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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 요양보호시설을 이용하고 있는 만 65세 이상 노인 중 치매가 있는 노인과치매가 없는 노인을 대상으로 구강 내 미생물의 발현을 확인하고 정량적인 분석을 통하여 생물학적근거를 제시하고, 치매 노인을 대상으로 하는 체계적인 구강질환 예방관리의 필요성을 확인하여 구강건강 관리자 역할의 중요성 인식 및 효과성 입증을 위한 추후 연구에 필요한 기초자료를 제공하고자 한다.
- 최근에는 자연치 상실 등의 구강건강 상태와 치매의 관련성을 밝히고자 하는 연구가 발표되고 있으며[21], 노년기 치아 상실의 주요 원인이 되는 만성적인 치주염은 치아의 지지조직에서 염증을 유발하는 구강 미생물 감염에 의한 것이라고 알려져 왔다[22]. 따라서 치매 노인의 구강건강 상태에 대한 생물학적 근거로써 구강 병원성 미생물의 분포를 파악하여 이와 관련된 특성을 규명하고 노인성 질환의 예방관리에 있어서 구강질환 예방관리의 중요성을 인식하고 체계화된 구강관리의 프로그램 운영의 필요성을 제시하는데 필요한 기초적인 자료를 제공하고자 총 130명의 구강 병원성 미생물 분포를 조사하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
- Cycle threshold (Ct)는 알려진 숫자의 DNA농도의 대수기에서 시작하며, 세균 수에 대한 표준곡선(standard curve)에 의해서 시료 당 세균수가 측정되었다. 본 논문에서는 단위가 큰 수치를 간략하게 표현하여 차이를 비교하기 용이하도록 자연로그 함수로 전환한 값으로 제시하였다.
- 본 연구는 요양보호시설을 이용하고 있는 치매 노인의 구강 내 구강 병원성 미생물 분포를 조사하여 노인성 질환의 예방관리에 있어서 구강질환 예방관리의 중요성을 파악하고자 시행하였다. IRB승인 후 2015년 8월 11일부터 2015년 10월 11일까지 부산・경남지역 일부 요양보호시설 만 65세이상 치매 노인과 노인복지시설을 이용 중인 치매가 없는 노인에게 구강검진 및 치은열구액을 채취하여 유전자분석전문기관에서 실시간 다중연쇄 효소중합 반응 기법으로 최종 130명에게 구강 병원성 미생물의 정량적인 분석을 실시하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
제안 방법
- Real-time PCR 반응 용액은 추출한 total DNA 2 ul와 각각의 primer set 10 pmol, probe와 완충용액, 1unit Hot-start Taq DNA polymerase(GeneAll, Korea)을 혼합하여 총 20 ㎕가 되도록 제조하였다. 96 well plate에 분주 후 ABI 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, LifeTechnologies, USA)을 이용하여 정량분석을 시행하였다. 이 때 사용한 Real-time PCR의 조건은 최초 변성을 위해 95°C에서 15분간, 이후 45번의 cycle은 95°C에서 15초, 55°C에서 15초, 72°C에서20초간 시행하였다.
- Exgene Clinic SV mini Kit (GeneAll, Korea)를 이용하여 제조회사의 지시에 따라 구강미생물의 DNA를 추출하였다. 시료 200 ㎕를 1.
- 본 연구는 요양보호시설을 이용하고 있는 치매 노인의 구강 내 구강 병원성 미생물 분포를 조사하여 노인성 질환의 예방관리에 있어서 구강질환 예방관리의 중요성을 파악하고자 시행하였다. IRB승인 후 2015년 8월 11일부터 2015년 10월 11일까지 부산・경남지역 일부 요양보호시설 만 65세이상 치매 노인과 노인복지시설을 이용 중인 치매가 없는 노인에게 구강검진 및 치은열구액을 채취하여 유전자분석전문기관에서 실시간 다중연쇄 효소중합 반응 기법으로 최종 130명에게 구강 병원성 미생물의 정량적인 분석을 실시하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- Real-time PCR 반응 용액은 추출한 total DNA 2 ul와 각각의 primer set 10 pmol, probe와 완충용액, 1unit Hot-start Taq DNA polymerase(GeneAll, Korea)을 혼합하여 총 20 ㎕가 되도록 제조하였다. 96 well plate에 분주 후 ABI 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, LifeTechnologies, USA)을 이용하여 정량분석을 시행하였다.
- 구강미생물의 정량분석을 위하여 Cytoperio analysis system (Microis, Korea)를 이용하여 구강 내 존재하는 전체 미생물의 검출을 위해서는 16s rDNA 단편을 증폭하였고, 각각의 미생물 검출을 위해서는 functional gene (rgpB, waaA, gtf)으로부터specific primer를 제작하여 약 200 bp 내외의DNA 단편을 각각 증폭하였다. Real-time PCR에 사용된 probe들은 서로 간섭을 고려하여 파장이 겹치지 않는 3종을 선택하였고, 각 반응에서 분석 대상 균종들 중 3종씩 묶어서 네 종류의 pannel으로 구성하였다[Table 1].
- 구강미생물의 정량분석을 위하여 Cytoperio analysis system (Microis, Korea)를 이용하여 구강 내 존재하는 전체 미생물의 검출을 위해서는 16s rDNA 단편을 증폭하였고, 각각의 미생물 검출을 위해서는 functional gene (rgpB, waaA, gtf)으로부터specific primer를 제작하여 약 200 bp 내외의DNA 단편을 각각 증폭하였다. Real-time PCR에 사용된 probe들은 서로 간섭을 고려하여 파장이 겹치지 않는 3종을 선택하였고, 각 반응에서 분석 대상 균종들 중 3종씩 묶어서 네 종류의 pannel으로 구성하였다[Table 1].
- 자료조사 전 연구의 목적과 방법, 연구 참여에 대한 익명성 보장, 자발적인 연구 참여, 동의와 거부. 발생 가능한 이익과 불이익을 포함하는 내용을 구두와 서면으로 설명하고 동의를 구하였으며, 치매 노인의 경우 인지장애로 인한 의사결정력의 결여를 고려하여 법적대리인의 동의를 받도록 하였다. 오전 10시~12시 사이의 동일한 시간에 방문하여 환자의 성별과 연령, 전신질환에 관한 설문조사를 한 다음 치은열구액을 채취하여 DNA를 추출하고 다중연쇄 효소중합 반응 기법(Multiplex real-time polymerase chain reaction: Real-time PCR)을 이용하여 자료를 수집하였다.
- 발생 가능한 이익과 불이익을 포함하는 내용을 구두와 서면으로 설명하고 동의를 구하였으며, 치매 노인의 경우 인지장애로 인한 의사결정력의 결여를 고려하여 법적대리인의 동의를 받도록 하였다. 오전 10시~12시 사이의 동일한 시간에 방문하여 환자의 성별과 연령, 전신질환에 관한 설문조사를 한 다음 치은열구액을 채취하여 DNA를 추출하고 다중연쇄 효소중합 반응 기법(Multiplex real-time polymerase chain reaction: Real-time PCR)을 이용하여 자료를 수집하였다.
- 이 때 사용한 Real-time PCR의 조건은 최초 변성을 위해 95°C에서 15분간, 이후 45번의 cycle은 95°C에서 15초, 55°C에서 15초, 72°C에서20초간 시행하였다.
대상 데이터
- 6으로 표본 크기가 치매군 61명, 비치매군 61명으로 총 122명이면 가능한 조건임을 확인하였다. 따라서 2015년 8월 11일부터 2015년 10월 11일까지 경남지역 요양원 1곳과 부산지역 요양병원 3곳의 치매진단을 받은 치매 노인과 노인복지시설 4곳을 이용하고 있는 치매가 없는 만 65세 이상 노인 153명에게 조사를 진행하였다. 이 중에서 연구조건에 부합하지 않는 23명을 제외하고 치매가 있는 노인 60명과 치매가 없는 노인 70명의 총 130명을 최종 분석대상으로 하였다.
- 따라서 2015년 8월 11일부터 2015년 10월 11일까지 경남지역 요양원 1곳과 부산지역 요양병원 3곳의 치매진단을 받은 치매 노인과 노인복지시설 4곳을 이용하고 있는 치매가 없는 만 65세 이상 노인 153명에게 조사를 진행하였다. 이 중에서 연구조건에 부합하지 않는 23명을 제외하고 치매가 있는 노인 60명과 치매가 없는 노인 70명의 총 130명을 최종 분석대상으로 하였다.
- 치주질환 원인균의 DNA는 구강 내 치아 중 전치부 1개, 구치부 1개 협∙설측 또는 순∙설측 치아부위에서 멸균된 근관치료용 paper point (#90번 2개와 #30번 2개, Sure-endoⓇ, Sure Dent Co.,Korea) 4개를 이용하여 치은열구에 10초간 삽입하여 표본을 획득하였다. Paper point는 제거한 즉시 phosphate buffered saline (PBS, Gibco BRL, Life Technologies, Grand Islnad, NY, USA) 1 ㎕가 담긴 1.
데이터처리
- 그리고 각 구강 병원성 미생물 간의 상관관계를 파악하기 위하여 피어슨의 상관관계(Pearson’s correlation) 분석을 실시하였다.
- 05로 하였다. 치매가 있는 노인과 치매가 없는 노인의 일반적 특성에 대한 빈도분석, 일반적인 특성에 따른 구강 병원성 미생물 분포의 차이를 검정하기위하여 t-검정(t-test)을 실시하였다. 그리고 각 구강 병원성 미생물 간의 상관관계를 파악하기 위하여 피어슨의 상관관계(Pearson’s correlation) 분석을 실시하였다.
이론/모형
- 표준곡선(Standard curve)은 한국생명공학연구원 미생물자원센터(KCTC, Korea)와 AmericanType Culture Collection (ATCC, USA)에서 분양받은 표준균주의 real-time PCR 분석 전에 이미 알고 있는 DNA 정보의 값을 이용하여 Real-time PCR 분석 후에 그 결과 값이 분석 전 입력 값에 대비하여 표준곡선이 그려진다. Real-time PCR 분석에서 정량을 위한 표준곡선은 순수 배양한 미생물에서 Clinic SV mini Kit (GeneAll, Korea)를 사용하여 genomic DNA를 추출한 다음, 정량 분석에서 사용한 똑같은 조건의 real-time PCR에 사용하였다. 이때 genomic DNA를 105에서100copies까지 10배수로 희석하여 표준곡선을 만드는데 template DNA로 사용하였다.
성능/효과
- 1. 70~79세, 여성 치매군은 치매가 없는 군보다 만성치주염 원인균 T. denticola의 분포가 높았다.
- 2. 80세 이상, 여성 치매군은 치매가 없는 군보다 치아우식증 원인균 S. mutans의 분포가 높았다.
- 3. Red Complex의 P. gingivalis와 T. forsythensis는 서로 상관관계가 있었고, Orange Complex의P. intermedia, F.
- Green Complex의 E. corrodens는 F. nucleatum(r=0.213, p<0.05)와 정(+)적인 상관관계가 있었다.
- Orange Complex의 P. intermedia는 Red Complex의 P. gingivalis (r=0.357, p<0.05), T.forsythensis (r=0.396, p<0.01), T. denticola (r=0.290, p<0.05)와 정(+)적인 상관관계가 있었고, F.nucleatum는 P. gingivalis (r=0.472, p<0.01), T. forsythensis (r=0.316, p<0.01), T. denticola(r=0.399, p<0.01), P. intermedia (r=0.373, p<0.01)와 정(+)적인 상관관계가 있었다.
- P. micra는 T.forsythensis (r=0.271, p<0.05), T. denticola (r=0.360, p<0.01), F. nucleatum (r=0.457, p<0.01)와정(+)적인 상관관계가 있었고, C. rectus는 T. forsythensis (r=0.442 p<0.01), F. nucleatum(r=0.267, p<0.05)와 정(+)적인 상관관계가 있었다.
- Red Complex의 P. gingivalis와 T. forsythensis (r=0.701, p<0.01)는 정(+)적인 상관관계가 있었다.
- S. mutans는 S. sobrinus (r=0.682, p<0.01)와 정(+)적인 상관관계가 있으며, 전체 미생물의 수치는 A. actinomycetemcomitans를 제외한 모든 구강 병원성 미생물과 정(+)적인 상관관계가 있으며 F. nucleatum (r=0.703, p<0.01)과 상관관계가 있었다(p<0.05)[Table 6].
- intermedia, F. nucleatum은 Red Complex의 P. gingivalis, T. forsythensis, T. denticola와 상관관계가 있었다(p<0.05).
- forsythensis는 서로 상관관계가 있었고, Orange Complex의P. intermedia, F. nucleatum은 Red Complex의 P. gingivalis, T. forsythensis, T. denticola와 상관관계가 있었다. 또한, P.
- 4%이었다. 그리고 85세 이상 치매노인의 영구치 우식유병률은 40.0%로 비치매 노인의 44.4%보다 낮지만, 우식영구치면 지수는 치매노인이 2.92면으로 비치매 노인의 1.31면보다 높은 것을 확인하였다. 이것은 영구치 우식유병률은 낮지만 치아 우식증의 심각성은 더 크다고 해석할 수 있으므로 자가 구강관리가 힘든 치매 노인의 경우 더욱 취약한 구강환경에 노출된 것으로 보인다.
- 8% 순으로 나타났다. 따라서 만 65세 이상 노인 인구에서 가장 흔한 전신질환은 고혈압이며 치매 환자에서는 뇌혈관 질환과 심혈관 질환의 비율이 상대적으로 높음을 확인할 수 있었다. 최근에는 만성적 국소감염증인 치주병이 심혈관계 질환과 당뇨와 같은 전신적 질환이나 그 이상의 잠재적 위험 요인이 될 수 있다는 연구 결과[15]가 보고되면서 치주질환에 대한 관심이 증대되고 있다.
- 또한, P. micra와 C. rectus는 T. forsythensis와 T. denticola, F. nucleatum과 E. corrodens는 F. nucleatum와 상관관계가 있음을 확인하였다(p<0.05).
- denticola와 상관관계가 있었다. 또한, P. micra와 C. rectus는 T. forsythensis와 T. denticola, F. nucleatum과 E.corrodens는 F. nucleatum와 상관관계가 있음을 확인하였다.
- 이것은 인지기능 장애와 거동 불편 등의 이유와 법적 대리인의 동의를 구해야 하는 연구 절차로 인해 대상자 확보에 어려움이 많은 연구조건임에도 불구하고 적절한 표본 수로 조사가 이루어졌기에 그 의미가 크다. 또한, 치매 여부에 따른 구강 병원성 미생물의정량적 분석 결과로 시설을 이용하고 있는 치매 노인에 대한 구강관리 중요성을 다시 한 번 인식할수 있었으며, 요양보호시설을 이용하고 있는 치매 노인의 구강건강 관리를 위한 전문적인 인력 배치의 필요성을 확인하였다. 향후 균주의 발현 과정에 영향을 미치는 원인 및 뇌의 인지기능과 관련성을 규명하는 연구와 치매 노인을 대상으로 치주질환 예방 및 조절을 위한 다양한 중재방법을 적용하여 효과성을 입증하는 후속연구가 지속적으로 수행되어야 할 것이다.
- 본 연구의 결과에서 한 가지 전신질환을 가진 경우보다 복합적인 전신질환을 가진 치매군에서Orange complex의 F. nucleatum이 치매가 없는 대조군보다 높게 나타났지만 유의성은 확인할 수 없었다. Stein 등[24]이 알츠하이머에 대한 잠재적 위험 인자로 치주질환에서 만성 염증으로 인식되었다는 결과와 같은 치매 노인의 전신질환과 치주질환 원인균에 관한 추가적인 연구의 필요성을 확인하였다.
- 본 연구의 분석 결과 치매 노인은 치주질환 및 치아우식증에 노출되어 구강환경이 더욱 취약하다고 할 수 있다. 이를 개선하기 위해서 요양보호시설 종사자에게 노인성 질환의 예방관리에 있어서 구강건강 관리의 중요성을 인식시킬 수 있는 교육기회를 제공하고, 요양보호시설에 구강건강 관리 전문 인력인 치과위생사의 의무적인 배치 등의 방안이 필요하다.
-
1. 연구대상
연구목적에 필요한 적정한 표본 수를 산출하기 위하여 G-power3.1.3 프로그램에서 신뢰 수준95%, 효과 크기 0.6으로 표본 크기가 치매군 61명, 비치매군 61명으로 총 122명이면 가능한 조건임을 확인하였다. 따라서 2015년 8월 11일부터 2015년 10월 11일까지 경남지역 요양원 1곳과 부산지역 요양병원 3곳의 치매진단을 받은 치매 노인과 노인복지시설 4곳을 이용하고 있는 치매가 없는 만 65세 이상 노인 153명에게 조사를 진행하였다.
- 전신질환의 경우 치매군은 고혈압이 34.7%, 뇌혈관 질환이 28.6%, 당뇨병이 18.3%, 심혈관 질환이 10.2% 순으로 나타났고 치매가 없는 군은 고혈압이 41.1%, 당뇨병이 26.0%, 뇌혈관 질환이15.1%, 심혈관 질환이 6.8% 순으로 나타났다. 따라서 만 65세 이상 노인 인구에서 가장 흔한 전신질환은 고혈압이며 치매 환자에서는 뇌혈관 질환과 심혈관 질환의 비율이 상대적으로 높음을 확인할 수 있었다.
- 4%이었다. 치매군은 고혈압이 34.7%, 뇌혈관질환이 28.6%, 당뇨병이 18.3%, 심혈관 질환이 10.2%였으며 치매가 없는 군은고혈압이 41.1%, 당뇨병이 26.0%, 뇌혈관질환이 15.1%, 심혈관 질환이 6.8%였다[Table 2].
- 05). 치매유무에 따른 치주질환 원인균의 양에는 유의한 차이가 없었지만 치주질환 원인균이 서로 상관성을 가지고 공존하고 있음을 발견하였다. 추후 노인의 정확한 치주건강 상태를 평가함에 있어 Real-time PCR을 이용한 치주질환 원인균의 주기적인 정성 및 정량적 검사가 도움이 되리라 사료된다.
후속연구
- 이와 같이 구강 내 세균은 세균성 심내막염[12], 폐렴[13], 저체중 신생아[14], 심혈관 질환[15] 등의 전신질환을 일으키는 요인이 된다는 점이 보고되었다. 결과적으로 구강 내의 질병뿐만 아니라 앞에 열거한 전신질환을 효과적으로 진단하고, 미리 예방할 기회를 제공하기 위해 구강 내 미생물의 구성을 확인하고 이를 정량화하는 것이 우선적으로 필요하다.
- 향후 균주의 발현 과정에 영향을 미치는 원인 및 뇌의 인지기능과 관련성을 규명하는 연구와 치매 노인을 대상으로 치주질환 예방 및 조절을 위한 다양한 중재방법을 적용하여 효과성을 입증하는 후속연구가 지속적으로 수행되어야 할 것이다. 그리고 치매 노인의 구강관리 의료체계를 구축하여 구강건강증진을 유도할 수 있도록 노력해야 할 것이다.
- nucleatum은 복합 전신질환을 가진 치매군에서 높게 나타난 것은 치매로 인한 구강관리의 어려움과 복합적인 질환을 가진 경우 많은 약물을 복용하고 있을 가능성이 있으므로 구강 건조증, 구취 등의 구강 내 미생물들이 서식하기 좋은 환경을 갖고 있다고 볼 수 있다. 따라서 구강건조증과 구취 등의 조건을 조사하여 관련성을 규명하는 후속연구가 이루어져야 할 것이다.
- 이를 개선하기 위해서 요양보호시설 종사자에게 노인성 질환의 예방관리에 있어서 구강건강 관리의 중요성을 인식시킬 수 있는 교육기회를 제공하고, 요양보호시설에 구강건강 관리 전문 인력인 치과위생사의 의무적인 배치 등의 방안이 필요하다. 또한, 특정 균종이 발현되는 특성을 파악하여 이에 대한 예방관리의 효과성 입증할 수 있는 폭넓은 추가적인 연구가 필요하다.
- denticola는 일상생활을 혼자서 수행하기 어려운 치매 노인의 경우 만성적인 치주염에 더욱 많이 노출되어 있다는 결과로 해석할 수 있으며 요양보호시설 종사자의 도움 없이 자가 구강관리가 힘든 치매 노인의 경우 요양보호시설 인력의 도움이 절실히 요구되는 상황이라고 할 수 있다. 또한, 특히 많이 분포된 균주의 발현 과정에 영향을 미치는 원인 규명, 뇌의 인지기능과 관련성 규명 및 치주질환 예방관리의 효과성을 검정하는 연구 등 만성적인 치주조직 염증의 감소를 위한 추가적인 후속연구가 필요하다고 생각된다.
- 본 연구는 치매 외 치주질환에 영향을 미칠 수 있는 전신질환, 흡연여부, 치주건강 상태, 구강관리습관, 저작기능 등의 다양한 변수를 고려하지 못하였기에 치매의 영향이라는 결과로 단정 짖기에는 제한점이 따른다. 이러한 한계점에도 불구하고 연구에 적정 표본수 산출을 위한 G-power3.
- Stein 등[24]이 알츠하이머에 대한 잠재적 위험 인자로 치주질환에서 만성 염증으로 인식되었다는 결과와 같은 치매 노인의 전신질환과 치주질환 원인균에 관한 추가적인 연구의 필요성을 확인하였다. 본 연구에서는 특정 전신질환과 치주질환 원인균과의 관련성은 파악하지 못하였고, 질병의 심각도 등은 고려하지 못하였으므로 추후 연구에서는 질환 종류별 집단을 확보하여 관련성을 규명이 이루어져야 할 것이다.
- 치매유무에 따른 치주질환 원인균의 양에는 유의한 차이가 없었지만 치주질환 원인균이 서로 상관성을 가지고 공존하고 있음을 발견하였다. 추후 노인의 정확한 치주건강 상태를 평가함에 있어 Real-time PCR을 이용한 치주질환 원인균의 주기적인 정성 및 정량적 검사가 도움이 되리라 사료된다.
- 또한, 치매 여부에 따른 구강 병원성 미생물의정량적 분석 결과로 시설을 이용하고 있는 치매 노인에 대한 구강관리 중요성을 다시 한 번 인식할수 있었으며, 요양보호시설을 이용하고 있는 치매 노인의 구강건강 관리를 위한 전문적인 인력 배치의 필요성을 확인하였다. 향후 균주의 발현 과정에 영향을 미치는 원인 및 뇌의 인지기능과 관련성을 규명하는 연구와 치매 노인을 대상으로 치주질환 예방 및 조절을 위한 다양한 중재방법을 적용하여 효과성을 입증하는 후속연구가 지속적으로 수행되어야 할 것이다. 그리고 치매 노인의 구강관리 의료체계를 구축하여 구강건강증진을 유도할 수 있도록 노력해야 할 것이다.
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