 분리기를 이용하여 불순물을 제거하였다. 홍삼박 분말과 정제수를 이용하여 0.
- 따라서 본 연구결과 항산화 기능 보유 샘플은 전형적인 산성 다당체의 구성들인 L-arabinise,D-galactose, L-rhamnose, D-galacturonic acid, D-gluconic acid, D-galactosyl 등 잔기들이glycosidic bond로 고분자들로 구성 되었다는 전 연구결과들과 일치한다[22]. 계속해서 샘플 산성 다당체의 화학결합 구조를 분석하기 위해서 NMR를 사용하였다. NMR 데이터는 산성다당체를 분리할 때 용리액으로서 증류수를 사용하여 dialysis한 것을 측정한 것을 Fig.
- 본 실험에서 홍삼박(red ginseng marc, RGM)은 주식회사 하농(경기도 고양 소재)에서 구입하여 사용하였다. 다당체 함량 측정에 사용한 시약으로서 butanol, ethanol, methanol, propanol, acetone(Sigma Chemical Co., Louis, MO, USA)을 사용하였다. 기타 실험에 사용된 시약은 모두 특급시약을 사용하였다.
- 본 실험에서 홍삼박(red ginseng marc, RGM)은 주식회사 하농(경기도 고양 소재)에서 구입하여 사용하였다. 다당체 함량 측정에 사용한 시약으로서 butanol, ethanol, methanol, propanol, acetone(Sigma Chemical Co.
- 0 M NaCl 순서로 수행하였다. 분획 샘플은 자동분획기 Retriever 500(Teledyne ISCO, USA)를 사용하였으며, 시험관에 용출액은 5 mL 씩 수집하였다. 각각의 용출액의 다당체를 측정하고 항산화 활성을 측정 하였다.
성능/효과
- DPPH 라디칼 소거능은 phenolic acids, 플라보노이드 및 기타 페놀성 화합물에 의한 항산화 작용이며, 이런 물질의 환원력이 클수록 DPPH 라디칼 소거활성이 크다고 하였다[19]. 3개의 분획물의 DPPH 라디칼 소거능력을 비교 분석한 결과, 증류수(A)에서 67.70%, 0.1 M NaCl(B)에서 19.48%, 0.5 M NaCl(C)에서 32.29%가 나타난 것을 Fig. 5에서 보여준다. 본 연구에서는 라디칼 소거능의 범위는 19.
- 또한, FT-IR 스펙트럼에서 약 1,636 cm⁻¹ (비대칭 COO- 신축 진동) 및 1,343 cm⁻¹ (대칭 COO- 신축 진동)에서의 카르복실기의 흡수 밴드가 가장 두드러졌다. 따라서 본 연구결과 항산화 기능 보유 샘플은 전형적인 산성 다당체의 구성들인 L-arabinise,D-galactose, L-rhamnose, D-galacturonic acid, D-gluconic acid, D-galactosyl 등 잔기들이glycosidic bond로 고분자들로 구성 되었다는 전 연구결과들과 일치한다[22]. 계속해서 샘플 산성 다당체의 화학결합 구조를 분석하기 위해서 NMR를 사용하였다.
- 본 연구에서는 라디칼 소거능의 범위는 19.48 ∼ 67.70%이고, 세 개의 피크 중 용출된다당체 최대 예측 DPPH 라디칼 소거능이 67.70%로 증류수(A)에서 항산화능이 가장 높게 측정되었다.
- 본 연구에서의 라디칼 소거능 범위가 19.48 ∼ 67.70%이고, 세 개의 피크 중 용출된 다당체 최대 예측 DPPH 라디칼 소거능이 67.70%로 증류수에서의 항산화능이 가장 높게 측정되었다.
- 분석한 결과 크로마토그램(Fig. 6)은 탄수화물의 전형적인 O-H 신축진동은 3,294 cm⁻¹에서 나타나고 포화된 C-H는 2,932 cm⁻¹에서 나타났다 1,018 cm⁻¹에서 상대적으로 강한 C=O의 흡수피크가 나타나는데, 1149 cm⁻¹에서 C-O-C 결합과glycosidic 결합이 전형적인 다당류의 흡수 패턴을 보여주었다[20,21].
- 3에서 보여 준다. 산성다당체의 수율은 홍삼박 농도가 증가함에 따라서 추출된 산성다당체의 양은 증가하였으나 수율은 감소하였다. 홍삼박 샘플양이 1 ∼ 20% 까지 증가하였을 때 산성다당체의 양은 8.
- 용매 methanol 과 propanol에 의한 수율은 약 10 ∼ 12%로 유사하였고 acetone과 butanol의 경우에는 용매의 층분리 및 다당체의 침전이 일어나지 않은 것으로 나타났다.
- 70%로 증류수에서의 항산화능이 가장 높게 측정되었다. 이로써 정제된 파우더를 가지고 FT-IR과 NMR을 측정하여 산성다당체의 화학결합에 의한 특정 작용기와 glycosidic 결합이 존재함을 확인하였다.
- 이온교환수지 컬럼을 사용하여 산성다당체를 분리하였을 때 3가지 피크가 나타났고, 각각의 피크에 나온 용액을 모아 dialysis membrane을 사용하여 정제하였다. 정제 후 산성다당체의 항산화능을 측정하였을 때, 증류수에서 67.70%, 0.1 M NaCl에서 19.48%, 0.5 M NaCl에서 32.29%가 나타났다. 본 연구에서의 라디칼 소거능 범위가 19.
- 홍삼박으로부터 용매 종류에 따른 산성다당체의 추출량을 정량하기 위하여 펙틴을 대표물질로 하여 표준 곡선을 정하고 다당체의 양에 따른 흡광도를 측정하여 평가를 하였다[14,15]. 표준곡선식에 따라 평가된 산성다당체 추출은 Fig. 2에서 나타내었고 alcohol를 용매로 사용 하였을 때 평균 16.64% 로 가장 높았다. 용매 methanol 과 propanol에 의한 수율은 약 10 ∼ 12%로 유사하였고 acetone과 butanol의 경우에는 용매의 층분리 및 다당체의 침전이 일어나지 않은 것으로 나타났다.
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