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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 해방풍 부위별 및 추출용매에 따른 추출물의 항산화 활성과 RAW 264.7 대식세포주를 이용 하여 LPS 처리에 의해 증가한 nitric oxide의 생성억제능을 비교분석하여 항산화 활성 및 면역조절능을 가지는 해방풍의 기능성소재 개발을 위한 기초자료로 이용하고자 실시하였다.
- 해방풍이 가지는 건강 기능성 소재로서의 가치를 확인하고자, 해방풍 부위별 용매추출물의 항산화 활성 및 면역조절 효과를 조사하였다. 해방풍 부위별 용매추출물의 추출 수율은 10.
제안 방법
- DPPH radical 소거활성은 1,1-diphenyl-2-pycrylhydrazyl (DPPH)의 환원력을 이용하여 측정하였다(17). 즉, DPPH reagent는 DPPH 12 mg을 absolute ethanol 100 mL에 용해한 후 증류수 100 mL 첨가하여 흡광도를 517 nm에서 약 1.
- FRAP는 FeSO4·7H2O(Sigma-Aldrich Co.)을 정량하여 작성한 표준곡선으로부터 계산하였다.
- 따라서, 추출용매에 따른 해방풍 부위별의 항염 활성을 확인하기 위해 lipopolysaccharide (LPS, 0.1 μg/mL)로 자극을 유도한 Raw 264.7 세포를 이용 하여 NO의 생성에 미치는 영향을 분석하였다(Fig. 5).
- 배양이 완료된 후 상등액 50μL에 동량의 Griess 시약(Sigma-Aldrich Co.)을 혼합하여 10분간 반응시킨 후 microplate reader(UVM-340, Asys Co.)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였으며, NO 생성 량은 sodium nitrite(Sigma-Aldrich Co.)의 농도별 표준곡선을 이용하여 계산하였다.
- 세포독성은 MTT assay로 측정하였으며, 배양된 세포주를 5×104 cell/well의 농도로 조정하여 96 well plate에 100 μL씩 첨가하여 24시간 배양하고 이후 새로운 배지에 시료를 농도별로 처리한 다음 24시간 동안 배양하였다.
- 시료 500 μL에 0.1 M Tris-HCl 완충용액(pH 8.5) 100 μL, 100 μM phenazine methosulfate(PMS, Sigma-Aldrich Co.) 200 μL를 혼합하여 반응 시킨 후 500 μL nitro blue tetrazolium(NBT, SigmaAldrich Co.) 200 μL 및 500 μM β-nicotinamide adenine dinucleotide(NADH, Sigma-Aldrich Co.) 400 μL를 첨가하여 실온에서 10분간 반응시킨 다음 분광광도계(Ultraspec 2100pro, Biochrom Ltd.)를 이용하여 560 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 추출물은 해방풍 부위별 분말 30 g에 고형분 대비 10배의 증류수, 70% 에탄올 및 70% 메탄올을 첨가하였다. 증류수는 100℃에서 3시간, 70% 에탄올 및 70% 메탄올은 80℃에서 3시간 동안 환류냉각추출기(CA-1112, Eyela Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 추출하였고 각각의 추출물은 불순물을 제거하기 위하여 여과지(Whatman No. 2)를 이용하여 여과 하였다. 여과된 용액은 감압농축기(Model N-1N, Eyela Co.
- , Cambridge, UK)를 이용하여 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 폴리페놀 함량은 tannic acid(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)를 사용하여 작성한 표준곡선으로부터 계산하였다.
- ) 를 이용하여 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 플라보노이드함량은 rutin(Sigma-Aldrich Co.)을 사용하여 작성한 표준곡선으로부터 계산하였다.
- 추출물은 해방풍 부위별 분말 30 g에 고형분 대비 10배의 증류수, 70% 에탄올 및 70% 메탄올을 첨가하였다. 증류수는 100℃에서 3시간, 70% 에탄올 및 70% 메탄올은 80℃에서 3시간 동안 환류냉각추출기(CA-1112, Eyela Co.
- 해방풍 부위별 추출물의 수율은 동결건조(Free Zone 2.5, Labconco Co.)한 다음 건물 중량을 구하였고 시료 조제에 사용한 원료 건물량에 대한 백분율로 나타내었다.
대상 데이터
- 40071) 세포는 한국세포주은행(KTCC, Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다. 세포배양은 DMEM 배지(Welgene, Daegu, Korea)를 이용하여 각각 10% fetal bovine serum (Gibco BRL Co., Grand Island, NY, USA), 1% penicillinstreptomycin(Gibco BRL Co.)을 첨가하여 배양하였다. 세포는 모두 37℃, 5% CO2 incubactor(MCO-18 AIC, Sanyo Co.
- 실험에 사용한 대식세포주인 RAW 264.7(KCTC No.40071) 세포는 한국세포주은행(KTCC, Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다. 세포배양은 DMEM 배지(Welgene, Daegu, Korea)를 이용하여 각각 10% fetal bovine serum (Gibco BRL Co.
- 해방풍은 경상북도 울진군 농업기술센터로부터 제공받았다. 해방풍의 뿌리, 잎 및 씨앗은 각각 45℃에서 24시간 열풍 건조하였으며, 분쇄기(RT-04, Hanli Co.
- 해방풍은 경상북도 울진군 농업기술센터로부터 제공받았다. 해방풍의 뿌리, 잎 및 씨앗은 각각 45℃에서 24시간 열풍 건조하였으며, 분쇄기(RT-04, Hanli Co., Sejong, Korea)로 분쇄하여 표준망체(60 mesh, Chung Gye Sang Cong Sa, Seoul, Korea)를 통과시킨 분말을 추출용 시료로 사용하였다.
데이터처리
- 모든 실험결과는 IBM SPSS Statistics(19.0, IBM Corp., Armonk, NY, USA)를 이용한 분산분석(ANOVA)을 실시하였고 각 측정 평균값의 유의성 (p<0.05)은 Duncan's multiple range test를 실시하여 검정하였다.
이론/모형
- FRAP는 Benzie와 Strain의 방법(20)에 따라 다음과 같이 측정하였다. FRAP reagent는 25 mL acetate buffer(300 mM, pH 3.
- Superoxide radical 소거활성은 Nishikimi 등(19)의 방법에 따라 다음과 같이 측정하였다. 시료 500 μL에 0.
- 총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis법(15)에 따라 시료 1 mL에 1 N Folin Ciocalteu reagent 1 mL를 첨가하고 충분히 혼합한 다음 20% Na2CO3 1 mL를 첨가하여 실온의 암소에서 30분간 반응시킨 후 분광광도계(Ultrospec 2100pro, Biochrom Ltd., Cambridge, UK)를 이용하여 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 폴리페놀 함량은 tannic acid(Sigma-Aldrich Co.
- 총 플라보노이드 함량은 Jia 등(16)의 방법을 응용하여 측정하였다. 시료 1 mL에 5% NaNO2 150 μL를 혼합하여 실온에서 6분간 반응 시킨 후 10% AlCl3 300 μL와 혼합하여 다시 실온에서 5분간 반응 시킨 후 1 N NaOH 1 mL와 혼합한 다음 분광광도계(Ultrospec 2100pro, Biochrom Ltd.
성능/효과
- 05%으로 나타나 뿌리 추출물이 가장 낮았다. ABTS radical 소거활성은 모든 시료에서 농도의존적으로 활성이 증가하였으며, 70% 에탄올 및 70% 메탄올 추출물에서 각각 9.58-57.64% 및 9.49-52.31%로 높은 활성을 나타내었다. 해방풍 부위별 용매추출물의 경우, DPPH radical 소거활성과 같이 잎 추출물에서 57.
- DPPH radical 및 ABTS radical 소거활성은 해방풍 잎 70% 에탄올 추출물(EL)이 100-1,000 μg/mL 농도에서 12.90-84.70% 및 11.78-57.64%로 가장 우수한 radical 소거활성을 나타내었으며, superoxide radical 소거활성 및 FRAP 활성은 해방풍 잎 70% 에탄올 추출물(EL)이 100-1,000 μg/mL 농도 에서 각각 49.91-84.05% 및 255.38-975.28 μM로 가장 우수한 활성을 나타내었다.
- 1 및 2와 같다. DPPH radical 소거활성은 모든 시료에서 농도 의존적으로 증가하였으며, 추출 용매의 경우 70% 에탄올 및 70% 메탄올 추출물에서 각각 4.09-84.70% 및 4.31-83.26%로 열수추출물에 비해 높은 항산화 활성을 나타내었다. 해방풍 부위별 DPPH radical 소거 활성은 잎 추출물에서 84.
- FRAP 활성은 모든 시료에서 농도 의존적으로 활성이 증가하였으며. 추출용매별 FRAP 활성은 70% 에탄올 및 70% 메탄올 추출물에서 각각 142.
- 28 μM로 가장 우수한 활성을 나타내었다. 대식세포주인 RAW 264.7 세포에 해방풍 부위별 용매추출물을 처리하였을 때 nitric oxide 생성 억제능을 확인하기 위해 분석한 결과, 추출용매에 따른 nitric oxide 생성량은 70% 에탄올 및 70% 메탄올 추출물 에서 가장 낮은 생성량을 보였으며, 해방풍 부위별에 따른 nitric oxide 생성량은 뿌리, 잎 및 씨앗 순으로 낮았다. 그중에서 해방풍 뿌리 70% 에탄올 추출물(ER)에서 가장 낮은 nitric oxide 생성량을 보여 우수한 nitric oxide 억제 효과를 확인하였으며, 이를 이용하여 기능성 소재, 미용식품 및화장품 제조용 원료 등 다양하게 활용 가능할 것으로 사료 된다.
- 5). 모든 시료에서 농도 의존적으로 LPS에 유도되어 생성된 NO량이 감소하는 것을 확인하였다. 추출용매에 따른 NO량은 50 μg/mL 농도에서 70% 에탄올 및 70% 메탄올 추출물이 각각 5.
- 식물에 포함되어 있는 다양한 페놀산 및 플라보노이드는 산화·환원에 영향을 미친다고 보고하였으며(30), 본 연구를 통해 국내 자생 해방풍 부위별 추출물이 철 이온 환원력에 탁월한 효과가 있음을 증명하였으며 해방풍 잎 추출물은 다양한 라디칼에 대한 소거활성이 다른 부위에 비해 우수하여 생체내 산화적 스트레스에 대한 항산화 물질로써 활용 가능함을 확인하였다.
- 80 μM로 가장 낮은 nitric oxide 생성량을 나타내었다. 앞서 실험한항산화 활성과 비교하였을 때, 추출용매에 따른 활성은 70% 에탄올 및 70% 메탄올 추출물에서 우수한 항산화 활성과 낮은 nitric oxide 생성량을 나태었으며, 해방풍 부위별에 따른 활성은 항산화 활성에서는 잎, 씨앗 및 뿌리 순으로 우수한 활성이 나타났으나, nitric oxide 생성량은 뿌리, 잎 및 씨앗 순으로 낮은 nitric oxide 생성량을 나타내었다. Kim(35)의 연구에서 LPS로 RAW 264.
- 또한 Wang 등(25)에 의하면 DPPH radical 소거능과 총 페놀 화합물의 함량은 밀접한 상관관계가 있음이 보고된 바 있다. 이에 근거하여 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량이 높게 나타난 70% 에탄올 잎 추출물이 항산화 활성이 우수 할 것으로 사료되었다.
- 추출용매별 FRAP 활성은 70% 에탄올 및 70% 메탄올 추출물에서 각각 142.38-975.25 μM 및 148.20-942.47 μM로 높은 활성을 나타내었다.
- 추출용매별 총 폴리페놀 함량은 70% 에탄올 추출물에서 3.54-10.79 g/100 g으로 가장 높았으며, 70% 메탄올 및 열수 추출물이 각각 3.33-10.18 g/100 g 및 1.86-8.11 g/100 g으로 나타났다. 해방풍 부위별 총 폴리페놀 함량은 잎 추출물에서 10.
- 추출용매에 따른 NO량은 50 μg/mL 농도에서 70% 에탄올 및 70% 메탄올 추출물이 각각 5.25 μM 및 5.93 μM로 가장 낮은 nitric oxide 생성량을 보였으며, 해방풍 부위별에 따른 nitric oxide 생성량은 50μg/mL에서 뿌리 및 잎 추출물이 각각 5.25 μM 및 9.80 μM로 가장 낮은 nitric oxide 생성량을 나타내었다.
- 즉 페놀 함량이 높게 나타남은 산화 억제 작용이 높음을 의미한다(22). 추출용매에 따른 총 플라보노이드 함량은 70% 에탄올 추출물에서 0.79-2.01 g/100 g으로 가장높게 나타났으며, 70% 메탄올 및 열수추출물이 각각 0.35-1.56 g/100 g 및 0.33-1.43 g/100 g으로 나타났다. 해방풍 부위별 총 플라보노이드 함량은 잎 추출물에서 2.
- 해방풍 부위별 용매추출물의 추출수율, 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량은 Table 1과 같다. 추출용매에 따른 추출수율은 뿌리 및 씨앗 열수추출물이 다른 용매에 비해 높게 나타났으며, 부위별 추출수율은 뿌리의 경우 열수추출물이, 잎은 70% 메탄올 추출물에서 가장 높게 나타났다.
- 79 g/100 g으로 나타나 총 폴리페놀 함량과 유사한 경향이었다. 추출용매의 경우 70% 에탄올에서 총폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량이 가장 높게 나타났으며, 해방풍 부위의 경우 잎 추출물이 가장 높음을 확인하였다. 식물체에 함유되어 있는 폴리페놀은 만성질환에 강력히 저항하는 기능성을 지닌 2차 대사산물이고 식물유래식품에서 활성산소를 수용하는 역할을 하여 항산화 효과를 나타낸다고 보고하였으며(23), 폴리페놀과 플라보노이드는 세포를 공격하는 유리라디칼(ROS, OH, NO)의 산화작용을 억제 및 소거하는 기능기를 포함하고 있다(24).
- 26%로 열수추출물에 비해 높은 항산화 활성을 나타내었다. 해방풍 부위별 DPPH radical 소거 활성은 잎 추출물에서 84.70%로 가장 높았고, 씨앗 및 뿌리 추출물에서 75.56% 및 25.05%으로 나타나 뿌리 추출물이 가장 낮았다. ABTS radical 소거활성은 모든 시료에서 농도의존적으로 활성이 증가하였으며, 70% 에탄올 및 70% 메탄올 추출물에서 각각 9.
- 해방풍 부위별 superoxide radical 소거활성은 잎 추출물에서 11.15-84.05%로 가장 높은 활성을 나타내었으며, 씨앗 및 뿌리 추출물에서 각각 32.76-73.41% 및 5.83-40.82%으로 나타나 1,000 μg/mL 농도에서 잎 추출물은 뿌리 추출물에 비해 대략 2배 높은 항산화 활성을 나타내었다.
- 해방풍 부위별 열수추출물(10-1,000 μg/mL)과 해방풍 부위별 70% 에탄올 및 70% 메탄올 추출물(1-50 μg/mL)을 처리하였을 때 모든 시료에서 95% 이상 세포 생존율이 나타나 세포독성이 없음을 확인하여 nitric oxide 생성 억제 세포실험의 농도로 설정하였다.
- 해방풍 부위별 용매추출물의 FRAP 활성은 잎 추출물에서 975.25 μM로 가장 높은 활성을 나타내었으며, 씨앗 및 뿌리 추출물에서 각각 815.72 μM 및 212.51 μM으로 나타나 1,000 μg/mL 농도에서 잎 추출물은 뿌리 추출물에 비해 약 4배 높은 항산화 활성을 나타내었다.
- 31%로 높은 활성을 나타내었다. 해방풍 부위별 용매추출물의 경우, DPPH radical 소거활성과 같이 잎 추출물에서 57.64%로 가장 높은 활성을 나타내었으며, 씨앗 및 뿌리 추출물에서 각각 34.64% 및 16.06%으로 나타났다. Kwon 등(26)의 연구 결과에서 산겨릅나무의 DPPH radical 소거활성이 에탄올 추출물, 열수 추출물 및 수용액 분획물이 각각 85.
- 해방풍이 가지는 건강 기능성 소재로서의 가치를 확인하고자, 해방풍 부위별 용매추출물의 항산화 활성 및 면역조절 효과를 조사하였다. 해방풍 부위별 용매추출물의 추출 수율은 10.73-30.57이며, 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량은 해방풍 잎 70% 에탄올 추출물(EL)에서 각각 10.79 g/100 g 및 2.01 g/100 g으로 가장 높은 값을 나타내었다. DPPH radical 및 ABTS radical 소거활성은 해방풍 잎 70% 에탄올 추출물(EL)이 100-1,000 μg/mL 농도에서 12.
- 11 g/100 g으로 나타났다. 해방풍 부위별 총 폴리페놀 함량은 잎 추출물에서 10.79 g/100 g으로 나타났으며, 씨앗 및 뿌리 추출물이 각각 9.30 g/100 g 및 3.54 g/100 g으로 나타나 뿌리부위의 폴리페놀 함량이 낮음을 확인하였다. 식물체에 함유되어 있는 페놀 화합물들은 다양한 항산화 활성 및 생리활성 기능을 가지고 있는데 이것은 분자 내 phenolic hydroxyl기가 효소 단백질과 같은 거대 분자들과 결합하는 성격이 있어 이러한 생리활성 기능을 나타내는 주체로 인정되고 있다고 알려져 있다(21).
- 43 g/100 g으로 나타났다. 해방풍 부위별 총 플라보노이드 함량은 잎 추출물에서 2.01g/100 g으로 가장 높았고, 씨앗 및 뿌리 추출물이 각각 1.43 g/100 g 및 0.79 g/100 g으로 나타나 총 폴리페놀 함량과 유사한 경향이었다. 추출용매의 경우 70% 에탄올에서 총폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량이 가장 높게 나타났으며, 해방풍 부위의 경우 잎 추출물이 가장 높음을 확인하였다.
후속연구
- 7 세포에 해방풍 부위별 용매추출물을 처리하였을 때 nitric oxide 생성 억제능을 확인하기 위해 분석한 결과, 추출용매에 따른 nitric oxide 생성량은 70% 에탄올 및 70% 메탄올 추출물 에서 가장 낮은 생성량을 보였으며, 해방풍 부위별에 따른 nitric oxide 생성량은 뿌리, 잎 및 씨앗 순으로 낮았다. 그중에서 해방풍 뿌리 70% 에탄올 추출물(ER)에서 가장 낮은 nitric oxide 생성량을 보여 우수한 nitric oxide 억제 효과를 확인하였으며, 이를 이용하여 기능성 소재, 미용식품 및화장품 제조용 원료 등 다양하게 활용 가능할 것으로 사료 된다.
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