휴면아 경정 배양법을 통한 포도 '거봉' 에서 Grapevine fleck virus의 제거 Elimination of Grapevine fleck virus from infected grapevines 'Kyoho' through meristem-tip culture of dormant buds원문보기
본 연구진은 세계 최초로 GFkV에 단독 감염된 포도 품종 거봉의 휴면아로부터 직접 경정 분열조직을 절취하여 배양함으로써 별도의 열처리나 화학처리 없이 GFkV가 제거된 신초 재생에 성공하였다. GFkV는 포도 식물체의 체관에만 한정적으로 존재하고 접목으로 감염되는 포도 바이러스이다. 경정조직은 $4^{\circ}C$에서 일정기간 저장된 1년생 경화가지의 휴면아로부터 0.3 mm (73 절편체)와 0.8 mm (5절편체)를 절취하였는데, 절취 부위는 생장점(apical meristem)을 포함하여 2 ~ 5개의 엽원기(leaf primordia)와 미분화 원기(uncommitted primordia) 1 ~ 4개를 포함하였다. 절취된 경정조직을 BA 3.0 mg/L와 IBA 0.1 mg/L가 혼합된 배지에 16주간 배양한 결과, 0.3 mm와 0.8 mm의 경정조직에서 각각 4.1%와 40.0%의 신초 재생률이 관찰되었고, 재생된 신초에서의 바이러스 제거율(재생된 신초수에 대한 RT-PCR negative 신초수의 백분율)은 0.3 mm의 경정조직에서는 100%를, 0.8 mm에서는 50%를 나타내었다. 신초를 증식시킨 후 감염바이러스를 다시 진단한 결과, 신초가 처음 재생되었을 때의 진단결과와 동일하였다. 휴면아로부터 분열조직을 배양하여 바이러스가 제거된 신초를 확보한 예는 세계적으로 보고된 바가 없는 것으로서, 본 연구진의 새로운 바이러스 제거방법은 향후 포도 뿐만 아니라 과수를 포함한 낙엽성 수목의 무병묘 생산에 매우 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
본 연구진은 세계 최초로 GFkV에 단독 감염된 포도 품종 거봉의 휴면아로부터 직접 경정 분열조직을 절취하여 배양함으로써 별도의 열처리나 화학처리 없이 GFkV가 제거된 신초 재생에 성공하였다. GFkV는 포도 식물체의 체관에만 한정적으로 존재하고 접목으로 감염되는 포도 바이러스이다. 경정조직은 $4^{\circ}C$에서 일정기간 저장된 1년생 경화가지의 휴면아로부터 0.3 mm (73 절편체)와 0.8 mm (5절편체)를 절취하였는데, 절취 부위는 생장점(apical meristem)을 포함하여 2 ~ 5개의 엽원기(leaf primordia)와 미분화 원기(uncommitted primordia) 1 ~ 4개를 포함하였다. 절취된 경정조직을 BA 3.0 mg/L와 IBA 0.1 mg/L가 혼합된 배지에 16주간 배양한 결과, 0.3 mm와 0.8 mm의 경정조직에서 각각 4.1%와 40.0%의 신초 재생률이 관찰되었고, 재생된 신초에서의 바이러스 제거율(재생된 신초수에 대한 RT-PCR negative 신초수의 백분율)은 0.3 mm의 경정조직에서는 100%를, 0.8 mm에서는 50%를 나타내었다. 신초를 증식시킨 후 감염바이러스를 다시 진단한 결과, 신초가 처음 재생되었을 때의 진단결과와 동일하였다. 휴면아로부터 분열조직을 배양하여 바이러스가 제거된 신초를 확보한 예는 세계적으로 보고된 바가 없는 것으로서, 본 연구진의 새로운 바이러스 제거방법은 향후 포도 뿐만 아니라 과수를 포함한 낙엽성 수목의 무병묘 생산에 매우 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
Herein, we report the meristem-tip culture from dormant buds of grape 'Kyoho' single-infected with Grapevine fleck virus (GFkV), which is phloem-limited and transmitted by graft inoculation. We produced GFkV-free shoots without thermo- or chemotherapy using meristem-tip explants approximately 0.3 mm...
Herein, we report the meristem-tip culture from dormant buds of grape 'Kyoho' single-infected with Grapevine fleck virus (GFkV), which is phloem-limited and transmitted by graft inoculation. We produced GFkV-free shoots without thermo- or chemotherapy using meristem-tip explants approximately 0.3 mm (73 explants) and 0.8 mm long (five explants) including shoot apical meristem, 2-5 leaf primordia, and 1-4 uncommitted primordia from dormant buds of the infected woody cuttings (stored at $4^{\circ}C$). Explants were cultured on Murashige and Skoog (MS) medium supplemented with 3% sucrose, 3.0 mg/L benzyladenine (BA) and 0.1 mg/L indole-3-butyric acid (IBA). After 16 weeks of culture, shoot (10-mm long) regeneration frequency achieved from 0.3-mm explants was 4.1% and that obtained from 0.8-mm explants was 40.0%. Virus-free efficiency (expressed as the percentage of RT-PCR negative shoots regenerated) from 0.3- and 0.8-mm explants was 100% and 50%, respectively. Following in vitro multiplication, RT-PCR assays revealed identical results to assays of the first regenerated shoots. Our new methodological approach could be applied for eliminating other viruses in grapevines, as well as for producing virus-free plants in many other deciduous tree species, including fruit trees.
Herein, we report the meristem-tip culture from dormant buds of grape 'Kyoho' single-infected with Grapevine fleck virus (GFkV), which is phloem-limited and transmitted by graft inoculation. We produced GFkV-free shoots without thermo- or chemotherapy using meristem-tip explants approximately 0.3 mm (73 explants) and 0.8 mm long (five explants) including shoot apical meristem, 2-5 leaf primordia, and 1-4 uncommitted primordia from dormant buds of the infected woody cuttings (stored at $4^{\circ}C$). Explants were cultured on Murashige and Skoog (MS) medium supplemented with 3% sucrose, 3.0 mg/L benzyladenine (BA) and 0.1 mg/L indole-3-butyric acid (IBA). After 16 weeks of culture, shoot (10-mm long) regeneration frequency achieved from 0.3-mm explants was 4.1% and that obtained from 0.8-mm explants was 40.0%. Virus-free efficiency (expressed as the percentage of RT-PCR negative shoots regenerated) from 0.3- and 0.8-mm explants was 100% and 50%, respectively. Following in vitro multiplication, RT-PCR assays revealed identical results to assays of the first regenerated shoots. Our new methodological approach could be applied for eliminating other viruses in grapevines, as well as for producing virus-free plants in many other deciduous tree species, including fruit trees.
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문제 정의
본 연구에서는 포도 ‘Kyoho’ 품종에서 휴면아로부터 경정을 채취하여 배양함으로써 GFkV가 제거된 무독화 식물체를 재생하고자 하였다.
가설 설정
(A) Woody cuttings stored at 4°C for 7 weeks (left) and latent buds detached (right). (B) Latent bud was separated into three-member compound buds. (C) Inner leaf primordia left after removing outer ones for surface-sterilization.
제안 방법
PCR 조건은 초기변성을 위해 94°C에서 2분간 반응시킨 뒤, DNA 증폭을 위한 반응(95°C에서 40초간 DNA 변성, 60°C에서 30초간 primer 접합, 72°C에서 30초간 DNA 신장)을 35회 반복하였다.
RT-PCR 검정으로 GFkV 단독 감염이 확인된 포도 ‘거봉’ #20, #22, 식물체의 동절기 휴면아로부터 절취한 경정조직절편체들은 배양 8주차부터 절편체의 생존율, 버드 형성률(2 mm 이상), 신초 재생률(10 mm 이상), 바이러스 제거효율을 조사하였다.
2008)을 변형하여 total RNA를 추출하였으며, 추출된 RNA는 M-MLV reverse transcriptase (Invitrogen, USA)를 이용하여 cDNA 합성에 사용하였다. 경정조직 배양을 하기 이전에 휴면아를 채취할 포도 식물체는 cDNA를 주형으로 각 3 sets의 바이러스 특이 primer sets (Table 1)를 PCR 반응에 사용하여 어떤 바이러스에 감염되어 있는지를 확인하였으며, 감염된 휴면아의 경정조직배양을 통해 재생된 신초는 원래 감염되었던 바이러스를 다시 진단하였다. PCR에 사용한 총 20 μL 의 반응액은 0.
1F). 경정조직 절편체로부터 신초를 유도하기 위하여 절편체를 신초 유도 배지에 5 ~ 25개 씩 치상하여 배양하였다. 신초 유도 배지는 MS 배지(Murashige and Skoog 1962) 4.
경정조직은 4°C에서 일정기간 저장된 1년생 경화가지의 휴면아로부터 0.3 mm (73 절편체)와 0.8 mm (5절편체)를 절취하였는데, 절취 부위는 생장점(apical meristem)을 포함하여 2~ 5개의 엽원기(leaf primordia)와 미분화 원기(uncommitted primordia) 1 ~ 4개를 포함하였다.
경정조직은 길이 0.3 mm와 0.8 mm 두 가지 종류로 절취하였는데, 0.3 mm 경정조직(meristem-tip)은 생장점과(apical meristem) 2 ~ 3개의 엽원기(leaf primordia), 그리고 그 아래쪽에 있는 미분화 원기(uncommitted primordia) 일부를 포함하였고) (Fig. 1E), 0.8 mm 경정조직은 생장점, 3 ~ 5개의 엽원기, 2 ~ 3개의 미분화 원기를 포함하였다(Fig. 1F). 경정조직 절편체로부터 신초를 유도하기 위하여 절편체를 신초 유도 배지에 5 ~ 25개 씩 치상하여 배양하였다.
본 연구에서는 포도 ‘Kyoho’ 품종에서 휴면아로부터 경정을 채취하여 배양함으로써 GFkV가 제거된 무독화 식물체를 재생하고자 하였다. 기존의 경정배양법은 왕성하게 생장하고 있는 식물체에서 경정을 절취하는 방법이지만, 본 연구에서는 포도식물체의 동절기 휴면아로부터 직접 경정을 절취하는 것으로서 휴면아에도 경정 분열조직이 존재하고, GFkV는 도관에만 존재하는 바이러스로 경정 분열조직에는 존재하지 않으며(Gosalvez-Bernal et al. 2008), 저온을 받은 휴면아는 비광합성 상태로서 도관분화가 활발하지 않아 휴면아의 경정조직은 생장 중인 식물체보다 비감염 부위가 클 것이라 예상하고 실험을 수행하였다. 이번에 개발한 바이러스제거 방법은 경정배양에 대하여 새로운 시각으로 접근한 것으로서 향후 온대 과수작물의 무병묘 생산에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
RT-PCR 검정으로 GFkV 단독 감염이 확인된 포도 ‘거봉’ #20, #22, 식물체의 동절기 휴면아로부터 절취한 경정조직절편체들은 배양 8주차부터 절편체의 생존율, 버드 형성률(2 mm 이상), 신초 재생률(10 mm 이상), 바이러스 제거효율을 조사하였다. 바이러스 제거효율은 재생된 신초수에 대한 바이러스 RT-PCR negative 신초수의 백분율로 표시하였다.
최종 신장을 위해 72°C에서 5분간 반응시킨 후 종료하였으며, 18S rRNA를 내부 대조구(internal control) 사용하여 합성된 cDNA가 RT-PCR 반응에 제대로 사용되었는지를 확인하였다. 반응이 증폭된 DNA는 1.3% agarose gel 상에서 100 V에서 30분간 전기영동 한 후, ethidium bromide로 염색하여 UV 상에서 관찰하였다.
분석에 사용할 식물 시료 100mg을 CTAB 방법(Gambino et al.2008)을 변형하여 total RNA를 추출하였으며, 추출된 RNA는 M-MLV reverse transcriptase (Invitrogen, USA)를 이용하여 cDNA 합성에 사용하였다. 경정조직 배양을 하기 이전에 휴면아를 채취할 포도 식물체는 cDNA를 주형으로 각 3 sets의 바이러스 특이 primer sets (Table 1)를 PCR 반응에 사용하여 어떤 바이러스에 감염되어 있는지를 확인하였으며, 감염된 휴면아의 경정조직배양을 통해 재생된 신초는 원래 감염되었던 바이러스를 다시 진단하였다.
신초 유도 배지는 MS 배지(Murashige and Skoog 1962) 4.4 g/L, sucrose 30 g/L, benzyladenine (BA) 3.0 mg/L, 3-indolebutyric acid (IBA) 0.1 mg/L을 첨가하여 pH를 5.8로 조정한 후, plant agar 7 g/L를 첨가하여 autoclave에서 121°C로 20분간 고압 증기 살균하여 제조하였으며, 배양용기(model 310100, SPL Life Sciences, Korea) (100 mm × 40mm)안에 50 ml씩 분주하였다.
이후, 클린벤치 안에서 1% 차아염소산나트륨(sodium hypochlorite)에 2 ~ 3분간 침지하여 2차 표면살균 후, 멸균수로 3회 세척하였다. 실체 현미경 하에서 조직배양용 핀셋과 메스, 그리고 일회용 주사기(5ml)를 이용하여 표면 살균한 엽원조직 안에 위치한 경정조직(meristem-tip) (Fig. 1D)을 절취하였다.
지금까지 경정배양이라 함은 왕성하게 생장하고 있는 식물체에서 경정을 절취하여 배양하는 것으로, 본 연구진이 휴면아로부터 직접 경정을 바로 절취하여 배양한 방법은 경정배양법에 대한 새로운 접근법이며, 경정의 사용을 식물이 생장 중일 때에만 국한하지 않고, 휴면아 내부에 있는 경정까지 포함시켜 그 사용 범위를 확대한 것이다. 일반적으로, 경화된 휴면가지를 이용하여 경정을 절취할 때는 휴면 타파를 위해 저온에 일정기간 저장하고 난 후, 휴면아로부터 신초를 생장시켜 기내･외로 도입하는 과정을 진행하고 경정을 절취하는데, 본 연구는 이러한 과정 없이 바로 휴면아로부터 경정을 절취하였다. 또한, 절취한 경정을 그대로 배양하여 별도의 열처리나 화학처리 등의 무병화 처리과정을 생략하고 바이러스가 제거된 신초를 획득하였는데, 이러한 방법은 시간, 노력, 비용을 절감할 수 있는 매우 경제적인 방법이라고 사료되었다.
재생된 신초는 신장 및 증식 배지에 옮겨 약 8주간 배양하였는데, 증식배지는 MS 배지 2.2 g/L, sucrose 15 g/L, BA 3.0 mg/L, IBA 0.1 mg/L을 첨가하여 pH를 5.8로 조정한 후, plant agar 7g/L를 첨가하여 autoclave에서 121°C로 20분간 고압 증기살균하여 제조하였다.
최종 신장을 위해 72°C에서 5분간 반응시킨 후 종료하였으며, 18S rRNA를 내부 대조구(internal control) 사용하여 합성된 cDNA가 RT-PCR 반응에 제대로 사용되었는지를 확인하였다.
대상 데이터
2009), 이때 생장점은 3 ~ 4개의 정도의 엽원기(leaf primordia)와 아직 분화조직이 정해지지 않은 2 ~ 3개의 미분화원기(uncommitted primordia)를 갖는 것으로 보인다. 본 실험에서 사용한 휴면아가 바로 앞서 기술한 상태의 것을 사용한것으로 여겨지며, 0.3 mm는 생장점을 포함하여2 ~ 3개의 엽원기와 미분화 원기의 조직 일부를, 0.8 mm는 생장점을 포함하여 3 ~ 5개의 정도 엽원기와 2 ~ 3개의 미분화 원기를 포함하였다.
본 연구에서는 농촌진흥청 국립원예특작과학원 온실의 포트에 생장 중인 ‘거봉’을 RT-PCR 검정을 통해 GFkV 단독감염을 확인한 2개체(#20과 #22)의 동절기 휴면아를 식물재료로 사용하였다(Fig. 1).
성능/효과
0%이었다. 16주 차에는 생존율 100%, 버드 생성률 60.0%, 신초 재생률 40.0% 이었다. 두 종류의 경정조직으로부터 재생된 신초는 증식 및 신장배지에서 약 8주간 배양하여 신장된 신초들은 현재 발근 배지에서 배양 중에 있다.
3 mm 길이의 경정조직으로부터 재생된 신초 3계통을 RT-PCR을 수행하여 바이러스를 진단한 결과, 감염주에서 진단되었던 GFkV 바이러스가 계통 모두에서 진단되지 않아(RT-PCR negative) (Fig. 3) 경정조직 배양으로 인한 바이러스 제거율은 100%로 나타났다(Table 2). 한편, 경정조직의 길이가 0.
8 mm인 절편체로부터 재생된 신초 2계통을 진단한 결과, 감염주에서 진단되었던 GFkV 바이러스가 신초 1계통에서 진단되어(Fig. 4) 바이러스 제거율은 50.0%로 나타났다(Table 3). 두 가지 길이의 경정조직으로부터 재생된 신초 계통들을 약 8주간 배양하여 증식한 후, 다시 진단하여도 동일한 결과를 얻었다.
본 연구진은 세계 최초로 GFkV에 단독 감염된 포도 품종 거봉의 휴면아로부터 직접 경정 분열조직을 절취하여 배양함으로써 별도의 열처리나 화학처리 없이 GFkV가 제거된 신초 재생에 성공하였다. GFkV는 포도 식물체의 체관에만 한정적으로 존재하고 접목으로 감염되는 포도 바이러스이다.
8 mm (5절편체)를 절취하였는데, 절취 부위는 생장점(apical meristem)을 포함하여 2~ 5개의 엽원기(leaf primordia)와 미분화 원기(uncommitted primordia) 1 ~ 4개를 포함하였다. 절취된 경정조직을 BA 3.0mg/L와 IBA 0.1 mg/L가 혼합된 배지에 16주간 배양한 결과, 0.3 mm와 0.8 mm의 경정조직에서 각각 4.1%와 40.0%의 신초재생률이 관찰되었고, 재생된 신초에서의 바이러스 제거율(재생된 신초수에 대한 RT-PCR negative 신초수의 백분율)은 0.3 mm의 경정조직에서는 100%를, 0.8 mm에서는 50%를 나타내었다. 신초를 증식시킨 후 감염바이러스를 다시 진단한 결과, 신초가 처음 재생되었을 때의 진단결과와 동일하였다.
휴면아로부터 0.3 mm 길이의 경정조직으로부터 재생된 신초 3계통을 RT-PCR을 수행하여 바이러스를 진단한 결과, 감염주에서 진단되었던 GFkV 바이러스가 계통 모두에서 진단되지 않아(RT-PCR negative) (Fig. 3) 경정조직 배양으로 인한 바이러스 제거율은 100%로 나타났다(Table 2).
후속연구
1E) 마치 진주를 박아 넣은 듯한, 확실한 돔(dome) 형태를 이루었는데, 이러한 생장점의 모습은 식물이 생장 중일 때는 관찰하기 어려웠다. 본 연구실험에서 0.3 mm와 0.8 mm 길이의 경정조직에서 재생한 신초에서 바이러스 제거효율이 상이하였는데, 이 두 가지 길이의 중간쯤인 0.5 mm 에서 실험을 추가하여 거봉에서 바이러스 제거에 효율적인 경정의 길이를 좀더 구체적으로 파악할 필요가 있고, 다른 품종을 대상으로 실험을 수행하여 품종마다 적합한 경정의 절취와 신초 재생률을 높일 수 있는 배양조건을 구명해야 할 것으로 판단된다.
본 연구에서 개발한 경정배양 방법은 GFkV뿐만 아니라, GLRaV와 같이 식물체의 생장점에는 존재하지 않는 다른 도관 바이러스(Gosalvez-Bernal et al. 2008)의 제거에도 매우 효과적일 것으로 판단되며, 향후 포도뿐만 아니라 온대 과수작물의 무병묘 생산에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 전망된다.
2008), 저온을 받은 휴면아는 비광합성 상태로서 도관분화가 활발하지 않아 휴면아의 경정조직은 생장 중인 식물체보다 비감염 부위가 클 것이라 예상하고 실험을 수행하였다. 이번에 개발한 바이러스제거 방법은 경정배양에 대하여 새로운 시각으로 접근한 것으로서 향후 온대 과수작물의 무병묘 생산에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
신초를 증식시킨 후 감염바이러스를 다시 진단한 결과, 신초가 처음 재생되었을 때의 진단결과와 동일하였다. 휴면아로부터 분열조직을 배양하여 바이러스가 제거된 신초를 확보한 예는 세계적으로 보고된 바가 없는 것으로 서, 본 연구진의 새로운 바이러스 제거방법은 향후 포도 뿐만 아니라 과수를 포함한 낙엽성 수목의 무병묘 생산에 매우 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
Grapvine fleck virus의 특징은?
포도의 Grapvine fleck virus (GFkV)는 GLRaV-1, GLRaV-3 바이러스들과 더불어 포도 식물체의 체관에만 한정적으로 존재하는(phloem-limited) 바이러스로 접목감염을 통해서만 전염되며 종자로는 전염되지 않는다(Hewitt et al. 1972; Martelli 1993; Martelli et al.
Grapvine fleck virus의 증상은?
2002). GFkV는 지표식물인Vitis rupestris에서 잎에 얼룩을 나타내는 것을 제외하곤 대부분의 Vitis 종(species)에서 증상을 드러내지 않는 잠복 감염형태로 존재하나(Martelli et al. 2002), 식물 생리학적 측면에서(Bota et al. 2014), 그리고, 대개 다른 포도 바이러스와 복합감염 되어 있을 경우에 생산량과 과실품질 측면에 부정적인 영향을 끼친다고 하였다(Cretazzo et al. 2010a; Komar et al.
포도작물에서의 바이러스 제거기술의 종류는?
포도작물에서의 바이러스 제거기술은 감염된 기내외 식물을 열처리(thermotherapy)한 후 경정배양(shoot or meristem tip culture)을 하거나(Maliogka et al. 2009; Valero et al. 2003; Skiada et al. 2009), 또는 열처리 없이 경정배양만을 이용하는 (Duran-Vila 1988; Yossef et al. 2009) 전통적인 방법 이외에, 체세포 배양(somatic embryogenesis) (Gribaudo et al. 2006; Gambino et al. 2009; Borroto-Fernandez et al. 2009), 항 바이러스제(antiviral drugs)를 이용한 화학처리법(chemotherapy) (Panattoni et al. 2007; Skiada et al. 2013), 초저온 동결법(cryopreservation)(Wang et al.2003), 경정조직 파편 배양(in vitro fragmented shoot apex culture) (Barlass 1987)법 등이 이용되었다.
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