[논문]Real-time PCR과 Colony forming unit법을 이용한 타액 내 2종의 구강미생물 총량분석

유수민; 정성국; 유현준; 장종화

doi:10.13065/jksdh.2017.17.01.13

Real-time PCR과 Colony forming unit법을 이용한 타액 내 2종의 구강미생물 총량분석
Analysis of total oral microorganisms in saliva using real-time PCR and colony forming unit 원문보기

JKSDH : Journal of Korean Society of Dental Hygiene = 한국치위생학회지, v.17 no.1, 2017년, pp.13 - 25

유수민 (경동대학교 치위생학과) , 정성국 (조선대학교 치과대학 예방치과교실) , 유현준 (단국대학교 치과대학 예방치과교실) , 장종화 (한서대학교 치위생학과)

Abstract ▼ AI-Helper

Objectives: The purpose of this study was to compare colony forming unit (CFU) method and multiplex real-time polymerase chain reaction (MRT-PCR) method for accurate quantitative analysis of bacteria. Methods: We compared the CFU method and the MRT-PCR method, which are still used in Korea, for Prevotella intermedius (P. intermedius), a periodontal disease pathogen selected by MRT-PCR, and Streptococcus mutans (S. mutans), a dental caries causative organism. The subjects of this study were 30 patients who visited the C dental hospital. Results: Total microorganisms in MRT-PCR method were significantly higher in both types of bacteria (p<0.05), since DNA of dead bacteria was also analyzed. This was because the periodontal dise(-) anaerobes, and even dead bacteria contain large amounts of toxic substances called LPS in the extracellular membrane, and fimbriae and pili, which are motility structures, still remain as a strong toxic substance in periodontal tissue. Conclusions: Therefore, in terms of the total amount of bacteria found, the MRT-PCR method will be a useful technique for searching all the bacteria in the oral cavity including live bacteria, as well as sterilization.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

문제 정의

본 연구의 목적은 선행 연구를 기반으로 다종의 치주질환 원인 균을 짧은 시간에 분석 가능한 MRT-PCR법의 구강미생물 정량분석에 대한 정확성을 확인하기 위함이다. 이를 위해 선택배지가 정형화된 치주질환 원인균인 P.

제안 방법

최근 기술 향상으로 한번에 여러 종의 세균을 분석할 수 있는 MRT-PCR이 개발되었기에 본 연구에서는 선택배지가 정형화된 치주질환 원인균인 P. intermedia과 치아우식 원인균인 S. mutans를 대상으로 국내에서 아직까지 통용되는 CFU법과 MRT-PCR법을 비교분석하였다. 연구 결과, 두 종류의 세균 모두 MRT-PCR법이 유의하게 높게 분석되었는데, 이는 죽은 세균의 DNA까지 분석되기 때문이었다.

대상 데이터

2016년 9월 20일에서 10월 18일까지 치주질환 관련 진료를 위해 C대학교 치과병원 치주과에 내원한 20세에서 65세 사이의 환자 30명을 대상자로 정하였으며 평균 연령은 44세이었다. 표본 수는 G*power 3.
치과전문의 1인과 치과위생사로 구성된 검체 수집 팀은 모든 연구대상자를 대상으로 치아 위치 별로 치주질환 정도를 조사했으며, 전신질환 등을 포함하여 임상증례서에 기록하였다. 연구대상자에게는 개인 위생관리 내용 등의 편차나 하루 일과 중의 오차 등을 최소화하기 위해 오전 11시에 일괄적으로 20 ml의 멸균된 증류수로 30초간 강하게 가글하고, 이를 50 ml conical tube에 뱉도록 하여 타액을 채취하여 급속 냉동보관하여 시료로 사용하였다. 이때 균들의 환경적 변화요소로 인한 균의 변화나 변수를 최소화하기 위해 검체 수집 후 준비된 선택배지에 균 심기와 MRT-PCR로 즉시 분석하였다.

데이터처리

, Armonk, NY, USA)을 이용하여 수집된 자료의 빈도와 평균 및 표준편차를 구하였다. 성별과 연령별MRT-PCR에 의한 치은염지수의 차이를 Independent t-test와 One way ANOVA 분석을 시행하였고, CPU법과 MRT-PCR법에 의한 전체 세균 량 비교는 Independent t-test로 분석하였다. 유의수준은 α=0.

성능/효과

이러한 PCR법에 의한 미생물 총량의 정보는 CFU법에 의한 군집 수를 배제한다면, 구강 내 사멸 균의 총량을 확인할 수 있는 방법으로도 사용 가능하다. 구강 내 사멸 균 정량도 중요한 까닭은 치주질환 유발 균은 특성상 혐기성세균으로서 자신의 세포외막에 강력한 독성물질인 지질다당체(lipopolysaccharide, LPS)로 둘러 쌓여 있으며, fimbriata 등 이들 세포의 부속물질들도 치주조직에 박히거나 염증물질을 방출하여 치주질환을 발생시키는데 살아있는 균만큼의 독성을 유지하기 때문이다[25]. 따라서 사멸균일지라도 구강질환에서 특히 치주질환을 예방하기 위해서는 적당한 구강관리를 통하여 구강 내 살아있는 균의 억제뿐 아니라 사멸 균도 최소화해야 한다.
mutans를 대상으로 국내에서 아직까지 통용되는 CFU법과 MRT-PCR법을 비교분석하였다. 연구 결과, 두 종류의 세균 모두 MRT-PCR법이 유의하게 높게 분석되었는데, 이는 죽은 세균의 DNA까지 분석되기 때문이었다. 따라서 MRT-PCR법에 의한 세균 총량방법은 구강 내 모든 균들을 대상으로 살아있는 균뿐아니라 사멸 균까지 탐색할 수 있는 기술로서 임상적으로 매우 유용한 미생물 총량법이 될 것이다.

후속연구

연구 결과, 두 종류의 세균 모두 MRT-PCR법이 유의하게 높게 분석되었는데, 이는 죽은 세균의 DNA까지 분석되기 때문이었다. 따라서 MRT-PCR법에 의한 세균 총량방법은 구강 내 모든 균들을 대상으로 살아있는 균뿐아니라 사멸 균까지 탐색할 수 있는 기술로서 임상적으로 매우 유용한 미생물 총량법이 될 것이다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	치주질환이란?	치주질환은 치주조직의 염증과 구조의 소실을 야기시키는 질환으로 다양한 전신적 및 국소적 요인들에 의하여 발병되며, 주원인은 치면세균막 내 혐기성 세균이다. Sastri [1]는 치면세균막 내에 약 400여 세균 종들이 존재한다고 보고하였고, 현재는 특정 치주질환과 관련된 구강 내 병원성 세균간의 역학관계 및 치주질환 병소에 호발하는 세균의 분포양상에 관한 연구들이 활발히 이루어지고 있다.
	단위부피당 형성된 집락 수를 측정하는 방법의 한계점은?	단위부피당 형성된 집락 수(colony forming unit, CFU)를 측정하는 방법으로 치주질환 병소부위에 존재하는 원인균을 탐색하였으나 치주질환 여부와 관계없이 원인균이 발견되지 않는 경우도 있었다. 더욱이 CFU법은 특정 목표 균을 찾거나 배양하기 위해 선택적 배지를 만들어야 하는데, 아직까지 구강 내 일부 균들에 대한 선택배지만이 정량 및 정성적으로 확인하도록 확립되었을 뿐이다[5,6].
	PCR방법의 장점은?	따라서 1990년대 중반부터는 분자생물학의 발전으로 25-100개의 세균만 있어도 검출이 가능한 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)이 사용되고 있다[7]. PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8]. 타액을 대상으로 PCR분석을 할 경우 타액 내에 들어있는 화합물들이 PCR 증폭에 영향을 주어 우려도 있지만[9,10], 그러한 요인을 제거하는 Chelex 100을 이용한 깨끗한 DNA를 추출하는 방법 등으로 구강 내 타액의 복잡한 환경에 의해 분석이 용이하지 못한 부분을 해소하고 있다[11].

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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