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문제 정의
- 따라서 본 연구의 목적은 다양한 ionic liquid 중에서 1-ethyl-3-methylimidazolium acetate ([EMIM][Ac])에 대한 내성이 증가된 돌연변이 효모 균주를 개발하는데 있다. 유도적 돌연변이 유발 방법(directed evolutionary approach)을 통해 돌연변이를 유발하여 [EMIM][Ac]에 대한 내성이 증가된 돌연변이 균주를 선별하였으며 최종적으로 [EMIM][Ac]가 포함된 배지에서 효과적인 에탄올 생산 능력을 비교하였다.
- 바이오매스로부터 에탄올을 생산하기 위해 주로 사용되는 효모인 S. cerevisiae를 이용하여 [EMIM][Ac]에 내성을 가진 돌연변이 효모 균주를 선별하기 위한 실험을 진행하였다. S.
- 목질계 바이오 매스 전처리에 사용되는 ionic liquid는 전처리 후 100% 회수되지 않아 잔존하는 ionic liquid의 독성이 직접적으로 미생물 균주의 생육에 나쁜 영향을 미쳐 에탄올 발효의 수율 및 생산성을 저해하는 문제를 가지고 있다. 본 연구에서는 ionic liquid에 저해를 받지 않으며 높은 ethanol 생산 효율을 가진 균주를 얻고자 유도적 돌연변이 유발 실험을 진행하였다. 선별된 돌연변이 균주 D452-B2와 D452-S3는 3% [EMIM][Ac]가 포함된 배지에서 glucose 소비속도는 4.
제안 방법
- cerevisiae D452-2)와 비교하기 위하여 D452-B2와 D452-S3 그리고 모균주를 3% [EMIM][Ac]가 추가된 YPD80 배지와 [EMIM][Ac]가 추가되지 않은 YPD80 배지에 각각 접종하여 발효를 진행하여 비교하였다. 5%의 [EMIM][Ac] 조건에서는 모균주의 성장속도와 glucose 소비속도가 크게 낮아져 돌연변이 균주와 비교하기 어려워 [EMIM][Ac] 농도를 3%로 조정하여 비교 실험을 수행하였다. [EMIM][Ac]가 포함된 YPD80 배지를 이용하여 30℃와 150 rpm 조건으로 발효를 진행한 결과 발효 18시간 동안 모균주는 11.
- (yeast extract 10 g/l, peptone 20 g/l, glucose 20 g/l)이다. Ionic liquid에 대한 내성을 확인하기 위해 250 ml flask에 [EMIM][Ac]를 5% 농도로 첨가한 50 ml의 YPD80 (yeast extract 10 g/l, peptone 20 g/l, glucose 80 g/l) 배지에 접종하여 30℃ 그리고 150 rpm 조건에서 발효를 진행하였다.
- cerevisiae를 이용하여 [EMIM][Ac]에 내성을 가진 돌연변이 효모 균주를 선별하기 위한 실험을 진행하였다. S. cerevisiae D452-2를 YPD20 배지에 전배양한 후 5% [EMIM][Ac]이 첨가된 YPD80 배지에 초기 OD (A600 nm)가 1.0이 되도록 접종한 후 유도적 돌연변이 유발 방법을 수행하였다. 배양 중에 glucose 농도가 초기 80 g/l에서 0−1 g/l 정도로 낮아지면 5% [EMIM][Ac]가 포함된 새로운 YPD80 배지에 배양액의 1%를 다시 접종하였다.
- 고체배지에 단계적으로 희석하여 도말한 후 30℃에서 약 10일간 배양하여 단일 colony를 확보하였다. 그 후 colony의 크기 별로 구분하여 5% [EMIM][Ac]와 80 g/l의 glucose가 포함된 YPD80 배지에 초기 OD가 1.0(A600 nm)이 되도록 접종한 후 30℃ 그리고 150 rpm 조건으로 배양을 진행하여 비교하였다. 최종적으로 glucose 소비속도와 ethanol 생산량이 높은 균주를 선별하였다.
- 유도적 돌연변이 유발에 사용된 배지는 5% [EMIM][Ac]와 80 g/l의 glucose가 포함된 YPD80 배지이며 초기 흡광도(OD600)가 1이 되도록 접종하여 30℃ 그리고 150 rpm에서 배양하였다. 그 후 glucose가 모두 소비되어 잔여 농도가 0 g/l일 때 5% [EMIM][Ac]와 80 g/l의 glucose가 첨가된 새로운 YPD80 배지에 배양액의 1%를 접종하는 방법으로 유도적 돌연변이 유발을 진행하였으며 이 과정을 약 70여일간 8차례에 걸쳐 수행하였다.
- 발효과정의 세포성장은 UV-visible spectrophotometer (Biomate 5, Thermo, USA)로 600 nm에서 흡광도를 측정하여 분석하였다. 다양한 대사산물(glucose, acetate, glycerol, ethanol)의 분석은 HPLC (HPLC 1200 Series, Agilent Technologies, USA)를 이용하였다. 분석용 컬럼은 Rezex ROA-Organic Acid H+ column (Phenomenex, USA)을 사용하였으며 refractive index detector (RID)를 이용하여 측정하였다.
- 고체배지에서의 크기가 큰 colony와 작은 colony의 크기에 따른 glucose 소비 속도와 ethanol 생산량에는 모두 뚜렷한 경향을 나타내지 않았다. 따라서 glucose 소비 속도가 가장 빠르고, ethanol 생산량이 가장 높은 B2 균주와 S3 균주를 각각 최종적으로 선별하고 각각 D452-B2와 D452-S3로 명명하였으며 이후 추가 실험을 진행하였다.
- 발효과정의 세포성장은 UV-visible spectrophotometer (Biomate 5, Thermo, USA)로 600 nm에서 흡광도를 측정하여 분석하였다. 다양한 대사산물(glucose, acetate, glycerol, ethanol)의 분석은 HPLC (HPLC 1200 Series, Agilent Technologies, USA)를 이용하였다.
- 다양한 대사산물(glucose, acetate, glycerol, ethanol)의 분석은 HPLC (HPLC 1200 Series, Agilent Technologies, USA)를 이용하였다. 분석용 컬럼은 Rezex ROA-Organic Acid H+ column (Phenomenex, USA)을 사용하였으며 refractive index detector (RID)를 이용하여 측정하였다. Column과 detector의 온도는 각각 50℃이고, 이 동상은 0.
- 고체배지에 배양한 결과 colony의 크기가 균일하지 않고 다양하게 분포되어 있는 것을 확인하였으며 각각의 크기별로 크기가 큰 colony와 작은 colony로 구분하여 선별하였다. 선별된 균주들의 [EMIM][Ac]에 대한 내성을 확인하기 위해 크기가 큰 colony 4 종류(B1,B2, B3, and B4)와 크기가 작은 colony 4 종류(S1, S2, S3, and S4)를 5% [EMIM][Ac]가 포함된 YPD80 배지에 접종하여 각각의 균주들의 균체성장과 ethanol의 생산 수율 그리고 생산성을 비교하였다(Table 1). 배양 결과 크기가 큰 colony 4 종류 모두 속도의 차이가 있기는 하지만 5% [EMIM][Ac]에 크게 저해를 받지 않고 균체 성장을 이루었으며, glucose를 효과적으로 ethanol로 전환시켰다.
- 선별된 돌연변이 균주의 [EMIM][Ac]에 대한 내성을 모균주(S. cerevisiae D452-2)와 비교하기 위하여 D452-B2와 D452-S3 그리고 모균주를 3% [EMIM][Ac]가 추가된 YPD80 배지와 [EMIM][Ac]가 추가되지 않은 YPD80 배지에 각각 접종하여 발효를 진행하여 비교하였다. 5%의 [EMIM][Ac] 조건에서는 모균주의 성장속도와 glucose 소비속도가 크게 낮아져 돌연변이 균주와 비교하기 어려워 [EMIM][Ac] 농도를 3%로 조정하여 비교 실험을 수행하였다.
- 따라서 본 연구의 목적은 다양한 ionic liquid 중에서 1-ethyl-3-methylimidazolium acetate ([EMIM][Ac])에 대한 내성이 증가된 돌연변이 효모 균주를 개발하는데 있다. 유도적 돌연변이 유발 방법(directed evolutionary approach)을 통해 돌연변이를 유발하여 [EMIM][Ac]에 대한 내성이 증가된 돌연변이 균주를 선별하였으며 최종적으로 [EMIM][Ac]가 포함된 배지에서 효과적인 에탄올 생산 능력을 비교하였다.
- 유도적 돌연변이 유발 방법을 통해 얻어진 제7차 배양액을 5%의 [EMIM][Ac]가 첨가된 YPD20 고체배지에 단계적으로 희석하여 도말한 후 30℃에서 약 10일간 배양하여 단일 colony를 확보하였다. 그 후 colony의 크기 별로 구분하여 5% [EMIM][Ac]와 80 g/l의 glucose가 포함된 YPD80 배지에 초기 OD가 1.
- 유도적 돌연변이 유발 실험 이후 [EMIM][Ac]에 대한 내성이 증가된 돌연변이 균주를 선별하기 위해 5% [EMIM][Ac]와 20 g/l의 glucose가 포함된 YPD20 고체배지에 도말하여 30℃에서 약 10일간 배양하였다. 고체배지에 배양한 결과 colony의 크기가 균일하지 않고 다양하게 분포되어 있는 것을 확인하였으며 각각의 크기별로 크기가 큰 colony와 작은 colony로 구분하여 선별하였다.
- 유도적 돌연변이 유발 실험 중에 발생하는 의도치 않은 다른 대사과정의 변화를 확인하기 위해 D452-B2와 D452-S3 그리고 모균주를 [EMIM][Ac]가 추가되지 않은 YPD80 배지를 이용하여 30℃와 150 rpm 조건에서 발효를 진행하여 그 결과를 비교하였다(Table 2). 모균주는 발효 12시간 만에 80 g/l의 glucose를 모두 소비하며 31.
대상 데이터
- Glucose는 대정화금 (Korea)에서 구매하였다. 1-Ethyl-3-methylimidazolium acetate ([EMIM][Ac])는 C-TRI (Korea)에서 구매하였다.
- Yeast extract, bacto peptone, agar는 Becton, Dickinson and Company (USA)로부터 구매하였다. Glucose는 대정화금 (Korea)에서 구매하였다. 1-Ethyl-3-methylimidazolium acetate ([EMIM][Ac])는 C-TRI (Korea)에서 구매하였다.
- S. cerevisiae D452-2 균주를 이용하여 5% [EMIM][Ac]가 포함된 배지에서 유도적 돌연변이 유발 실험을 수행하였다. 유도적 돌연변이 유발에 사용된 배지는 5% [EMIM][Ac]와 80 g/l의 glucose가 포함된 YPD80 배지이며 초기 흡광도(OD600)가 1이 되도록 접종하여 30℃ 그리고 150 rpm에서 배양하였다.
- 본 배양을 위하여 사용된 균주는 Saccharomyces cerevisiae D452-2이며, 전 배양에 사용된 배지는 YPD20 (yeast extract 10 g/l, peptone 20 g/l, glucose 20 g/l)이다. Ionic liquid에 대한 내성을 확인하기 위해 250 ml flask에 [EMIM][Ac]를 5% 농도로 첨가한 50 ml의 YPD80 (yeast extract 10 g/l, peptone 20 g/l, glucose 80 g/l) 배지에 접종하여 30℃ 그리고 150 rpm 조건에서 발효를 진행하였다.
성능/효과
- 34 g/l의 에탄올이 생산되었다. 8차례에 걸쳐 5% [EMIM][Ac]가 첨가된 YPD80 배지에 유도적 돌연변이 유발 방법을 수행한 결과 glucose 소비속도, 균체의 성장 속도, 에탄올 생산 속도 등이 각각 9.71배, 15.86배, 11.2배 증가되었음을 확인하였다.
- 모균주는 3% [EMIM][Ac]에 대해 심하게 저해를 받아 균체의 성장이 크게 감소하였으며 에탄올의 생산도 매우 낮았으나 돌연변이 균주 D452-B2와 D452-S3는 효과적으로 glucose를 소비하여 에탄올을 생산하였다. D452-B2와 D452-S3 균주의 에탄올 수율은 모균주와 비교하여 각각 2.89배와 2.99배 증가하였으며 생산성은 27.41배와 27.98배로 매우 크게 증가하였다.
- 고체배지에 도말하여 30℃에서 약 10일간 배양하였다. 고체배지에 배양한 결과 colony의 크기가 균일하지 않고 다양하게 분포되어 있는 것을 확인하였으며 각각의 크기별로 크기가 큰 colony와 작은 colony로 구분하여 선별하였다. 선별된 균주들의 [EMIM][Ac]에 대한 내성을 확인하기 위해 크기가 큰 colony 4 종류(B1,B2, B3, and B4)와 크기가 작은 colony 4 종류(S1, S2, S3, and S4)를 5% [EMIM][Ac]가 포함된 YPD80 배지에 접종하여 각각의 균주들의 균체성장과 ethanol의 생산 수율 그리고 생산성을 비교하였다(Table 1).
- 6이였다. 고체배지에서의 크기가 큰 colony와 작은 colony의 크기에 따른 glucose 소비 속도와 ethanol 생산량에는 모두 뚜렷한 경향을 나타내지 않았다. 따라서 glucose 소비 속도가 가장 빠르고, ethanol 생산량이 가장 높은 B2 균주와 S3 균주를 각각 최종적으로 선별하고 각각 D452-B2와 D452-S3로 명명하였으며 이후 추가 실험을 진행하였다.
- 6 g/l의 ethanol 생산을 보였다. 돌연변이 균주 D452-B2와 D452-S3는 [EMIM][Ac]에 내성이 증가된 반면 [EMIM] [Ac]이 첨가되지 않은 일반 YPD80 배지에서는 오히려 glucose의 소비속도가 모균주에 비해 각각 33% 그리고 28% 감소하였음을 확인하였다. 또한 균체의 성장과 에탄올의 생산량도 38−42%와 13−18% 감소하였다.
- 또한 균체의 성장과 에탄올의 생산량도 38−42%와 13−18% 감소하였다.
- cerevisiae Y133-IIL 균주의 경우 1%의 1-butyl-3-methylimidazolium chloride ([BMIM][Cl]) 조건에서 효과적으로 glucose와 xylose를 에탄올로 전환시킨다고 보고되었다[23]. 본 연구를 통해 선별된 돌연변이 균주 S. cerevisiae D452-B2와 D452-S3는 이들 결과와 비교해도 크게 뒤쳐지지 않는다는 것을 확인할 수 있었다.
- 선별된 돌연변이 균주 D452-B2와 D452-S3는 3% [EMIM][Ac]가 포함된 배지에서 glucose 소비속도는 4.5 g·l-1·h-1와 4.4 g·l-1·h-1로 모균주인 S. cerevisiae D452-2 균주에 비해 6배 가량 증가하였으며, ethanol 생산성은 각각 1.99 g·l-1·h-1와 2.0 g·l-1·h-1로 27배 가량 증가하였다.
- 그로 인해 D452-B2와 D452-S3 균주의 경우 에탄올 생산성은 13−18% 가량 감소하였으나 반면에 낮은 균체의 성장으로 인해 수율은 약 22% 가량 증가하였다. 유도적 돌연변이 유발 실험에 의해 D452-B2와 D452-S3 균주의 [EMIM][Ac]에 대한 내성은 증가하였으나 일반 YPD80 배지에서의 오히려 glucose 소비속도가 현저히 낮아지는 결과를 확인하였다. 유도적 돌연변이 유발 실험 과정에서 예상하지 못하는 다양한 돌연변이가 발생했을 것으로 예상되며 그로 인해 이러한 결과가 나타났을 것으로 사료된다.
- 배양 중에 glucose 농도가 초기 80 g/l에서 0−1 g/l 정도로 낮아지면 5% [EMIM][Ac]가 포함된 새로운 YPD80 배지에 배양액의 1%를 다시 접종하였다. 유도적 돌연변이 유발 실험의 제 1차 배양과 2차 배양에서는 80 g/l의 glucose를 10일 동안 소비하였으며 균체의 성장이 매우 저조하여 최종 OD (A600 nm)가 0.9 또는 0.96 정도였으나 3차 배양부터 균체의 성장이 증가하여 10일 동안 OD (A600 nm)가 2.98까지 증가하였다(Fig. 1). 4차 배양부터는 glucose 소비 속도와 균체의 성장 속도가 함께 증가하기 시작하여 7차 배양 결과 4일 동안 80 g/l의 glucose를 모두 소비하였으며, OD (A600 nm)는 6.
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