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문제 정의
- 어류로부터 다양한 종류의 항균활성 펩타이드가 발견되었지만 아직까지 졸복의 부산물인 아가미로부터 새로운 기능을 지니는 생리활성 물질 개발에 관한 연구는 그다지 많지 않다. 따라서, 본 연구에서는 졸복의 아가미 추출물을 사용하여 항균활성을 나타내는 물질을 정제하고자 하였다.
제안 방법
- 5)를 포함하는 overlay gel을 붓고 굳힌 후에 동일한 온도에서 18시간 동안 2차 배양하였다. 다음 날, well 주위의 clear zone의 유무 및 clear zone diameter (mm)를 확인하여 활성의 세기를 측정하였다. 한편, 정제한 물질의 pH, 온도, 및 trypsin 효과에 대한 실험은 이전의 방법과 동일한 방법으로 측정하였다[28].
- 두 번째 단계로, 첫 번째 단계에서 활성을 나타낸 분획들을 CapcellPak C18 (4.6 mm × 250 mm, Shiseido, Japan) column에 주입하여 정제하였으며 분리조건은 다음과 같다: A 용매; 0.1% TFA를 포함하는 H2O (pH2.2), B용매; 0.1% TFA를 포함하는 CH3CN (pH 2.2), 분리조건; 5 → 65% (60 min), 파장; 220 nm, 유속; 1.0 ml/min.
- 마지막 단계 의 역상 HPLC (Capcellpak C18, 4.6×250 mm)에서 14%의 isocratic 조건으로 최종정제 하였다(Fig. 4A).
- 분리된 각각의 분획들은 1/5에 해당하 는 양을 사용하여 URDA로 활성을 측정하였다. 마지막 정제 단계로 활성을 지닌 분획은 동일한 CapcellPak C18 column을 사용하여 isocratic 조건으로 진행하였으며, 분리조건은 다음과 같다: A 용매; 0.1% TFA를 포함하는 H2O (pH2.2), B용매; 0.1% TFA를 포함하는 CH3CN (pH 2.2), 분리조건; 14%의 isocratic (30 min), 파장; 220 nm, 유속; 1.0 ml/min (Fig. 1). 모든 실험은 실온에서 진행되었으며, 각각의 과정에서 분리된 분획 들은 B.
- 1). 모든 실험은 실온에서 진행되었으며, 각각의 과정에서 분리된 분획 들은 B. subtilis KCTC 1021을 사용하여 항균활성을 측정하였다.
- 우선, 온도에 대한 효과를 알아보기 위해서 물질은 100℃에서 10분간 처리하여 항균 효과를 측정하였다. 물질의 pH 변화, 산성 및 염기성에 대한 항균효과는 0.01% HCl 및 0.01% NaOH를 각각 처리하여 37℃에서 10분간 방치한 후 측정하였다. Trypsin에 대한 물질의 항균효과는 250 mg/ml의 crystalline trypsin (Fisher Scientific, Fairlawn, NJ, USA)을 첨가하고 37 ℃에서 60분간 방치한 후 측정하였다.
- 3A의 black bar). 반응을 나타낸 활성 분획은 Fig. 1에 나타낸 것처럼 역상 및 양이온 교환 HPLC를 교차 반복적으로 사용하여 정제하였다. 마지막 단계 의 역상 HPLC (Capcellpak C18, 4.
- 0 ml/min. 분리된 각각의 분획들은 1/200에 해당하는 양을 사용하여 URDA로 활성을 측정하였다. 두 번째 단계로, 첫 번째 단계에서 활성을 나타낸 분획들을 CapcellPak C18 (4.
- 0 ml/min. 분획은 fraction collector를 이용하여 1 분당 1 ml씩 받았으며, 분리된 각각의 분획들은 1/50에 해당하는 양을 사용하여 URDA로 활성을 측정하였다. 세 번째 단계로, 활성을 지닌 분획들을 cation-exchange column인 Mono-SⓇ HR5/5 (Pharmacia Biotech, Sweden)를 사용하여 다음과 같은 분리조건으로 정제하였다.
- 0 ml/min. 분획은 fraction collector를 이용하여 1 분당 1 ml씩 받았으며, 분리된 각각의 분획들은 1/50에 해당하는 양을 사용하여 URDA로 활성을 측정하였다. 세 번째 단계로, 활성을 지닌 분획들을 cation-exchange column인 Mono-SⓇ HR5/5 (Pharmacia Biotech, Sweden)를 사용하여 다음과 같은 분리조건으로 정제하였다.
- 분획은 fraction collector를 이용하여 1 분당 1 ml씩 받았으며, 분리된 각각의 분획들은 1/50에 해당하는 양을 사용하여 URDA로 활성을 측정하였다. 세 번째 단계로, 활성을 지닌 분획들을 cation-exchange column인 Mono-SⓇ HR5/5 (Pharmacia Biotech, Sweden)를 사용하여 다음과 같은 분리조건으로 정제하였다. A 용매; 20 mM citric buffer (pH 6.
- subtilis KCTC 1021을 사용하였다. 우선, 온도에 대한 효과를 알아보기 위해서 물질은 100℃에서 10분간 처리하여 항균 효과를 측정하였다. 물질의 pH 변화, 산성 및 염기성에 대한 항균효과는 0.
- 정제한 물질의 화학적 특성인 안정성 효과를 알아보기 위해서 pH, 온도 및 효소처리를 하여 항균활성을 측정하였다(Table 1). PFG는 단백질 분해효소인 trypsin을 처리하기 전에는 항균활성을 나타내었지만(Table 1A), trypsin을 처리한 후에는 대부분 활성이 소실되었다(Table 1B).
- 정제한 펩타이드의 분자량 및 아미노산 서열을 알아보기 위해 MALDI-TOF Mass와 아미노산서열 분석기로 측정하였다. PFG의 분자량은 1171.
- 졸복의 아가미 추출물을 사용하여 Sep-Pak C18 cartridge로 부분 정제한 분획인 RM 60의 1/10,000, 1/5,000, 1/2,500에 해당하는 양의 농도로 B. subtilis KCTC 1021에 대한 항균활성을 측정하였다. 그 결과, RM 60은 각각 해당하는 농도에서 항균 반응을 나타내었다(Fig.
- 첫 번째 정제단계로 RM 60을 cation-exchange column인 TSK-Gel SP-5PW를 사용하였으며, 얻어진 분획들은 각 분획의 1/200에 해당하는 양을 사용하여 B. subtilis KCTC 1021에 대해 항균활성을 측정하였다. 그 결과 약 0.
대상 데이터
- Louis, MO, USA)에서 각각 구입하였다. HPLC-grade의 water (H2O) 및 acetonitrile (CH3CN)은 J.T. Baker사 (NJ, USA)에서 구입하였고, 그 이외의 모든 시약은 특급을 사용하였다.
- Sep-Pak Vac C18 cartridge는 Waters사 (Waters associates, Miliford, MA, USA)에서 구입하였다. Tryptic soy broth (TSB) 와 Lactose-Boullion (LB)는 Merck사 (Merck, Darmstadt, Germany)에서, Agarose (Low EEO Agar)는 Sigma사 (St.
- Sep-Pak Vac C18 cartridge는 Waters사 (Waters associates, Miliford, MA, USA)에서 구입하였다. Tryptic soy broth (TSB) 와 Lactose-Boullion (LB)는 Merck사 (Merck, Darmstadt, Germany)에서, Agarose (Low EEO Agar)는 Sigma사 (St. Louis, MO, USA)에서 각각 구입하였다. HPLC-grade의 water (H2O) 및 acetonitrile (CH3CN)은 J.
- 실험에 사용한 물질은 20 μg/ml을 사용하였으며, 사용 균주는 B. subtilis KCTC 1021을 사용하였다.
- 실험에 사용한 졸복(Takifugu pardalis, 30마리, 체장 5~7 cm)는 2015년 2월에 부산시 남구 섬마을수산에서 구입하였다. 졸복으로부터 아가미를 분리한 후, 즉시 액체질소에 동결시켜 실험 전까지 -75℃에 보관하였다.
- 1% TFA가 포함된 60% 메탄올(RM60)로 물질을 용출시켰다(50 ml). 항균활성을 측정하기 위해 RM60의 1/10,000, 1/5,000 및 1/2,500에 해당하는 양을 사용하였으며, 사용 균주로는 Bacillus subtilis KCTC 1021을 사용하였다.
이론/모형
- 최종 정제한 항균활성물질의 분자량을 측정하기 위해서 Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) Mass spectrometer (Voyager-DETM STR spectrometer, perseptive Biosystem, USA)를 사용하였으며, Matrix는 α-cyano-4-hydroxycinamic acid를 사용하였다. 또한 정제한 천연물의 아미노산 서열을 분석하기 위해서 Edman 분해법을 이용한 Shimadzu (PPSQ-21A, Japan) 아미노산 분석기(부경대학교 공동실험실습관)를 사용하였다.
- 최종 정제한 항균활성물질의 분자량을 측정하기 위해서 Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) Mass spectrometer (Voyager-DETM STR spectrometer, perseptive Biosystem, USA)를 사용하였으며, Matrix는 α-cyano-4-hydroxycinamic acid를 사용하였다.
성능/효과
- 29로 매우 높은 염기성을 지니고 있다. PFG의 아미노산 서열과 기존에 밝혀진 서열과의 동일성(homology)을 알아보기 위해 NCBI blast를 통해 조사한 결과, 다른 종의 졸복(Takifugu rubripes), 담수어 시클리드(Haplochromis burtoni), 농어목 어류(Gazza minuta), 담 수어 cyprinid 어류(Sinocyclocheilus grahami), 부세(large yellow croaker, Larimichthys crocea)에 존재하는 histone H3의 N말단영역과 부분적으로 유사한 것을 알 수 있었다(Fig. 5).
- 2). 그 결과 RM 60은 11.6~14.1 mm 크기의 항균활성을 나타내었다. Positive control로 항균성 펩타이드인 piscidin (1 mg/ml의 3 μl)을 사용하였으며, 이 물질의 항균반응의 크기는 12.
- subtilis KCTC 1021에 대한 항균활성을 측정하였다. 그 결과, RM 60은 각각 해당하는 농도에서 항균 반응을 나타내었다(Fig. 2). 그 결과 RM 60은 11.
- 모든 sample은 0.01% acetic acid (pH 4.0)에 녹여 활성을 측정하였으며, negative control로 0.01% acetic acid (pH 4.0) 5 μl를 사용하여 용매에 의한 영향이 없음을 확인하였다.
- 4B), 이 물질의 일차구조는 10개의 아미노산 잔기로 구성된 STKEKAPRKQOH로 판명되었다. 아미노산서열 분석으로부터 얻어진 PFG의 분자량을 계산한 결과, 분자량은 1172.35 Da으로 이론치와 잘 일치하였다. 또한 이 물질의 pI값은 10.
- 본 연구에서 졸복의 아가미로부터 정제된 PFG는 histone H3의 N-말단영역과 부분적으로 동일한 서열을 나타내고 있기 때문에, PFG는 처음으로 정제된 histone H3 유래의 항균활성 펩타이드라 생각된다. 이러한 결과는 본 연구에서 정제된 항균활성 물질이 기존에 밝혀진 histone H1, H2A 및 H2B 유래의 물질과 다른 종류의 물질이라는 것을 의미한다. 따라서 새로이 정제된 물질은 졸복의 아가미에 존재하고 있는 histone H3관련 항균성 물질이라 생각되며, 이 물질은 졸복의 아가미에서 선천성 방어 시스템에서 중요한 역할을 하고 있다고 여겨진다.
- 그러나 열(100℃)을 가하거나 산성 및 염기성 조건하에서는 활성이 그대로 유지되었다(Table 1C - Table 1E). 이러한 결과로부터 PFG의 활성은 온도 및 pH 변화에 대해 안정하지만, trypsin 처리 후에는 반응에 민감하다는 것을 알 수 있다.
후속연구
- 한편, 어류의 미이용자원인 아가미를 포함한 두부, 내장 및 껍질은 다양한 종류의 생리활성 물질을 다량 포함하고 있다고 알려져 있다[9]. 이러한 비가식부인 폐기물들을 이용하여 어류 질병의 항생제로 사용될 수 있는 새로운 항균활성 펩타이드를 개발한다면, 미이용자원으로부터 고부가가치를 지닌 새로운 물질을 발견할 수 있으리라 생각된다. 어류로부터 다양한 종류의 항균활성 펩타이드가 발견되었지만 아직까지 졸복의 부산물인 아가미로부터 새로운 기능을 지니는 생리활성 물질 개발에 관한 연구는 그다지 많지 않다.
- 따라서 새로이 정제된 물질은 졸복의 아가미에 존재하고 있는 histone H3관련 항균성 물질이라 생각되며, 이 물질은 졸복의 아가미에서 선천성 방어 시스템에서 중요한 역할을 하고 있다고 여겨진다. 현재 이 결과를 토대로 정확한 서열을 얻기 위해 추후 cDNA 클로닝을 진행할 예정이다.
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