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문제 정의
- 분화된 세포는 지방구 생성 및 세포의 크기가 증가되는 형태적 변화와 더불어 특이적인 유전자의 발현을 유발함으로써 지방세포의 특징을 지니게 된다. 따라서 본 연구의 발효 유지가 adipogenic transcription factor들의 발현에 어떠한 영향을 미치는지를 mRNA 수준에서 확인하였다.
- 본 연구에서는 발효콩 유지가 비만 억제 및 예방, 3T3-L1지방전구세포의 성장 및 분화 억제 효과를 관찰하기 위해 실험을 실시하였다. 3T3-L1 지방전구세포에 발효콩 유지를 처리하여 세포생존율을 측정한 결과, NF군 100 μg/mL에서 3T3-L1 지방전구세포의 생존율을 유의적으로 감소시켜 세포독성이 나타났다.
- 본 연구에서는 발효콩을 이용한 발효식품 개발의 일환으로 다양한 균주(Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Lactobacillus acidophilus)를 이용한 발효콩 유지 및 B. subtilis와 L. acidophilus 균주를 혼합하여 만든 유지의 항비만 효과에 미치는 영향을 살펴보기 위해 3T3-L1 지방전구 세포에서 triglyceride 함량 측정 및 분화 관련 전사인자 및 각종 유전자 발현에 미치는 영향을 확인하고 고지방식 이를 유도한 C57BL/6J 생쥐를 이용하여 체중, 식이효율, 혈중 콜레스테롤 및 지질 농도 등에 미치는 영향을 살펴보고자 하였다.
제안 방법
- 발효콩 분말의 유지 추출은 각 샘플 50 g을 잘게 분쇄한 후 1차 추출용매(hexane : acetone=85:15) 150 mL와 함께 혼합하여 50°C가 유지된 이중 자켓 플라스크에 넣어 교반기(EYELA, Tokyo, Japan)를 활용하여 300 rpm으로 1시간 30분 동안 추출한 후 1차 추출용매를 제거하고, 2차 추출용매(100% acetone) 150 mL와 1차 추출용매가 제거된 발효콩 분말을 50°C가 유지된 이중 자켓 플라스크에 넣고 교반기(EYELA NZ)를 활용하여 300 rpm으로 1시간 30분 동안 추출하였다. 1차 추출용매와 2차 추출용매를 합하여 sodium sulfate를 통과하여 여분의 수분을 제거한 후 회전 진공 농축기에서 용매를 제거하여 추출 유지를 얻었다. 추출한 유지는 -18°C 냉동고에 넣어 보관하면서 분석 시료로 사용하였다.
- 3T3-L1 지방전구세포는 분화를 유도하기 위해 Harmon과 Harp(18)의 방법을 변형하여 실험하였다. 10% BCS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 6-well plate에 1.
- B. subtilis와 B. amyloliquefaciens는 콩에 2.5×106 CFU/g으로 생균수를 맞추어 접종하였다.
- BA+LBA 혼합발효는 동일한 조건에서 살균 후 증자된 콩에 B. amyloliquefaciens를 접종하여 42°C, 72시간 동안 1차 발효한 후 L. acidophilus를 접종하여 37°C, 72시간 동안 2차 발효하여 발효콩을 제조하였다.
- L. plantarum과 L. acidophilus는 콩에 접종시에 7.0×105 CFU/g으로 생균수를 맞추어 접종하였다.
- 3°C에서 30초간 annealing 시키고, 72°C에서 30초간 extension 시켰다. PCR product는 1% agarose gel에서 전기영동 한 후 Loading STAR(DYNE Bio Co., Gyeonggi, Korea)로 염색하여 UV transilluminator(OPTIMA, Tokyo, Japan)로 관찰하였으며, 각 band별 density는 image J software(NIH, Bethesda, MD, USA)를 사용하여 정량하였다. PCR 증폭을 위해 사용된 primer는 다음과 같다; ADIPOQ sense(5’-ACCCAAGGGAACTTGTGCAG-3’), ADIPOQ anti-sense(5’-GAGTCCCGGAATGTTGCAGT-3’), C/EBPα sense(5’-CCCCACTTGCAGTTCCAGAT-3’), C/EBPα anti-sense(5’-CACCTTCTGTTGCGTCTCCA-3’), PPARγ sense(5’-TCAGAAGTGCCTTGCTGTGG-3’), PPARγ anti-sense(5’-CGGCTTCTACGGATCGAAAC-3’).
- 전체 RNA 분리는 TRIzol reagent를 이용하였으며 제조회사의 방법에 준하였다(20). cDNA는 RNA to cDNA EcodryTM premix를 이용하여 합성하였고, EmeraldAmp GT PCR Master Mix를 이용하여 PCR 기기(TP-600, Takara)에서 30 cycles 동안 증폭하였다. 각각의 cycle은 98°C에서 20초간 denaturation 시킨 후 56.
- acidophilus(BLO)]를 10% dimethyl sulfoxide(DMSO)를 포함한 PBS에 녹여 사용하였다. 동물실험에서는 고지방사료(high fat diet)에 5%씩 첨가한 사료를 (주)피드랩(Gyeonggi, Korea)에서 제조하여 급여하였다. 실험에 사용한 DMEM 배지, fetal bovine serum(FBS), bovine calf serum(BCS)은 Gibco(Grand Island, NY, USA)에서 구입하였으며, insulin, IBMX, DEX, DMSO 등은 Sigma-Aldrich Co.
- 동일한 방법으로 3회 세척 후 50 μL/well씩 chromogenic substrate 용액을 가하여 실온에서 30분동안 반응시킨 다음 50 μL의 stop solution을 가하여 반응을 정지시키고, ELISA reader로 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
- 따라서 본 연구에서는 유의적으로 세포독성을 나타내지 않는 50 μg/mL 이하의 농도에서 실험을 진행하였다.
- 발효된 콩 10 g에 90 mL의 멸균수를 넣고 bag mixer를 사용하여 균일하게 섞은 후 Bacillus 속은 LB agar 배지에, Lactobacillus 속은 MRS agar의 평판배지에 각각 BS 균주를 활용한 발효콩은 37°C, BA 균주를 활용한 발효콩은 28°C, LBA 균주를 활용한 발효콩은 37°C, LBP를 활용한 발효콩은 28°C에 18~24시간 배양한 후 생균수를 측정하였다.
- 발효콩 분말의 유지 추출은 각 샘플 50 g을 잘게 분쇄한 후 1차 추출용매(hexane : acetone=85:15) 150 mL와 함께 혼합하여 50°C가 유지된 이중 자켓 플라스크에 넣어 교반기(EYELA, Tokyo, Japan)를 활용하여 300 rpm으로 1시간 30분 동안 추출한 후 1차 추출용매를 제거하고, 2차 추출용매(100% acetone) 150 mL와 1차 추출용매가 제거된 발효콩 분말을 50°C가 유지된 이중 자켓 플라스크에 넣고 교반기(EYELA NZ)를 활용하여 300 rpm으로 1시간 30분 동안 추출하였다.
- 발효콩의 건조방법: 발효된 콩은 건조를 위하여 freeze dryer(Ilshin, Gyeonggi, Korea)를 사용하여 건조하였다. 이때 샘플 건조 plate 온도는 35°C, 콜드트랩 온도는 -70°C 이하로 설정하고 건조하였다.
- 분화유도 후에 세포배양액을 IBMX와 DEX를 제외한 5 μg/mL insulin과 10% FBS를 포함하는 분화유지 배지로 교환하여 48시간 배양한 후, 10% FBS만을 포함하는 DMEM 배지로 교환하여 배양하였다.
- 선별된 콩은 100 g씩 계량하여 멸균된 밀폐 용기(Lock & Lock, Seoul, Korea)에 담았고, 물을 2배 첨가하여 121°C에서 20분간 살균 후 그 위에 본 배양된 균주를 접종하였다.
- 분화유도 후에 세포배양액을 IBMX와 DEX를 제외한 5 μg/mL insulin과 10% FBS를 포함하는 분화유지 배지로 교환하여 48시간 배양한 후, 10% FBS만을 포함하는 DMEM 배지로 교환하여 배양하였다. 세포분화 과정 동안 시료의 효과를 확인하기 위해서 MDI와 함께 시료를 처리하였고, 분화여부는 유도 8일 후에 확인하였다.
- 세포생존율을 알아보기 위해 배양 중인 3T3-L1 지방전구세포를 96-well plate에 5×104 cells/well이 되도록 세포수를 조정한 다음, 시료를 10, 50, 100 μg/mL가 되도록 처리한 후 24시간 동안 37°C의 5% CO2 배양기 내에서 배양하였다.
- 실험동물 설계 및 식이: C57BL/6J(4 wks, ♂) 생쥐를 1주일간 기본식이로 적응시킨 후, 난괴법에 따라 각 군당 6마리씩 7군[정상식이군(N), 고지방식이군(C), NF군, BA군, BS군, LBA군, BLO]으로 나누어 실시하였다. 정상군(N)은 (주)중앙실험동물(Seoul, Korea)에서 판매하는 AIN-93G purified rodent diet를 자유 급여시켰으며, 정상군을 제외한 모든 실험군은 고지방 사료로 lard를 첨가하여 열량을 45% kcal fat 증가시킨 Modified AIN 76A purified rodent diet(45% kcal fat)를 사용하였으며, 고지방사료에 각각의 발효콩 분말을 5% 첨가하여 (주)피드랩에서 제조하여 급여하였다(Table 1).
- 실험동물 설계 및 식이: C57BL/6J(4 wks, ♂) 생쥐를 1주일간 기본식이로 적응시킨 후, 난괴법에 따라 각 군당 6마리씩 7군[정상식이군(N), 고지방식이군(C), NF군, BA군, BS군, LBA군, BLO]으로 나누어 실시하였다. 정상군(N)은 (주)중앙실험동물(Seoul, Korea)에서 판매하는 AIN-93G purified rodent diet를 자유 급여시켰으며, 정상군을 제외한 모든 실험군은 고지방 사료로 lard를 첨가하여 열량을 45% kcal fat 증가시킨 Modified AIN 76A purified rodent diet(45% kcal fat)를 사용하였으며, 고지방사료에 각각의 발효콩 분말을 5% 첨가하여 (주)피드랩에서 제조하여 급여하였다(Table 1).
- 지방세포분화 관련인자들의 발현 조절에 미치는 영향을 보기 위해 각 시료를 10, 50 μg/mL 농도로 처리한 후 지방세포 분화와 관련된 유전자들의 mRNA 발현을 분석하였다.
- 체중증가율 및 식이효율: 사육기간에 주 1회 간격으로 체중을 측정하여 최종 체중에서 실험 개시 체중을 감한 후 실험개시 전의 체중으로 나누어 체중증가율로 표시하였고 식이 섭취량도 주 1회 간격으로 측정하였으며, 체중증가량을 동일 기간의 식이 섭취량으로 나누어 각 실험군의 식이효율을 구하였다.
- 혈청 내 비만관련 호르몬(adiponectin, leptin, insulin) 측정: 혈청 내 adiponectin 측정은 mouse/rat HMW adiponectin ELISA kit(Shibayagi Co., Ltd., Gunma, Japan)을 이용하여 측정하였다. Anti-mouse adiponectin antibody로 코팅된 microplate의 각 well을 혈청 시료 50 μL를 첨가하여 2시간 동안 실온에서 반응시킨 후 wash buffer(300 μL/well)로 3회 세척한 다음, HRP-conjugated anti-adi-ponectin antibody(50 μL/well)를 첨가한 후 실온에서 90분간 반응시켰다.
- 혈청 지질 함량 측정: 실험종료 후 각 군의 생쥐에서 혈액을 채취하여 혈청을 분리한 후 중성지방, HDL-콜레스테롤, 총콜레스테롤을 아산키트(Asan Pharm.)로 측정하였으며 LDL-콜레스테롤 농도와 동맥경화 지수(atherogenic index, AI)는 다음과 같은 식을 이용하여 구하였다(21,22).
대상 데이터
- C57BL/6J 생쥐(18±2 g, ♂)는 (주)샘타코(Gyeonggi, Korea)에서 분양받아 항온항습(22±2°C, 55± 5% RH, 12 h/12 h light/dark cycles) 조건에서 1주일간 사육실에서 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
- 발효 전처리 및 발효방법: 국산 콩을 믹서(후드믹서 HMF, Hanil, Seoul, Korea)를 이용하여 2~3 mm 크기로 분쇄한 후 체눈(testing sieve, 2.8 mm, Chung Gye Sang Gong, Seoul, Korea)으로 걸러 일정한 사이즈의 콩만을 선별하였다. 선별된 콩은 100 g씩 계량하여 멸균된 밀폐 용기(Lock & Lock, Seoul, Korea)에 담았고, 물을 2배 첨가하여 121°C에서 20분간 살균 후 그 위에 본 배양된 균주를 접종하였다.
- 본 실험에 사용한 콩은 2013년에 재배한 국내산 콩을 구입하였으며, 실험 기간 중 부패 및 산패를 방지하기 위하여 저온 냉장고에 보관하였다.
- 본 연구에 사용된 시료는 시판되는 콩기름 1종(soybean oil; SO), (주)농심(Seoul, Korea)에서 공급받은 비발효 콩기름 1종(non-fermented soybean oil; NF), 그리고 발효조건을 달리하여 자체 개발한 4종의 유지[B. amyloliquefaciens(BA), B. subtilis(BS), L. acidophilus(LBA), B.subtilis+L. acidophilus(BLO)]를 10% dimethyl sulfoxide(DMSO)를 포함한 PBS에 녹여 사용하였다. 동물실험에서는 고지방사료(high fat diet)에 5%씩 첨가한 사료를 (주)피드랩(Gyeonggi, Korea)에서 제조하여 급여하였다.
- 평창 낫또 제품 2 g을 멸균수 10 mL에 현탁시킨 후, 30°C, 200 rpm 조건에서 1시간 배양(Shaking incubator SI-600R, JEIO TECH, Daejeon, Korea)한 후 배양된 균주 중 50 μL를 제조된 고체 영양 배지(Nutrient broth, REF234000, Difco, Detroit, MI, USA)에 도말하여 37°C에서 18~24시간, 200 rpm 조건에서 배양하였다. 분리된 균주는 균주 동정 의뢰를 하여 균주 여부를 확인하였으며, 그 외의 isoflavone glycoside를 isoflavone aglycon으로 전환하는 효소를 생산할 수 있는 능력이 있는 균주의 확보를 위해 B. amyloliquefaciens(KCCM 40764), L. acidophilus(KCCM 32820)는 한국미생물보존센터(Seoul, Korea)에 분양받아 사용하였다.
- 중성지방 측정시액, HDL-콜레스테롤, 총콜레스테롤 측정시액은 아산제약(Gyeonggi, Korea)에서 구입하였고, RNA to cDNA EcodryTM premix는 Clontech(Mountain View, CA, USA), Emerald Amp GT PCR Master Mix는 Takara(Shiga, Japan)에서 구입하였다. 사용기기는 도립 현미경(Axiovert-25C, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany), UV-분광광도계(OPTIZEN, Mecasys, Daejeon, Korea), microplate reader(VERSAmax, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA), PCR 기기(TP-600, Takara)를 사용하였다.
- 시중에 판매되는 평창 낫또(부일 F&B, 강원도 평창군) 제품으로부터 B. subtilis 균주를 분리하였다.
- 실험에 사용된 시료는 일반 해바라기씨유(sunflower oil; SO), 비발효 콩유지(non-fermented oil), B. amyloliquefaciens를 접종하여 조제한 발효콩 유지(BA), B. subtilis를 접종하여 조제한 발효콩 유지(BS), L. acidophilus를 접종하여 조제한 발효콩 유지(LBA), 그리고 BA+LBA 혼합 발효콩 유지(BLO)를 (주)농심에서 공급받아 세포실험에 사용하였으며 조제사료는 고지방사료에 일반 식용유, 비발효 및 각 발효콩 분말을 5% 첨가하여 (주)피드랩에서 제조하여 동물실험에 사용하였다.
- 실험에 사용한 마우스 유래 3T3-L1 지방전구세포주는 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA, USA)으로부터 분양받아 CO2 배양기(37°C, 5% CO2)에서 10% BCS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 배양하였으며, 70~80% confluent 상태에서 계대배양 하여 실험에 사용하였다.
- Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 중성지방 측정시액, HDL-콜레스테롤, 총콜레스테롤 측정시액은 아산제약(Gyeonggi, Korea)에서 구입하였고, RNA to cDNA EcodryTM premix는 Clontech(Mountain View, CA, USA), Emerald Amp GT PCR Master Mix는 Takara(Shiga, Japan)에서 구입하였다. 사용기기는 도립 현미경(Axiovert-25C, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany), UV-분광광도계(OPTIZEN, Mecasys, Daejeon, Korea), microplate reader(VERSAmax, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA), PCR 기기(TP-600, Takara)를 사용하였다.
- 평창 낫또 제품 2 g을 멸균수 10 mL에 현탁시킨 후, 30°C, 200 rpm 조건에서 1시간 배양(Shaking incubator SI-600R, JEIO TECH, Daejeon, Korea)한 후 배양된 균주 중 50 μL를 제조된 고체 영양 배지(Nutrient broth, REF234000, Difco, Detroit, MI, USA)에 도말하여 37°C에서 18~24시간, 200 rpm 조건에서 배양하였다.
- 평창 낫또에서 분리된 B. subtilis와 B. amyloliquefaciens는 Luria Bertani media broth 2 mL에 접종하여 각 37°C와 28°C, 200 rpm 조건에서 전 배양한 균주는 Luria Bertani media broth 200 mL에 모두 접종 후 동일한 조건에서 본 배양하였다.
데이터처리
- Significant differences were determined by Student’s t-test.
- 통계처리는 Student’s t-test로 시행하였으며, P<0.05 수준에서 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- Effect of fermented oils on the cell viability of 3T3-L1 pre-adipocytes. 3T3-L1 cells were treated with several fermented soybean oils and incubated for 24 h, and the cell viability was determined by MTT method. The optical density of each well was measured at 570 nm with a microplate reader.
- 분화 유도시킨 3T3-L1의 세포 lysate 내 중성지방량을 알아보기 위해 중성지방 측정시액(Asan Pharm., Seoul, Korea)을 사용하여 측정하였으며, 실험방법은 제조회사의 지시에 준하였다. 세포를 분리하여 homogenizer로 분쇄하고 sonication 한 후 원심분리(12,000 rpm, 10 min, 4°C)하여 상층액을 분리하였다.
- 2×105 cells/well)에 시료를 첨가한 다음 8일 후에 RNA를 분리하였다. 전체 RNA 분리는 TRIzol reagent를 이용하였으며 제조회사의 방법에 준하였다(20). cDNA는 RNA to cDNA EcodryTM premix를 이용하여 합성하였고, EmeraldAmp GT PCR Master Mix를 이용하여 PCR 기기(TP-600, Takara)에서 30 cycles 동안 증폭하였다.
성능/효과
- 3T3-L1 지방전구세포를 분화유도 시킨 후 세포 내 triglyceride 함량을 측정한 결과, 모든 실험군에서 양성대조군 control(+)에 비하여 세포 내 triglyceride 함량이 감소하였다(Fig. 2). Control(+)은 75.
- 3T3-L1 지방전구세포에 발효콩 유지를 처리하여 세포생존율을 측정한 결과, NF군 100 μg/mL에서 3T3-L1 지방전구세포의 생존율을 유의적으로 감소시켜 세포독성이 나타났다.
- 3T3-L1 지방전구세포에서 발효콩 유지의 처리에 따른 세포독성을 알아보기 위해서 MTT assay를 실시하여 세포생존율을 측정한 결과, 발효콩 유지 10, 50, 100 μg/mL를 처리한 모든 실험군에서 90% 이상의 높은 생존율을 나타내었으나, 지방세포 분화 억제 활성이 있는 100 μg/mL에서 NF군이 대조군과 유의적인 차이(P<0.05)를 나타내어 세포독성이 관찰되었다(Fig. 1).
- 5%로 유의적으로 감소하였다. 4주간의 실험기간 동안의 생쥐 마리당 식이효율은 N군이 0.20, C군은 0.28로 C군이 N군보다 높았으며, NF, BLO군은 0.27, SO, BA, BS, LBA군은 0.28로 C군과 큰 차이를 나타내지 않았다.
- 6% 감소하였다. BS, LBA, BLO군은 C군에 비해 각각 10.5%, 12.3%, 11.5%로 유의적으로 감소하였다. 4주간의 실험기간 동안의 생쥐 마리당 식이효율은 N군이 0.
- 7% 증가하는 경향을 보였으나 유의성은 보이지 않았다. BS군, LBA군 그리고 BLO군은 C군에 비해 유의성 있게 각각 24.1%, 32.4%, 35.2% 증가하였다(Table 4).
- C(+)군에 비하여 ADIPOQ mRNA 발현이 BA, BS, LBA, BS 그리고 BLO군에서 발현이 각각 72.5%, 58.8%, 78.4%, 86.3%로 농도 의존적으로 증가하였다(Fig. 3).
- Control(+)은 75.4 mg/dL로 control(-)군에 비하여 유의적으로 증가하였고 실험군은 모두 유의적으로 감소하였으며, 특히 50 μg/mL의 BS, LBA, BLO군에서 control(+)에 비해 각 16.6%, 15.4%, 20.6%로 triglyceride 함량이 유의적으로 감소하였다(P<0.001).
- C군(111.7 mg/dL)에 비해 SO군(98.2 mg/dL), LBA군(92.2 mg/dL), BLO군(86.3 mg/dL)에서 각각 12.1%, 17.5%, 22.7% 감소하여 혈중 중성지방 농도가 유의하게 낮음을 확인할 수 있었다(P<0.05).
- LBA군(174.9 mg/dL)의 혈중 총콜레스테롤의 함량이 C군(198.0 mg/dL)에서보다 유의하게 감소하였으며, 특히 BLO군에서 170.8 mg/dL로 C군에 비해 13.7% 감소하였다(P<0.05)(Table 3).
- 05). NF군은 557.4 pg/mL로 C군보다 증가하였고 모든 실험군에서는 감소하는 경향을 보였는데, 특히 BS, BLO군에서 C군에 비해 17%, 17.9% 감소하였다(Table 4).
- NF군을 제외한 나머지 SO군, BA군, BS군, LBA군, BLO군에서 각각 53.8, 53.5, 53.0, 51.6, 51.0 ng/mL로 유의적으로 감소하는 경향을 나타내었다(P<0.05).
- 그리고 adiponectin 유전자의 발현은 농도 의존적으로 증가시켰다. 고지방식이로 비만을 유도한 C57BL/6J 생쥐를 이용하여 항비만 활성을 관찰한 결과, 총 체중증가량은 대조군에 비해 4주째에 감소하는 경향이 나타났다. 혈액 내 지질농도를 측정한 결과 중성지방, 총콜레스테롤, LDL-콜레스테롤 함량은 LBA, BLO군에서 유의적으로 낮게 나타났으며(P<0.
- 05), HDL-콜레스테롤 함량은 대조군보다 증가하였으나 유의적인 차이는 나타나지 않았다. 동맥경화 지수인 AI(atherogenic index)는 대조군보다 감소시키는 경향을 보였다. 비만관련 호르몬인 adiponectin의 농도는 SO, BS, LBA, BLO군에서 유의적으로 증가하였고(P<0.
- Leptin은 대조군보다 감소하였으나 유의적인 차이는 나타나지 않았다. 따라서 이러한 결과를 종합하여 볼 때 발효콩 유지가 3T3-L1 지방전구세포의 mRNA 단계에서부터 지방분화를 억제하여 항비만 활성을 가지고 있는 것으로 추정되고, 고지방식이로 비만이 유도된 C57BL/6J 생쥐에서 총체중을 감소시키고, 혈액 내 지질농도인 triglyceride와 총콜레스테롤, LDL-콜레스테롤 및 HDL-콜레스테롤과 비만관련 호르몬인 adiponectin, insulin, leptin을 조절하여 항비만 활성을 가지고 있는 것으로 확인되었다. 이 결과로 발효콩 유지가 항비만 생리활성을 나타내는 새로운 식품 소재로서 이를 활용한 기능성 식품 개발의 가능성이 있다고 생각된다.
- 또한, BS군, LBA군, BLO군 순으로 지방세포분화 관련 유전자인 PPARγ의 mRNA 발현을 농도 의존적으로 감소시켰으며, PPARγ 유전자와 상관관계에 있는 C/EBPα 유전자도 농도 의존적으로 감소시켰다.
- 모든 실험군에서의 AI 수치는 C군보다 낮은 결과가 나왔으며, 특히 BS, LBA, BLO군에서 C군보다 유의적으로 낮은 결과를 보였다(P<0.05).
- 발효 유지의 3T3-L1 세포 내 PPARγ mRNA 발현에 미치는 영향을 알아본 결과, 분화를 유도한 대조군인 C(+)군에서 발현이 증가하였고, 분화과정에서 SO군과 NF군에서 최대 10.9%, 9.8% 감소하였으나, BS, LBA, BLO군에서 최대 31.5%, 26.1%, 54.3%로 mRNA 발현이 감소하였음을 확인하였다(Fig. 3).
- 발효 유지의 C/EBPα mRNA 발현에 미치는 영향은 C(+)군에서 C/EBPα 유전자 발현이 증가하였으며, 실험군 간의 차이는 크게 나타나지 않았으나 SO군보다 NF군에서 조금 더 감소하였으며, BA, BS, LBA, BLO군에서 감소하였다(Fig. 3).
- 발효콩 유지 함유 고지방식이를 섭취한 마우스의 체중을 측정한 결과, 4주 동안의 체중증가량은 고지방 사료를 섭취한 C군이 N군에 비해 약 80% 이상 유의적으로 증가하여 고지방식이로 인하여 비만이 유도되었음을 알 수 있었다. BS, LBA, BLO군에서는 C군에 비해 각각 9.
- 본 연구에서도 C군이 N군보다 유의적으로 감소하였으며 (P<0.01), 실험군 간 차이는 크지 않았으나 C군보다 유의적으로 감소하였다(P<0.05).
- 3T3-L1 지방전구세포에 발효콩 유지를 처리하여 세포생존율을 측정한 결과, NF군 100 μg/mL에서 3T3-L1 지방전구세포의 생존율을 유의적으로 감소시켜 세포독성이 나타났다. 분화를 유도한 다음 세포 내 triglyceride 함량을 측정한 결과, 비발효콩 유지(NF) 처리군보다 발효콩 유지처리군에서 triglyceride 함량 저해 효과가 높게나타났으며, 특히 BS, LBA, BLO군 순으로 높게 나타났다. 또한, BS군, LBA군, BLO군 순으로 지방세포분화 관련 유전자인 PPARγ의 mRNA 발현을 농도 의존적으로 감소시켰으며, PPARγ 유전자와 상관관계에 있는 C/EBPα 유전자도 농도 의존적으로 감소시켰다.
- 비만관련 호르몬인 adiponectin의 농도는 SO, BS, LBA, BLO군에서 유의적으로 증가하였고(P<0.05), insulin 농도는 유의적으로 감소하였다(P<0.05).
- 지방세포 분화 후기에 특이적으로 발현되어 분비되는 adiponectin은 BA, LBA, BS 그리고 BLO군에서 발현이 증가하였다. 위의 결과로 3T3-L1 세포에서 발효콩 유지가 3T3-L1 지방세포의 분화를 억제하는 것을 확인할 수 있었으며 BLO, BS, LBA군 순으로 효과가 높게 나타난 것으로 확인하였다.
- 혈액 내 LDL-콜레스테롤의 농도는 C군에 비해 BA, BS 그리고 LBA군은 각각 23.5%, 33.9%, 35.2%가 감소하였으며, 특히 BLO군에서 C군에 비해 43.4%로 유의하게 감소하였다(P<0.05)(Table 3).
- 혈액 내 중성지방인 triglyceride의 농도를 측정한 결과는 Table 3과 같다. 혈액 내 중성지방은 고지방식이에 의해 가장 큰 영향을 받는데 N군에 비해 C군의 중성지방 농도가 86.8% 증가하여 유의적으로 높아졌음을 확인할 수 있었다. C군(111.
- 혈액 내 지질농도를 측정한 결과 중성지방, 총콜레스테롤, LDL-콜레스테롤 함량은 LBA, BLO군에서 유의적으로 낮게 나타났으며(P<0.05), HDL-콜레스테롤 함량은 대조군보다 증가하였으나 유의적인 차이는 나타나지 않았다.
- 혈청 인슐린 농도는 C군이 67.7 ng/mL로 N군의 32.5 ng/mL보다 유의적으로 증가 하였으며(P<0.01), NF군을 제외한 SO, BA, BS, LBA, BLO군에서 각각 53.8, 53.5, 53.0, 51.6, 51.0 ng/mL로 C군에 비해 각각 20.5%, 21.0%, 21.7%, 23.8%, 24.7%가 유의적으로 감소하였다(P<0.05).
후속연구
- 따라서 이러한 결과를 종합하여 볼 때 발효콩 유지가 3T3-L1 지방전구세포의 mRNA 단계에서부터 지방분화를 억제하여 항비만 활성을 가지고 있는 것으로 추정되고, 고지방식이로 비만이 유도된 C57BL/6J 생쥐에서 총체중을 감소시키고, 혈액 내 지질농도인 triglyceride와 총콜레스테롤, LDL-콜레스테롤 및 HDL-콜레스테롤과 비만관련 호르몬인 adiponectin, insulin, leptin을 조절하여 항비만 활성을 가지고 있는 것으로 확인되었다. 이 결과로 발효콩 유지가 항비만 생리활성을 나타내는 새로운 식품 소재로서 이를 활용한 기능성 식품 개발의 가능성이 있다고 생각된다.
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