[논문]미세 유체 칩 기반의 히알루론산 미세 실의 제작

이윤경; 이광호

doi:10.9718/jber.2017.38.1.1

[국내논문] 미세 유체 칩 기반의 히알루론산 미세 실의 제작
Micro-threads of Cross-linked Hyaluronic Acid Hydrogel using a Microfluidic Chip 원문보기

Journal of biomedical engineering research : the official journal of the Korean Society of Medical & Biological Engineering, v.38 no.1, 2017년, pp.1 - 8

이윤경 (강원대학교 공과대학 신소재공학과) , 이광호 (강원대학교 공과대학 신소재공학과)

Abstract ▼ AI-Helper

The successful synthesis of hyaluronic acid micro-threads is very promising approach for the broad application in tissue engineering such as dermal fillers. Because hyaluronic acid has the excellent biocompatibility and ability to maintain the moisture of up to several hundred times its own weight. In order to generate the hyaluronic acid micro-threads in microfluidic system, we employed two-phase flow microfluidic chip to make a rapid synthesis of the hyaluronic acid hydrogel. Hyaluronic acid was mixed with 0.02N NaOH solution and 1, 4-Butanediol diglycidyl ether (BDDE) solution and then injected into core channel. The ethanol was used for the 3-dimensional micro-thread formation in sheath channel. We manipulated the diameter of HA micro-threads using controlling of flow rates in microfluidic chip, and showed the feasibility of immobilization in HA micro-threads with florescent substances. Also, the generated HA micro-threads were evaluated and showed the suitable properties with tensile strength, bending property, and swelling profiles for dermal fillers. As a result, we suggested an innovative method for microfluidic chip-based HA micro-threads which could safely be applied as dermal filler in tissue engineering.

주제어

AI 본문요약
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제안 방법

히알루론산 미세 실의 체내 안정성을 평가하기 위해 세포 적합성 시험을 수행하였다. 12시간 동안의 자외선 광원 조사 및 에탄올과 증류수에 의한 세척을 통해 미세 실의 멸균과정을 거쳤다. 쥐의 신경 교종세포의 한 종류인 C6세포는 Dubecco’s modified eagle’s medium (DMEM) (WELGENE, Korea), Fetal bovine serum (FBS) (Gibco, Korea)과 Penicillin (WELGENE, Korea)이 혼합된 배양액 내에서 배양되었으며, 5%의 CO₂환경이 조성된 37℃의 배양기 (SANYO, KOREA) 내에서 3일 동안 배양 후, 6well 세포 배양접시(SPL life sciences, Korea)에 고정된 히알루론산 미세 실 위에 0.
2ml의 PBS 내에 4µl의 Ethidium Homodimer-1 (Eth-D1)과 1µl의 Calcein-AM을 혼합하여 제조된 LIVE/DEAD ® 세포 염색 용액을 80µl 주입하여 40분 동안 배양기에서 보관 후, 형광현미경을 통해 세포의 생존율을 측정하였다.
제작된 미세 실을 관찰하기 위해 광학현미경과 전계방사형 주사전자현미경(Field emission scanning electron microscope, FE-SEM)(Hitachi, Japan)이 사용되었다. 5wt% 및 10wt% 히알루론산 미세 실의 각각 50개 시료에 대한 표면 특성과 거칠기 및 직경을 광학현미경을 통해 분석하였고, 히알루론산 미세 실의 비전도성 특성에 의한 charge-up 현상을 방지하기 위해 20초 간 시료 표면을 백금 코팅한 후[33], 시료 표면의 손상을 최소화하기 위해 5kV의 낮은 가속전압을 인가하여 FE-SEM을 통한 표면분석을 수행하였으며 추가적으로 히알루론산 미세 실의 순수한 표면 구성 성분을 도출 및 증명하기 위해 에너지 분산분석기(Energy dispersive spectroscopy, EDS)를 이용하였다. 또한, 적외선 분광기(Fourier transform infrared spectrometry, FT-IR)(PerkinElmer, UK)를 이용하여 광원을 통해 얻어지는 히알루론산 고유의 특징적인 흡수 파장에 의한 화학 결정 구조를 분석하였다.
5일 후 LIVE/DEAD ® kit (Invitrogen, California, USA)를 이용한 세포 염색을 위해 세포가 배양된 히알루론산 미세 실 주변의 세포 배양액을 제거한 후 PBS를 통해 2차례 세척하였다.
제작된 실리콘 웨이퍼 (Silicon wafer) 표면 위에 폴리디메틸실록산(Polydimethylsiloxane, PDMS)(Corning, USA)과 경화제를 각각 10:1의 비율로 혼합한 용액을 도포하였다. 80℃실험용 오븐(Oven)(Biofree, Korea)에서 30분 동안 열 경화 과정을 통해 도포된 PDMS용액을 경화시킨 후 실리콘 웨이퍼 표면으로부터 경화된 PDMS칩을 탈착시켜 불필요한 부분을 제거하였다. 상부에는 직경 1.
굽힘성 시험을 위해서는 각각의 직경(0.55mm, 2.35mm) 을 지니는 두 종류의 막대에 대해 각각의 길이(6cm, 5cm) 및 직경(150µm, 250µm)을 지니는 히알루론산 미세 실을 수차례 감아 굽힘 특성을 증명하였다.
또한, 수화젤의 특성인 미세 실의 팽윤 특성 분석을 위해 히알루론산 혼합용액 내에 500nm 크기의 녹색 형광입자(sicastar®-greenF) (Micromod, Germany)를 주입한 후, 입자가 고정된 각각 다른 직경을 가지는 히알루론산 미세 실 표면 위에 PBS 용액 1ml를 도포하여 시간에 따라 미세 실의 팽윤 형상을 형광현미경(Carl Zeiss, Germany)을 통해 관찰하였다.
5wt% 및 10wt% 히알루론산 미세 실의 각각 50개 시료에 대한 표면 특성과 거칠기 및 직경을 광학현미경을 통해 분석하였고, 히알루론산 미세 실의 비전도성 특성에 의한 charge-up 현상을 방지하기 위해 20초 간 시료 표면을 백금 코팅한 후[33], 시료 표면의 손상을 최소화하기 위해 5kV의 낮은 가속전압을 인가하여 FE-SEM을 통한 표면분석을 수행하였으며 추가적으로 히알루론산 미세 실의 순수한 표면 구성 성분을 도출 및 증명하기 위해 에너지 분산분석기(Energy dispersive spectroscopy, EDS)를 이용하였다. 또한, 적외선 분광기(Fourier transform infrared spectrometry, FT-IR)(PerkinElmer, UK)를 이용하여 광원을 통해 얻어지는 히알루론산 고유의 특징적인 흡수 파장에 의한 화학 결정 구조를 분석하였다. 제작된 히알루론산 미세 실의 기계적 물성을 측정하기 위해서는 미세 실의 인장강도 시험 및 굽힘성 시험을 수행하였다.
1몰(Mole)에 해당하는 가교제 BDDE를 추가 주입하였고 다시 12시간 동안의 기계적 교반 과정을 통해 최종적으로 10wt% 히알루론산 용액을 제조하였다. 또한, 히알루론산의 농도 차이에 따른 비교 분석을 위해 0.02N NaOH에 5wt%의 히알루론산을 투여한 후 히알루론산의 0.1몰에 해당하는 가교제 BDDE를 주입하여 상기 방법과동일하게 혼합하였다. 칩 채널 내로 주입되는 유량 및 유속 조건을 균일하게 제어하기 위해 실린지 펌프(Kd Scientific, Korea)가 사용되었으며, 10wt% 히알루론산 용액은 튜브를 통해 칩의 중앙채널로 40µl/min.
5 mm 크기의 펀치(Miltex, USA)를 이용해 히알루론산 및 에탄올이 주입 될 수 있도록 주입구를 먼저 형성시킨 후, 채널이 새겨진 두 PDMS 층을 부착시키기 위해 대기압 산소 플라즈마 장비(Femto science, Korea) 내에 칩을 넣고 1분 동안 60W 세기의 산소 플라즈마를 통한 표면처리를 하였다. 마지막으로, 수치해석으로 설계된 칩의 형상을 정확히 구현하기 위해 칩의 상부와 하부에 각각 음각으로 형성된 미세 채널의 모든 직선 및 곡선이 정합 될 수 있도록 광학현미경(OLYMPUS, Japan)을 사용하여 상부와 하부층을 접합시켰다. 접합을 견고하게 하기 위해 80℃의 핫플레이트(Hot plate) (DAIHAN Scientific, Korea)에서 30분 동안 열처리를 하였다.
미세 칩을 통해서 제작되는 히알루론산 미세 실내의 물질 고정가능성을 검증하기 위해 용액 제조 시 히알루론산 용액 내에 적색 파장에서 발현되는 10µm 크기의 적색 형광입자(sicastar®-redF) (Micromod, Germany)와 녹색파장에서 발현되는 10kDa의 BSA-FITC 녹색 형광용액 (Invitrogen, UK)을 각각 혼합하여 히알루론산 미세 실 내부로의 물질 고정가능성을 검증하였다.
80℃실험용 오븐(Oven)(Biofree, Korea)에서 30분 동안 열 경화 과정을 통해 도포된 PDMS용액을 경화시킨 후 실리콘 웨이퍼 표면으로부터 경화된 PDMS칩을 탈착시켜 불필요한 부분을 제거하였다. 상부에는 직경 1.5 mm 크기의 펀치(Miltex, USA)를 이용해 히알루론산 및 에탄올이 주입 될 수 있도록 주입구를 먼저 형성시킨 후, 채널이 새겨진 두 PDMS 층을 부착시키기 위해 대기압 산소 플라즈마 장비(Femto science, Korea) 내에 칩을 넣고 1분 동안 60W 세기의 산소 플라즈마를 통한 표면처리를 하였다. 마지막으로, 수치해석으로 설계된 칩의 형상을 정확히 구현하기 위해 칩의 상부와 하부에 각각 음각으로 형성된 미세 채널의 모든 직선 및 곡선이 정합 될 수 있도록 광학현미경(OLYMPUS, Japan)을 사용하여 상부와 하부층을 접합시켰다.
또한, 수화젤의 특성인 미세 실의 팽윤 특성 분석을 위해 히알루론산 혼합용액 내에 500nm 크기의 녹색 형광입자(sicastar®-greenF) (Micromod, Germany)를 주입한 후, 입자가 고정된 각각 다른 직경을 가지는 히알루론산 미세 실 표면 위에 PBS 용액 1ml를 도포하여 시간에 따라 미세 실의 팽윤 형상을 형광현미경(Carl Zeiss, Germany)을 통해 관찰하였다. 시간에 따른 미세 실의 팽윤비를 분석하기 위해서는 3ml의 PBS에 히알루론산 미세 실을 담근 후 12시간 동안 상온에서 건조 시켜 일정한 시간에 따른 무게를 측정하였다. 평형 팽윤비는 다음 식(1)을 이용하여 분석하였다.
인장강도 시험을 수행하기 위해서 마이크로 인장 시험 분석장비(Yeonjin, Korea)를 사용하였고, 길이 5cm 및 평균 직경 139µm의 10wt% 히알루론산 미세 실에 대한 인장강도를 측정하였다.
제안된 미세 유체 칩에서는 가교제와 혼합된 히알루론산 용액이 중심 채널로 유입되면서 가교가 진행되며, 측면 채널에서 유입된 에탄올이 중심 채널의 히알루론산 외부를 둘러싸며 3차원적 미세 실의 형태로 칩 밖으로 압출을 유도하였다(그림 1
최근에는 콜라젠, 알지네이트(Alginate) 등의 수화젤을 이용하여 미세 유체 칩 내에 유체의 가교 조건을 제공하여 기존에 비해 빠른 합성시간을 유도해내고 제작과 동시에 약물 및 세포 등의 고정도 가능한 합성법이 제시되고 있으나[29-31], 히알루론산 미세 실을 이용하기 위해 미세 유체 칩을 이용한 연구는 보고되지 않고 있어, 본 연구에서는 히알루론산의 가교반응을 유도하기 위하여 방적 (Spinning)이 가능한 미세 유체 칩을 사용하였고 히알루론산의 가교제인 1, 4-부탄디올 디글리시딜에테르(1, 4-butanediol diglycidyl ether, BDDE)를 사용하였다. 제작되는 히알루론산 미세 실이 생체 내에 적용되었을 시, 문제될 수 있는 가교제의 잔류량을 최소화하여 순수한 히알루론산만이 존재할 수 있도록 합성을 수행하였다. 또한, 가교된 히알루론산 미세 실의 화학 조성, 굽힘성, 팽윤성, 물질 고정성 및 세포안정성에 대한 실험을 통해 손상된 피부 조직 의 수복 및 재생에 대한 히알루론산 미세 실의 활용 가능성을 검증하였다.
또한, 적외선 분광기(Fourier transform infrared spectrometry, FT-IR)(PerkinElmer, UK)를 이용하여 광원을 통해 얻어지는 히알루론산 고유의 특징적인 흡수 파장에 의한 화학 결정 구조를 분석하였다. 제작된 히알루론산 미세 실의 기계적 물성을 측정하기 위해서는 미세 실의 인장강도 시험 및 굽힘성 시험을 수행하였다. 인장강도 시험을 수행하기 위해서 마이크로 인장 시험 분석장비(Yeonjin, Korea)를 사용하였고, 길이 5cm 및 평균 직경 139µm의 10wt% 히알루론산 미세 실에 대한 인장강도를 측정하였다.
이러한 방법들은 제조방법이 용이하며 저비용으로 단기간 내에 대량으로 제조가 가능하지만 히알루론산 용액과 가교제 만을 사용하여 마이크로 단위의 실을 제작 시 강한 압력에 의해 추출되어 실의 형태가 유지되지 못하고, 무엇보다 히알루론산 실 제작과 동시에 물질의 고정을 구현하여 기능성을 부여하거나 다양한 마이크로 단위의 직경으로 제어하기에 어려움이 있었다. 최근에는 콜라젠, 알지네이트(Alginate) 등의 수화젤을 이용하여 미세 유체 칩 내에 유체의 가교 조건을 제공하여 기존에 비해 빠른 합성시간을 유도해내고 제작과 동시에 약물 및 세포 등의 고정도 가능한 합성법이 제시되고 있으나[29-31], 히알루론산 미세 실을 이용하기 위해 미세 유체 칩을 이용한 연구는 보고되지 않고 있어, 본 연구에서는 히알루론산의 가교반응을 유도하기 위하여 방적 (Spinning)이 가능한 미세 유체 칩을 사용하였고 히알루론산의 가교제인 1, 4-부탄디올 디글리시딜에테르(1, 4-butanediol diglycidyl ether, BDDE)를 사용하였다. 제작되는 히알루론산 미세 실이 생체 내에 적용되었을 시, 문제될 수 있는 가교제의 잔류량을 최소화하여 순수한 히알루론산만이 존재할 수 있도록 합성을 수행하였다.
K)를 사용하여 12시간 동안 15rpm의 속도로 혼합하였다. 충분한 혼합이 이루어진 용액에 히알루론산의 0.1몰(Mole)에 해당하는 가교제 BDDE를 추가 주입하였고 다시 12시간 동안의 기계적 교반 과정을 통해 최종적으로 10wt% 히알루론산 용액을 제조하였다. 또한, 히알루론산의 농도 차이에 따른 비교 분석을 위해 0.
히알루론산은 생체 내에 진피 필러 등으로 이식하고자 할 경우, 수화젤의 특성에 기인하여 기계적 강도가 낮은 단점으로 구조체로 형성이 어렵고, 무엇보다 기존의 공정으로는 마이크로 단위의 실로 제작 시 기계적 물성 저하가 커서 제작의 어려움이 있었다. 하지만, 제안된 연구에서는 미세 유체 칩 내에서 최소한의 가교제 사용과 에탄올을 이용해서 가교와 동시에 3차원적인 미세 실의 형태로 제작에 성공하였다. 사용된 미세 유체 칩은 칩 내로 유입되는 히알루론산과 에탄올의 유량 제어를 통해 중심 채널로 유입되는 히알루론산의 유량을 증가 또는 감소시켜 제작되는 직경을 제어 할 수 있었으며, 직경에 따른 팽윤 특성, 인장강도, 굽힘 특성 등의 다양한 물성을 제시할 수 있었다.
히알루론산 미세 실의 수화 젤 특성을 검증하기 위해 500nm의 직경을 갖는 녹색으로 발현되는 형광 입자를 10wt% 히알루론산 미세 실에 고정하여 수분에 의한 팽윤 시에 입자의 이동을 추적해 제작된 실의 팽윤성을 분석하였다. 그림 5(a-c)는 제작된 미세 실을 직경 50~100µm, 100~150µm, 그리고 150~200µm의 세 군으로 분류하였으며, 각각의 미세 실에 PBS 용액이 흡수되는 순간을 고속 카메라로 0.
히알루론산 미세 실의 체내 안정성을 평가하기 위해 세포 적합성 시험을 수행하였다. 12시간 동안의 자외선 광원 조사 및 에탄올과 증류수에 의한 세척을 통해 미세 실의 멸균과정을 거쳤다.

대상 데이터

본 연구에서는 조직수복용으로 사용되는 천연 고분자인 히알루론산을 주 재료로 미세 실을 제조하였다. 히알루론산은 생체 내에 진피 필러 등으로 이식하고자 할 경우, 수화젤의 특성에 기인하여 기계적 강도가 낮은 단점으로 구조체로 형성이 어렵고, 무엇보다 기존의 공정으로는 마이크로 단위의 실로 제작 시 기계적 물성 저하가 커서 제작의 어려움이 있었다.
제작된 히알루론산 미세 실의 세포적합성 평가를 위해 10wt% 히알루론산 미세 실 표면에 C6 세포를 배양하였으며, 총 5일 간의 세포 배양기간 동안 동일한 영역의 미세 실표면에서 증식되는 세포의 사진을 촬영하고자 했으나, 매일이루어진 배양액 교체와 히알루론산의 팽윤현상 및 세포의 증식에 따른 문제로 동일한 부위 측정에 어려움이 있었다. 그림 6(a)는 히알루론산 미세 실 표면에 증식된 C6 세포의 3일차 사진으로 세포가 균일하게 분포되어 배양된 것을 확인할 수 있었으며, 제작된 히알루론산의 미세 실로 인한 미세 환경의 변화에 따른 C6 세포의 형태 변화 및 특이성은 관찰 할 수 없었으나, LIVE/DEAD ® kit로 세포를 염색한결과 그림 6(b)와 같이 미세 실 표면에서 세포의 생존율은약 98%(녹색발현: 생존, 적색발현: 사멸) 이상으로 높게 관찰되었다.
쥐의 신경 교종세포의 한 종류인 C6세포는 Dubecco’s modified eagle’s medium (DMEM) (WELGENE, Korea), Fetal bovine serum (FBS) (Gibco, Korea)과 Penicillin (WELGENE, Korea)이 혼합된 배양액 내에서 배양되었으며, 5%의 CO2환경이 조성된 37℃의 배양기 (SANYO, KOREA) 내에서 3일 동안 배양 후, 6well 세포 배양접시(SPL life sciences, Korea)에 고정된 히알루론산 미세 실 위에 0.5 × 106/ml의 농도로 세포를 5일동안 배양하였다.
칩 채널 내로 주입되는 유량 및 유속 조건을 균일하게 제어하기 위해 실린지 펌프(Kd Scientific, Korea)가 사용되었으며, 10wt% 히알루론산 용액은 튜브를 통해 칩의 중앙채널로 40µl/min.
히알루론산 미세 실의 제작을 위해 분자량 20,000의 히알루론산과 가교제로 1, 4-부탄디올 디글리시딜에테르(1, 4-butanediol diglycidyl ether, BDDE)(Sigma aldrich, USA)가 사용되었다. 4 ml의 0.
히알루론산(Hyaluronic acid, HA)(Bioland, Korea) 미세 실 가교를 위한 미세 채널이 내재된 칩 제작을 위해 소프트 리소그래피(Soft lithograpy)공정을 이용했으며[32], 칩은 히알루론산 및 가교제 혼합용액이 주입될 중앙 채널 (Core channel; 폭 400 µm, 길이 6 mm)과 미세 실의 형태 유도를 위해 에탄올(Daejung, Korea)이 주입될 측면 채널(Sheath channel; 폭 400 µm, 길이 13.5 mm)로 구성되었고, 두 용액이 혼합되는 채널의 폭은 700 µm, 길이는 30 mm로 설계되었다(그림 1(a)).

이론/모형

제작된 미세 실을 관찰하기 위해 광학현미경과 전계방사형 주사전자현미경(Field emission scanning electron microscope, FE-SEM)(Hitachi, Japan)이 사용되었다. 5wt% 및 10wt% 히알루론산 미세 실의 각각 50개 시료에 대한 표면 특성과 거칠기 및 직경을 광학현미경을 통해 분석하였고, 히알루론산 미세 실의 비전도성 특성에 의한 charge-up 현상을 방지하기 위해 20초 간 시료 표면을 백금 코팅한 후[33], 시료 표면의 손상을 최소화하기 위해 5kV의 낮은 가속전압을 인가하여 FE-SEM을 통한 표면분석을 수행하였으며 추가적으로 히알루론산 미세 실의 순수한 표면 구성 성분을 도출 및 증명하기 위해 에너지 분산분석기(Energy dispersive spectroscopy, EDS)를 이용하였다.

성능/효과

그림 4(a)는 590~630nm 파장대 부근에서 적색 파장으로 발현되는 형광입자(직경: 10µm)가 미세 실의 전체에 안정적이며 균일하게 분포되었음을 보여 주고 있으며, 미세 실의 내부에 고상의 입자가 고정되었음에도 불구하고 제작된 미세 실의 형태나 직경의 변화가 관찰되지 않았다. 그림 4(b)는 460~491nm 파장대 부근에서 녹색으로 발현되는 10kDa의 크기를 갖는 BSA-FITC 형광용액이 내재된 히알루론산 미세 실의 형광사진이며 형광입자가 고정된 경우와 동일하게 히알루론산 미세 실 전체에 고르게 고정되었음을 확인 할 수 있었고, 이러한 결과로 체내에 이식 시 미세 실 내부에 약물 및 생리활성 물질 등의 고정을 통해 약물의 전달 제어 등의 기능성을 부여 할수 있을 것으로 예상된다.
제작된 히알루론산 미세 실의 세포적합성 평가를 위해 10wt% 히알루론산 미세 실 표면에 C6 세포를 배양하였으며, 총 5일 간의 세포 배양기간 동안 동일한 영역의 미세 실표면에서 증식되는 세포의 사진을 촬영하고자 했으나, 매일이루어진 배양액 교체와 히알루론산의 팽윤현상 및 세포의 증식에 따른 문제로 동일한 부위 측정에 어려움이 있었다. 그림 6(a)는 히알루론산 미세 실 표면에 증식된 C6 세포의 3일차 사진으로 세포가 균일하게 분포되어 배양된 것을 확인할 수 있었으며, 제작된 히알루론산의 미세 실로 인한 미세 환경의 변화에 따른 C6 세포의 형태 변화 및 특이성은 관찰 할 수 없었으나, LIVE/DEAD ® kit로 세포를 염색한결과 그림 6(b)와 같이 미세 실 표면에서 세포의 생존율은약 98%(녹색발현: 생존, 적색발현: 사멸) 이상으로 높게 관찰되었다. 제작된 미세 실 표면에서 배양된 세포의 높은 증식률과 생존율은 3차원적인 히알루론산 미세 실의 형태를 유도하기 위해 가교제와 에탄올을 미세 칩에 함께 주입하여 제작했음에도 불구하고, 원재료인 히알루론산의 우수한 세포 적합성을 그대로 확보한 것으로 평가되었다.
(c)는 BDDE 가교제에 의한 10wt% 히알루론산 미세 실의 표면을 구성하는 화학 조성을 나타낸 FTIR 결과로 3265 cm−1 흡광도를 통해서 히알루론산 미세 실표면을 이루고 있는 C-H결합, N-H결합, O-H결합과 일치하는 조성 분석 값을 얻었으며, 1598cm−1 , 1421cm−1 흡광도에서는 –COOH, C=O결합에 대한 진동으로 기인하였음을 확인하였다.
광학현미경 사진을 통해 각각의 조건에 해당하는 50개 시료의 직경을 분석한 결과 10wt% 히알루론산 미세 실의 직경은 중앙채널 유체속도가 40µl/min.
마지막으로 C-O, C-C결합은 1025cm⁻¹ 흡광도를 통해 확인되었다[34]. 도출된 결과를 바탕으로 히알루론산 미세 실을 이루는 화학 조성이 히알루론산 원재료와 일치함을 증명하였다.
또한 제작된 히알루론산 미세 실의 구성 원소를 분석한 결과 히알루론산과 가교제에 의한 탄소와 산소, 그리고 수산화나트륨에 의한 소디움 성분이 히알루론산 원재료와 동일한 주요 성분으로 추출되었음을 확인하였다(그림 2
제작되는 히알루론산 미세 실이 생체 내에 적용되었을 시, 문제될 수 있는 가교제의 잔류량을 최소화하여 순수한 히알루론산만이 존재할 수 있도록 합성을 수행하였다. 또한, 가교된 히알루론산 미세 실의 화학 조성, 굽힘성, 팽윤성, 물질 고정성 및 세포안정성에 대한 실험을 통해 손상된 피부 조직 의 수복 및 재생에 대한 히알루론산 미세 실의 활용 가능성을 검증하였다.
특히, 히알루론산 미세 실의 제작 시에 나노 혹은 마이크로 단위의 입자 및 용액이 히알 루론산 미세 실 표면 내에 균일하게 안정적으로 고정이 가능하였음을 제시하였다. 미세 실 내에 물질의 고정을 통해 정량적인 물질의 방출 또한 가능 할 것으로 판단되며, 이러한 결과를 토대로 약물 또는 생리활성 물질이 고정된 히알루론산 미세 실을 생체 내에 이식하여 손상된 피부 조직의 재생 및 미용 분야에 적용 가능함을 나타내었다.
하지만, 제안된 연구에서는 미세 유체 칩 내에서 최소한의 가교제 사용과 에탄올을 이용해서 가교와 동시에 3차원적인 미세 실의 형태로 제작에 성공하였다. 사용된 미세 유체 칩은 칩 내로 유입되는 히알루론산과 에탄올의 유량 제어를 통해 중심 채널로 유입되는 히알루론산의 유량을 증가 또는 감소시켜 제작되는 직경을 제어 할 수 있었으며, 직경에 따른 팽윤 특성, 인장강도, 굽힘 특성 등의 다양한 물성을 제시할 수 있었다. 특히, 히알루론산 미세 실의 제작 시에 나노 혹은 마이크로 단위의 입자 및 용액이 히알 루론산 미세 실 표면 내에 균일하게 안정적으로 고정이 가능하였음을 제시하였다.
35 mm의 직경을 지닌 막대에 8차례의 굽힘이 가능하였다. 이러한 결과는 제조된 다양한 직경의 히알루론산 미세 실이 수차례의 굽힘에도 끊어짐이나 늘어짐의 현상 없이 본래의 물성을 유지하며 안정적으로 굽혀질 수 있음을 증명하였고, 이는 히알루론산 미세 실이 인체에 적용될 경우 체내의 굴곡진 부위에도 안정적으로 활용이 가능함을 나타낸다.
그림 6(a)는 히알루론산 미세 실 표면에 증식된 C6 세포의 3일차 사진으로 세포가 균일하게 분포되어 배양된 것을 확인할 수 있었으며, 제작된 히알루론산의 미세 실로 인한 미세 환경의 변화에 따른 C6 세포의 형태 변화 및 특이성은 관찰 할 수 없었으나, LIVE/DEAD ® kit로 세포를 염색한결과 그림 6(b)와 같이 미세 실 표면에서 세포의 생존율은약 98%(녹색발현: 생존, 적색발현: 사멸) 이상으로 높게 관찰되었다. 제작된 미세 실 표면에서 배양된 세포의 높은 증식률과 생존율은 3차원적인 히알루론산 미세 실의 형태를 유도하기 위해 가교제와 에탄올을 미세 칩에 함께 주입하여 제작했음에도 불구하고, 원재료인 히알루론산의 우수한 세포 적합성을 그대로 확보한 것으로 평가되었다.
으로 증가시켰을 시, 제작되는 히알루론산 미세 실의 직경을 약 2배 증가시킬 수 있었다(그림 1(d~e)). 중심채널의 유량 감소를 통해 히알루론산 미세 실의 직경을 더 감소시킬 수 있었으나 제작된 실의 기계적 강도가 매우 저하되었으며, 유량을 증가시켰을 경우 미세 실이 칩 내에서 압출되지 않고막히는 경우가 발생하여 본 연구에서는 10wt% 의 히알루론산 용액의 조건이 본 실험에서 가장 최적화된 조건으로 활용되었다. 광학현미경 사진을 통해 각각의 조건에 해당하는 50개 시료의 직경을 분석한 결과 10wt% 히알루론산 미세 실의 직경은 중앙채널 유체속도가 40µl/min.
사용된 미세 유체 칩은 칩 내로 유입되는 히알루론산과 에탄올의 유량 제어를 통해 중심 채널로 유입되는 히알루론산의 유량을 증가 또는 감소시켜 제작되는 직경을 제어 할 수 있었으며, 직경에 따른 팽윤 특성, 인장강도, 굽힘 특성 등의 다양한 물성을 제시할 수 있었다. 특히, 히알루론산 미세 실의 제작 시에 나노 혹은 마이크로 단위의 입자 및 용액이 히알 루론산 미세 실 표면 내에 균일하게 안정적으로 고정이 가능하였음을 제시하였다. 미세 실 내에 물질의 고정을 통해 정량적인 물질의 방출 또한 가능 할 것으로 판단되며, 이러한 결과를 토대로 약물 또는 생리활성 물질이 고정된 히알루론산 미세 실을 생체 내에 이식하여 손상된 피부 조직의 재생 및 미용 분야에 적용 가능함을 나타내었다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	히알루론산을 활용해 실과 같은 3차원 구조체로의 개발에 한계가 있는 이유는?	이러한 히알루론산을 생체 조직 내충진제로 사용하기 위해서는 기존 충진제에 비해 생분해 속도가 길어야 하고 이에 따라 충진제를 보충해야 하는 시기를 감소 시키는 것이 중요하다. 하지만, 히알루론산은 생체 내에 존재하는 히알루로니다아제(Hyaluronidase)와 같은 효소에 의해 분해가 발생하는 단점이 있으며 이를 방지하기 위해서는 히알루론산 분자들 사이에 다른 고분자와의 가교 공정이 필수적으로 수반되어야 하므로 실과 같은 3차원 구조체로의 개발에 한계가 있었다[17,18,24,25]. 기존의 연구에서는 실 형태의 구조체를 제조하기 위해 미세 단위 직경의 바늘을 통해 실의 직접적인 추출을 유도하는 압출법 [26,27]과 가교제와 혼합된 수화젤을 자외선에 노출시켜 가교반응을 유도하는 광 가교법[28] 등이 이용되어왔다.
	실 형태의 구조체를 제조하는 방법인 압출법과 광 가교법의 단점은?	기존의 연구에서는 실 형태의 구조체를 제조하기 위해 미세 단위 직경의 바늘을 통해 실의 직접적인 추출을 유도하는 압출법 [26,27]과 가교제와 혼합된 수화젤을 자외선에 노출시켜 가교반응을 유도하는 광 가교법[28] 등이 이용되어왔다. 이러한 방법들은 제조방법이 용이하며 저비용으로 단기간 내에 대량으로 제조가 가능하지만 히알루론산 용액과 가교제 만을 사용하여 마이크로 단위의 실을 제작 시 강한 압력에 의해 추출되어 실의 형태가 유지되지 못하고, 무엇보다 히알루론산 실 제작과 동시에 물질의 고정을 구현하여 기능성을 부여하거나 다양한 마이크로 단위의 직경으로 제어하기에 어려움이 있었다. 최근에는 콜라젠, 알지네이트(Alginate) 등의 수화젤을 이용하여 미세 유체 칩 내에 유체의 가교 조건을 제공하여 기존에 비해 빠른 합성시간을 유도해내고 제작과 동시에 약물 및 세포 등의 고정도 가능한 합성법이 제시되고 있으나[29-31], 히알루론산 미세 실을 이용하기 위해 미세 유체 칩을 이용한 연구는 보고되지 않고 있어, 본연구에서는 히알루론산의 가교반응을 유도하기 위하여 방적 (Spinning)이 가능한 미세 유체 칩을 사용하였고 히알루론산의 가교제인 1, 4-부탄디올 디글리시딜에테르(1, 4-butanediol diglycidyl ether, BDDE)를 사용하였다.
	히알루론산은 어떤 재료인가?	최근에는 천연 고분자인 히알루론산(Hyaluronic Acid, HA), 콜라젠(Collagen), 젤라틴(Gelatin), 피브린(Fibrin), 키토산(Chitosan) 등이 다양한 임상 분야에 폭넓게 활용되고 있다[12-17]. 특히 N-아세틸글루코사민(N-Acetylglucosamine)과 글루쿠론산(Glucuronic acid)이 교대로 사슬 형태로 결합되어 체내의 세포외기질(Extracellular matrix, ECM)을 구성하는 천연 고분자인 히알루론산은 세포와 세포 사이 또는 섬유 사이에 젤 상태로 존재하면서 조직의 빈 공간을 채우고, 세균의 침입 등을 억제해 콜라젠 재생을 촉진할 수 있어 피부의 기능 증진, 상처 치유, 연골 기질 안정화 등에 가장 효과적인 재료로 인식되고 되고 있다[7,18-21]. 또한 체내에 존재하는 천연 고분자 재료이기 때문에 뛰어난 생체적합성을 지니고 있으며, 스스로의 무게의 수백 배에 달하는 수분을 보유하는 보습인자 역할을 하기 때문에 약물 및 제약분 야의 활용을 넘어 미용 분야에서 가장 우수한 충진제로 제안되고 있다[13,22,23]. 이러한 히알루론산을 생체 조직 내충진제로 사용하기 위해서는 기존 충진제에 비해 생분해 속도가 길어야 하고 이에 따라 충진제를 보충해야 하는 시기를 감소 시키는 것이 중요하다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

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용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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