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문제 정의
- 따라서 본 연구는 고지방식이에 뽕잎, 누에, 오디, 꾸지뽕 분말을 첨가한 식이를 마우스에 급여했을 때 고지방식이에 의해 유도되는 제2형 당뇨의 임상적 지표 및 인슐린 신호전달체계에 미치는 영향을 분석하고자 시행되었다.
- 본 연구는 고지방식이로 유도된 제2형 당뇨 동물모델에서 잠상산물의 항당뇨 및 지질개선 효과를 규명하기 위하여 C57BL/6N 마우스에 14주간 잠상산물 분말(ML, SK, MF, CT)을 급여한 후 제2형 당뇨의 임상적 지표 및 인슐린 신호 전달체계에 미치는 영향을 분석하였다. HFD군보다 잠상산물을 급여한 군들의 체중증가량이 감소하는 경향이었으며, 혈장 포도당 및 인슐린 농도는 HFD군보다 ML분말을 급여한 군에서 특히 감소하였다.
제안 방법
- 1% Tris-buffered salinetween-20(TBST)로 3번 세척한 후 1:1,000 비율로 희석한 2차 항체(horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA,USA)를 실온에서 1시간 반응시켰다. 0.1% TBST로 3번세척한 후 enhanced luminol-based chemiluminescent kit(Bio Science Technology, Pohang, Korea)을 사용하여 암실에서 medical X-ray film(CP-BU new; AGFA)에 노출해 현상하였다. Launch Vision Works LS 프로그램(Gel Doc 2000, Bio-Rad Laboratories, Hercules, Italy)을 이용하여 band를 정량하였다.
- 1% TBST로 3번세척한 후 enhanced luminol-based chemiluminescent kit(Bio Science Technology, Pohang, Korea)을 사용하여 암실에서 medical X-ray film(CP-BU new; AGFA)에 노출해 현상하였다. Launch Vision Works LS 프로그램(Gel Doc 2000, Bio-Rad Laboratories, Hercules, Italy)을 이용하여 band를 정량하였다.
- 실험동물은 12시간 명암주기를 유지하고, 항온(25±2°C), 항습(50±5%) 환경에서 사육하였다. 마우스는 1주 동안 고형사료를 급여하여 실험환경에 적응시킨 후 난괴법(randomized complete block design)에 따라 다음과 같이 6군으로 분류하였다: 정상 식이를 공급한 정상식이군(normal diet, ND, n=7); 고지방 식이를 공급한 고지방식이군(high fat diet, HFD, n=10); HFD에 5% ML분말을 혼합한식이급여군(ML, n=10); HFD에 2% SK분말을 혼합한 식이 급여군(SK, n=10); HFD에 5% MF분말을 혼합한 식이급여군(MF, n=10); HFD에 5% CT분말을 혼합한 식이급여군(CT, n=10). SK분말을 다른 잠상산물 분말과 달리 식이에2%로 혼합한 이유는 본 연구의 예비실험 결과 SK분말을 5%로 혼합하였을 때 실험식이 섭취량이 다른 실험식이보다 현저히 낮아 본 실험에서는 2%로 낮추어 혼합하였다.
- 분석에 사용한 내장지방 조직은 RIPA buffer(0.1% SDS,1% Triton X-100, 0.5% Sodium deoxycholate, 50 mMTris(pH 7.5), 150 mM NaCl, 50 mM NaF, 0.5 M EDTA,0.1 M EGTA)를 사용하여 총단백질을 용리시켜 균질화하였으며, BCA protein assay kit(Thermo, Rockford, IL,USA)을 이용하여 단백질 정량을 하였다. 정량한 단백질은 10% SDS-PAGE에서 단백질을 분리한 후 gel을 poly-vinylidine difluoride membrane(PVDF, Sigma-Aldrich Co.
- 식이 섭취량은 실험기간 동안 매일, 그리고 체중은 주 1회 일정 시각에 측정하였다. 식이 섭취량은 식이 공급량에서 잔량을 감하여 계산하였고, 식이 효율은 체중증가량(g/d)/식이 섭취량(g/d)으로 계산하였다. 본 동물실험은 대구가톨릭대학교 동물실험윤리위원회에서 승인(승인번호 제IACUC-2015-022호)한 절차에 따라 수행하였다.
- 실험기간에 식이와 물은 자유롭게 섭취하도록 하였다. 식이 섭취량은 실험기간 동안 매일, 그리고 체중은 주 1회 일정 시각에 측정하였다. 식이 섭취량은 식이 공급량에서 잔량을 감하여 계산하였고, 식이 효율은 체중증가량(g/d)/식이 섭취량(g/d)으로 계산하였다.
- SK분말을 다른 잠상산물 분말과 달리 식이에2%로 혼합한 이유는 본 연구의 예비실험 결과 SK분말을 5%로 혼합하였을 때 실험식이 섭취량이 다른 실험식이보다 현저히 낮아 본 실험에서는 2%로 낮추어 혼합하였다. 실험 식이는 AIN-76A diet에 기초하여 Table 1과 같이 제조하였으며 총 14주간 급여하였다. 실험기간에 식이와 물은 자유롭게 섭취하도록 하였다.
- 실험동물은 12시간 명암주기를 유지하고, 항온(25±2°C), 항습(50±5%) 환경에서 사육하였다.
- 채혈 후 즉시 간과 내장지방을 적출하여 생리식염수에 헹군 후 표면의 수분을 제거하고 무게를 측정하였으며 액체질소로 급속 동결하여 -80°C 급속냉동고에서 시료 분석 전까지 보관하였다.
- 혈장 글루코오스 농도와 인슐린 농도는 각각 글루코오스측정용 시액(Asan, Seoul, Korea)과 mouse insulin ELISAkit(U-type, Shibayagi Co., Ltd., Gunma, Japan)을 사용하여 측정하였다. 혈장 triglyceride(TG), total cholesterol(T-C) 및 high density lipoprotein cholesterol(HDL-C) 농도 측정은 각각 TG, T-C 및 HDL-C 측정용 시액(Asan)을 사용하였다.
- 희생 전 12시간 절식 후 실험동물은 CO2로 마취하여 개복하고 복부 대정맥으로부터 헤파린(1000 IU/mL) 처리된 주사기를 사용하여 채혈하였다. 혈액은 13,200 rpm, 4°C에서 10분간 원심 분리하여 혈장을 분리한 후 -80°C 급속냉동고에서 분석 전까지 보관하였다.
대상 데이터
- 본 연구에 사용한 뽕나무 열매 오디와 꾸지뽕 열매는 2014년 6월 및 10월 경북 영천과 경남 밀양에서 각각 노지 재배한 것을 수확 후 곧바로 동결건조기(PVTFD-20R, Ilshinbiobase, Dongducheon, Korea)에서 건조한 것을 사용하였으며, 뽕잎은 2014년 6월에 수확하여 곧바로 50°C 이하 열풍건조기(COBP-15S, Shinheung, Seoul, Korea)에서 건조한 것을, 그리고 누에는 같은 해 6월 뽕잎으로 키운 5령 3일째 누에를 동결건조한 것을 각각 공시재료로 사용하였다.
-
실험동물 및 실험식이
실험동물은 4주령 수컷 C57BL/6N 마우스 57마리를 오리엔트 바이오사(Busan, Korea)로부터 구입하여 사용하였다. 실험동물은 12시간 명암주기를 유지하고, 항온(25±2°C), 항습(50±5%) 환경에서 사육하였다.
- , Gunma, Japan)을 사용하여 측정하였다. 혈장 triglyceride(TG), total cholesterol(T-C) 및 high density lipoprotein cholesterol(HDL-C) 농도 측정은 각각 TG, T-C 및 HDL-C 측정용 시액(Asan)을 사용하였다.
데이터처리
- Means with different letters are significantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.
- Values with different letters above the bars are significantly different by ANOVA with Duncan’s multiple range test at P<0.05.
- 군별 유의성 검증을 위하여 analysis of variance(ANOVA) test를 하였고, 여러 군 간의 차이는 Duncan’s multiple range test에 의해 유의수준 P<0.05에서 사후검정을 하였다.
- 실험의 모든 결과는 SPSS(ver. 19, IBM, Armonk, NY,USA) 통계처리 프로그램을 사용하였고, 각 항목에 따라 평균값±표준오차(standard error, SE)를 구하였다.
이론/모형
- 간 조직의 TG 및 T-C 농도 측정을 위한 전처리는 Folch등(14)의 방법에 따라 다음과 같이 처리하였다. 간 조직 0.
- 잠상산물을 급여하였을 때 insulin signaling 관련 단백질들에 미치는 영향을 알아보기 위해 western blotting을 실시하였다. 내장지방에서 AKT, S6K, AMPK의 단백질 발현 수준을 조사한 결과, pAKT(Ser473)의 발현량은 ND군보다HFD군이 유의적으로 감소하였다(73%, Fig.
성능/효과
- 1)ND, normal diet; HFD, high fat diet; ML, 5% mulberry leave added in high fat diet; SK, 2% silkworm added in high fat diet; MF, 5% mulberry fruit added in high fat diet; CT, 5% Cudrania tricuspidata BUREAU added in high fat diet.
- 2B). HDL-C과 T-C 비율인 HTR은 HFD군보다 ML군과 SK군이 각각 3.2배, 3.3배로 현저히 증가하였고 MF군, CT군은 2.0배, 2.4배로 다소 증가하였다(Fig. 2C). 혈장 TG농도는 ND군(85±7 mg/dL)보다 HFD군이 73±3 mg/dL로다소 감소하였고, HFD군보다 ML군, SK군이 각각 58±2mg/dL, 56±9 mg/dL로 감소하는 경향을 보였으나 각 군 간의 유의적인 차이는 없었다(Fig.
- HFD군보다 ML군의 혈당이 101±7mg/dL로 유의적으로 감소하였으며, MF군은 108±18 mg/dL로 감소하는 경향을 보였으나 유의적인 차이는 없었다.
- 본 연구는 고지방식이로 유도된 제2형 당뇨 동물모델에서 잠상산물의 항당뇨 및 지질개선 효과를 규명하기 위하여 C57BL/6N 마우스에 14주간 잠상산물 분말(ML, SK, MF, CT)을 급여한 후 제2형 당뇨의 임상적 지표 및 인슐린 신호 전달체계에 미치는 영향을 분석하였다. HFD군보다 잠상산물을 급여한 군들의 체중증가량이 감소하는 경향이었으며, 혈장 포도당 및 인슐린 농도는 HFD군보다 ML분말을 급여한 군에서 특히 감소하였다. 혈장 T-C 농도는 HFD군에 비하여 ML과 SK 분말 급여 군에서 유의적으로 감소하였으며, 혈장 HDL-C 농도 및 HTR은 HFD군보다 ML군과 SK군에 서 현저히 증가하였다.
- ML군, MF군, CT군은 각각 0.58±0.007 mg/g liver, 0.62±0.019 mg/g liver, 0.57±0.055 mg/g liver로 HFD군보다유의적으로 감소하였다(Fig. 3A).
- 4). ML군과 MF군은 pAKT 단백질 발현이 HFD군보다 각각 312%, 211% 증가하였다. pS6K(Thr389)의 발현량은 ND군보다 HFD군이 유의적으로 감소하였으며(66%), HFD군보다 ML, MF군은 각각 165%, 212% 유의적으로 증가하였다.
- 마우스는 1주 동안 고형사료를 급여하여 실험환경에 적응시킨 후 난괴법(randomized complete block design)에 따라 다음과 같이 6군으로 분류하였다: 정상 식이를 공급한 정상식이군(normal diet, ND, n=7); 고지방 식이를 공급한 고지방식이군(high fat diet, HFD, n=10); HFD에 5% ML분말을 혼합한식이급여군(ML, n=10); HFD에 2% SK분말을 혼합한 식이 급여군(SK, n=10); HFD에 5% MF분말을 혼합한 식이급여군(MF, n=10); HFD에 5% CT분말을 혼합한 식이급여군(CT, n=10). SK분말을 다른 잠상산물 분말과 달리 식이에2%로 혼합한 이유는 본 연구의 예비실험 결과 SK분말을 5%로 혼합하였을 때 실험식이 섭취량이 다른 실험식이보다 현저히 낮아 본 실험에서는 2%로 낮추어 혼합하였다. 실험 식이는 AIN-76A diet에 기초하여 Table 1과 같이 제조하였으며 총 14주간 급여하였다.
- AMPK는 지방산과 콜레스테롤의 합성을 억제하고, 지방산 산화와 해당 과정을 촉진한다(37). pAMPK(Thr172)의 발현량은 ND군에 비하여 HFD군에서 감소하였으며, HFD군에 비하여 ML군, SK군, 그리고 CT군이 각각 144%, 126%, 179% 증가하였다.
- ML군과 MF군은 pAKT 단백질 발현이 HFD군보다 각각 312%, 211% 증가하였다. pS6K(Thr389)의 발현량은 ND군보다 HFD군이 유의적으로 감소하였으며(66%), HFD군보다 ML, MF군은 각각 165%, 212% 유의적으로 증가하였다. AMPK는 세포 내에서 에너지 항상성 유지의 센서 역할을 하는 효소로 AMP/ATP 비율이 증가하는 경우 활성화된다(36).
- 간 조직 T-C 농도 역시 ND군(0.33±0.007 mg/g liver)보다 HFD군(0.41±0.015mg/g liver)에서 유의적으로 증가하였으며, HFD군에 비해 ML군(0.37±0.013 mg/g liver), SK군(0.35±0.013 mg/gliver), MF군(0.34±0.009 mg/g liver), CT군(0.35±0.005mg/g liver)이 유의적으로 감소하였다.
- 간 조직 지질 농도는 Fig. 3에 보이는 바와 같이 TG 농도는 HFD군(1.08±0.062 mg/g liver)이 ND군(0.73±0.061mg/g liver)보다 유의적으로 증가하였으며, HFD군보다 SK군이 0.40±0.048 mg/g liver로 가장 크게 감소하였다.
- 혈장 T-C 농도는 HFD군에 비하여 ML과 SK 분말 급여 군에서 유의적으로 감소하였으며, 혈장 HDL-C 농도 및 HTR은 HFD군보다 ML군과 SK군에 서 현저히 증가하였다. 간 조직 지질 농도는 HFD군보다 잠상산물을 급여한 네 군 모두에서 TG와 T-C 농도의 유의적인 감소가 나타났다. 이상의 결과 잠상산물 중 ML분말이 혈장 포도당, 인슐린, T-C 및 TG 농도를 가장 효과적으로 감소시켰으며, 혈장 HDL-C 농도 및 HTR은 증가시켰다.
- 잠상산물을 급여하였을 때 insulin signaling 관련 단백질들에 미치는 영향을 알아보기 위해 western blotting을 실시하였다. 내장지방에서 AKT, S6K, AMPK의 단백질 발현 수준을 조사한 결과, pAKT(Ser473)의 발현량은 ND군보다HFD군이 유의적으로 감소하였다(73%, Fig. 4). ML군과 MF군은 pAKT 단백질 발현이 HFD군보다 각각 312%, 211% 증가하였다.
- 말초조직으로부터 간으로 콜레스테롤을 운반하는 HDL-C 농도는 ML군, SK군, MF군, CT군이 각각 186±28mg/dL, 209±28 mg/dL, 185±10 mg/dL, 196±6 mg/dL로 네 군 모두 HFD군(94±7 mg/dL)보다 유의적으로 높았다(Fig. 2B).
- 본 연구에서 MF와 CT 분말은 HDL-C 농도가 다소 증가한 것 외에 지질개선 효과가 명확하게 나타나지 않았으나 ML과 SK 분말의 지질개선 효과는 뚜렷하게 확인할 수 있었다.
- Park 등(12)의 보고에서는 고지방식이에 10% CT 잎 분말을 첨가한 식이를 5주간 흰쥐에 급여한 결과, 고지방식이를 준 대조군에 비하여 혈당이 유의적으로 감소하였으며, Cha 등(22)의 연구에서는 인슐린 비의존적 당뇨쥐 모델에서 8주 동안 CT 뿌리껍질(50 g/kg)을 급여한 쥐의 혈청 인슐린 농도가 유의적으로 증가하였다. 본 연구에서는 SK, MF, CT의 경우 앞선 연구 결과와는 달리 혈중 글루코오스 및 인슐린 농도의 뚜렷한 변화가 나타나지 않았으나, ML 섭취 시 혈당 및 혈중 인슐린 농도의 감소로 고혈당 증상이 개선되는 것이 확인되었다.
- Park 등(12)은 고지방식이를 5주 동안 급여한 후 5주 동안 CT 분말을 급여한 쥐의 체중증가량이 대조군보다 증가하는 경향을 보였으나 유의적인 차이는 없었다고 보고한 바 있다. 본 연구에서는 잠상산물을 급여한 군 중 ML군에서 가장 큰 체중감소(26%) 효과가 나타났다.
- 고지방식이를 급여한 쥐에서 p-S6K 단백질 발현량의 변화와 관련하여 Lu 등(39)의 연구에서 정상식이를 급여한 쥐에 비해 p-S6K 단백질 발현량의 감소가 보고되었으나, Reynolds 등(40) 및 Dasuri 등(41)의 연구에서는 정상식이를 급여한 쥐보다 각각 변화가 없거나 증가함을 보고한바 있다. 본 연구의 결과에서는 정상식이를 급여한 쥐보다 고지방식이를 급여한 쥐의 p-AKT, p-S6K 그리고 pAMPK의 단백질 발현량이 감소하였다.
- 실험동물들의 체중증가량은 HFD군이 ND군보다 유의적으로 증가하였으며, HFD군보다 잠상산물을 급여한 군들의 체중증가량이 다소 감소하는 경향을 보였다(Table 2). 식이 섭취량은 ND를 급여한 군들보다 고지방식이를 급여한 군들이 유의적으로 낮은 것에 반해 식이 효율은 ND군보다 고지방식이를 급여한 군들이 높은 경향을 보였다. 이러한 결과는 Lee 등(16)이 정상식이를 급여한 쥐보다 총열량의 50%를 지방으로 급여한 쥐의 식이 섭취량이 유의적으로 감소하였으나 에너지 섭취량, 체중증가량, 식이 효율은 현저히 증가하였다는 보고와 일치한다.
- 실험동물들의 체중증가량은 HFD군이 ND군보다 유의적으로 증가하였으며, HFD군보다 잠상산물을 급여한 군들의 체중증가량이 다소 감소하는 경향을 보였다(Table 2). 식이 섭취량은 ND를 급여한 군들보다 고지방식이를 급여한 군들이 유의적으로 낮은 것에 반해 식이 효율은 ND군보다 고지방식이를 급여한 군들이 높은 경향을 보였다.
- 간 조직 지질 농도는 HFD군보다 잠상산물을 급여한 네 군 모두에서 TG와 T-C 농도의 유의적인 감소가 나타났다. 이상의 결과 잠상산물 중 ML분말이 혈장 포도당, 인슐린, T-C 및 TG 농도를 가장 효과적으로 감소시켰으며, 혈장 HDL-C 농도 및 HTR은 증가시켰다. 또한, 내장지방 조직의 AKT, S6K, 그리고 AMPK의 활성도 증가시킨 것으로 보아 고지방식이에 의한 인슐린 저항성 및 지질 대사를 개선한 것으로 생각된다.
- 또한, CT 열매로부터 분리된 주요 이소플라보노이드인 6,8-diprenylgenistein을 고지방식이와 함께 6주 동안 급여한 결과, p-AMPKα와 p-AMPKβ의 단백질 및 mRNA 발현량이 대조군보다 증가한 것이 보고되었다(43). 이상의 결과를 종합하여 볼 때, ML 및 MF 분말은 insulin signaling 관련 단백질인 AKT 및 S6K의 활성을 증가시켜 인슐린 저항성을 개선하며, ML, SK, CT 분말은 AMPK 활성의 증가로 지질개선 효과를 나타내는 것으로 보인다.
- HFD군보다 잠상산물을 급여한 군들의 체중증가량이 감소하는 경향이었으며, 혈장 포도당 및 인슐린 농도는 HFD군보다 ML분말을 급여한 군에서 특히 감소하였다. 혈장 T-C 농도는 HFD군에 비하여 ML과 SK 분말 급여 군에서 유의적으로 감소하였으며, 혈장 HDL-C 농도 및 HTR은 HFD군보다 ML군과 SK군에 서 현저히 증가하였다. 간 조직 지질 농도는 HFD군보다 잠상산물을 급여한 네 군 모두에서 TG와 T-C 농도의 유의적인 감소가 나타났다.
- 혈장 T-C 농도는 ND군(135±8 mg/dL)보다 HFD군(239±25 mg/dL)에서 유의적으로 증가하였고, HFD군보다ML군(167±10 mg/dL)과 SK군(171±19 mg/dL)이 유의적으로 감소하였다(Fig. 2A).
- 혈장 TG농도는 ND군(85±7 mg/dL)보다 HFD군이 73±3 mg/dL로다소 감소하였고, HFD군보다 ML군, SK군이 각각 58±2mg/dL, 56±9 mg/dL로 감소하는 경향을 보였으나 각 군 간의 유의적인 차이는 없었다(Fig. 2D).
- 혈장 인슐린 농도는 ND군(0.52±0.04 μg/mL)보다 HFD군이 1.40±0.21 μg/mL로 유의적으로 증가하였으며, HFD군보다 ML군(0.73±0.12 μg/mL)이 유의적으로 감소하였다(Fig. 1B).
후속연구
- 또한, 내장지방 조직의 AKT, S6K, 그리고 AMPK의 활성도 증가시킨 것으로 보아 고지방식이에 의한 인슐린 저항성 및 지질 대사를 개선한 것으로 생각된다. 향후 ML의 인슐린 저항성 개선 효과에 대해 더 깊이 있는 기전연구가 수행된다면 제2형 당뇨환자를 위한 건강기능성 식품으로 개발될 수 있을 것으로 생각한다.
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