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문제 정의
- 본 연구에서는 curcumin의 인슐린 저항성 개선 가능성을 확인하고자 고지방식이 급여로 유도한 비만 마우스에서 curcumin의 혈당 조절 기능 및 간 조직의 인슐린 신호전달체계에 미치는 영향을 분석함으로써 향후 제 2형 당뇨 개선용 기능성 식품 개발에 대한 실험적 근거를 마련하고자 하였다.
- 본 연구에서는 고지방식이로 유도된 제2형 당뇨모델에서 curcumin의 항당뇨효과를 규명하기 위하여 C57BL/6 마우스에 16주 동안 0.02%의 curcumin을 급여한 후 체중, 혈당 및 지질의 변화를 확인하고 IGF-1 receptor를 통한 mTORC1 신호전달체계에 미치는 영향을 분석하였다. 체중증가량은 정상군과 curcumin 섭취군이 고지방식이군에 비하여 유의적으로 감소하였으며 혈장 포도당 및 인슐린 농도는 curcumin을 급여한 군이 고지방식이군에 비하여 유의적으로 감소하였다.
- 성인 당뇨환자의 약 90%는 제2형으로 비만으로 인한 인슐린 저항성 발생이 주요 원인이다. 본 연구에서는 제2형 당뇨 예방 및 관리를 위한 천연물 식품성분개발연구의 일환으로 식이성 비만 마우스에서 curcumin의 인슐린 저항성 개선을 통한 항비만, 항당뇨 효능을 확인하였다.
제안 방법
- 1% Tris-buffered saline tween-20(TBST)로 10분씩 3번 세척하고 1:1000 비율로 희석한 2차 항체(horseradish peroxidase–conjugated goat anti-rabbit, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)를 상온에서 1시간 반응시켰다. 0.1% TBST로 3번 세척한 후 enhanced luminol-based chemiluminescent kit(Bio Science technology, Pohang, Korea)를 이용하여 암실에서 medical X-ray film(CP-BU new; AGFA)에 노출시켜 현상하였다. Launch Vision Works LS 프로그램(Gel Doc 2000, Bio-Rad Laboratories, Hercules, Italy)을 이용하여 band를 정량하였다.
- Food intake was recorded daily throughout the experiment and body weight was measure once a week. Body weight gain was calculated by (final body weight-initial body weight)/experimental period (days) of each mouse.
- 1% TBST로 3번 세척한 후 enhanced luminol-based chemiluminescent kit(Bio Science technology, Pohang, Korea)를 이용하여 암실에서 medical X-ray film(CP-BU new; AGFA)에 노출시켜 현상하였다. Launch Vision Works LS 프로그램(Gel Doc 2000, Bio-Rad Laboratories, Hercules, Italy)을 이용하여 band를 정량하였다.
- First-strand complementary DNA (cDNA)는 PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa, Otsu, Japan)를 사용하여 합성하였다. Template cDNA는 SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa, Otsu, Japan)을 사용하여 유전자 발현 분석을 하였다. 각 유전자의 발현을 분석할 수 있는 primer는 Macrogen (Seoul, Korea)에서 합성하였다.
- 95℃에서 30초 동안 초기 denaturation 한 후에 95℃에서 5초, 60℃에서 30초를 1 cycle로 하여 40회 반응시켰다. 각 cycle 마다의 형광신호를 감지하여 나타내는 threshold cycle, C(t) 값을 분석하여 CFX96 real time system (Bio-rad, Hercules, CA, USA)으로 각 실험 군 간의 mRNA 발현을 정량분석 하였다. Internal transcription marker로는 GAPDH를 사용하였으며 증폭 시 사용한 gene primer 염기서열은 다음과 같다.
- 간 조직의 total RNA는 RNAiso Plus (TaKaRa, Otsu, Japan)을 이용하여 제조사의 설명에 따라 분리하였다. First-strand complementary DNA (cDNA)는 PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa, Otsu, Japan)를 사용하여 합성하였다.
- Table 4의 결과에서 나타난 바와 같이 고지방식이의 급여는 혈장 인슐린 농도를 상승시킨 반면 혈당은 오히려 ND군에 비해 증가하였다. 고지방식이의 급여가 인슐린 저항성을 유발하였는지, 그리고 curcumin 급여가 인슐린 저항성을 개선시켰는지를 확인하기 위하여 인슐린 신호전달체계에 관여하는 인슐린 유사 성장인자1수용체 (insulin like growth factor-1 receptor, IGF-1), p-Akt, p-S6K1의 단백질 발현 수준을 간 조직에서 분석하였다. IGF-1R와 p-Akt의 발현은 ND군보다 HFD군에서 증가하였으며, CUR군에서 가장 많이 발현 되었다(Fig.
- 동물 사육실의 온도는 25±2℃, 습도는 50±5%를 유지하였고 매일 광주기, 암주기를 12시간이 되도록 자동 조절한 환경에서 사육하였다.
- 실험동물은 4주령의 수컷 C57BL/6 마우스를 (주)코아텍(Busan, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 마우스는 1주일 간 고형사료를 공급하여 실험환경에 적응시킨 후, 난괴법(randomized complete block design)에 따라 총 3군으로 정상식이군(Normal diet, ND), 고지방식이군(High fat diet, HFD), curcumin급여군(HFD+0.02%curcumin, CUR)으로 분류하였다. 식이 성분 조성은 AIN-76A purified diet조성을 바탕으로 Table 1과 같이 제조하였고 총 16주 동안 급여하였다.
- 실험기간 중 식이와 물은 자유롭게 섭취하도록 하였다. 모든 실험 식이는 신선하게 공급하기 위해 1 kg씩 조제하여 냉동보관 하였다가 1일 1회로 일정 시간에 공급하였다. 식이섭취량은 실험기간 동안 매일 산정하였으며 체중은 1주일에 한 번씩 일정시간에 측정하였다.
- 본 연구결과에서 CUR군의 혈당농도가 HFD군에 비해 유의적으로 감소하였으므로 curcumin이 간조직으로의 포도당 유입을 촉진하는 역할을 했는지를 알아보기 위하여 간조직 포도당 수송체인 GLUT2 mRNA 수준을 측정하였다. Fig.
- 02%curcumin, CUR)으로 분류하였다. 식이 성분 조성은 AIN-76A purified diet조성을 바탕으로 Table 1과 같이 제조하였고 총 16주 동안 급여하였다. 실험기간 중 식이와 물은 자유롭게 섭취하도록 하였다.
- 식이섭취량은 실험기간 동안 매일 산정하였으며 체중은 1주일에 한 번씩 일정시간에 측정하였다. 식이섭취량은 식이 공급량에서 잔량을 감하여 계산하였고, 식이효율(food efficiency ratio, FER)은 체중 증가량(g/day)/식이섭취량(g/day)으로 계산하였다. 동물 사육실의 온도는 25±2℃, 습도는 50±5%를 유지하였고 매일 광주기, 암주기를 12시간이 되도록 자동 조절한 환경에서 사육하였다.
- 모든 실험 식이는 신선하게 공급하기 위해 1 kg씩 조제하여 냉동보관 하였다가 1일 1회로 일정 시간에 공급하였다. 식이섭취량은 실험기간 동안 매일 산정하였으며 체중은 1주일에 한 번씩 일정시간에 측정하였다. 식이섭취량은 식이 공급량에서 잔량을 감하여 계산하였고, 식이효율(food efficiency ratio, FER)은 체중 증가량(g/day)/식이섭취량(g/day)으로 계산하였다.
- 실험종료 전 12시간 절식 후, 실험동물은 CO2로 마취를 하고 개복하여 복부 대정맥으로부터 헤파린(1000 IU/mL) 처리된 주사기를 사용하여 채혈하였다. 혈액은 13,200 rpm, 4℃에서 10분간 원심 분리하여 혈장을 분리한 후 -80℃ 급속 냉동고에서 분석 전까지 보관하였다.
- 혈액은 13,200 rpm, 4℃에서 10분간 원심 분리하여 혈장을 분리한 후 -80℃ 급속 냉동고에서 분석 전까지 보관하였다. 채혈 후 간과 췌장, 골격근, 부고환지방, 내장지방, 피하지방을 각각 적출하여 생리식염수에 세척 후 표면의 수분을 제거하여 무게를 측정하였다. 액체질소에 급속 동결 한 다음 즉시 -80℃ 급속 냉동고에 보관하였다.
- 혈장 포도당 농도와 인슐린 농도는 각각 글루코즈 측정용 시액(Asan kit, Seoul, Korea)과 mouse insulin ELISA KIT(U-type)(Shibayagi Co., Ltd. Gunma, Japan)를 사용하여 ELISA reader로 측정하였다. 혈장 triglyceride(TG), total-cholesterol(T-C) 및 high density lipoprotein-cholesterol(HDL-C) 농도 측정은 각각 TG, T-C 및 HDL-C 측정용 시액(Asan)을 사용하였다.
대상 데이터
- 간 조직의 total RNA는 RNAiso Plus (TaKaRa, Otsu, Japan)을 이용하여 제조사의 설명에 따라 분리하였다. First-strand complementary DNA (cDNA)는 PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa, Otsu, Japan)를 사용하여 합성하였다. Template cDNA는 SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa, Otsu, Japan)을 사용하여 유전자 발현 분석을 하였다.
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1. 실험동물 및 실험식이
실험동물은 4주령의 수컷 C57BL/6 마우스를 (주)코아텍(Busan, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 마우스는 1주일 간 고형사료를 공급하여 실험환경에 적응시킨 후, 난괴법(randomized complete block design)에 따라 총 3군으로 정상식이군(Normal diet, ND), 고지방식이군(High fat diet, HFD), curcumin급여군(HFD+0.
- Gunma, Japan)를 사용하여 ELISA reader로 측정하였다. 혈장 triglyceride(TG), total-cholesterol(T-C) 및 high density lipoprotein-cholesterol(HDL-C) 농도 측정은 각각 TG, T-C 및 HDL-C 측정용 시액(Asan)을 사용하였다.
데이터처리
- 1)ND, normal diet; HFD, high fat diet; CUR, HFD+0.02%curcumin Means with different letters within a row are significantly different from each other at p<0.05 as determined by Duncan's multiple range test.
- Means with different letters within a row are significantly different from each other at p<0.05 as determined by Duncan's multiple range test.
- Values are Mean ± S.E. Means with different letters are significantly different from each other at p<0.05 as determined by Duncan's multiple range test.
- 각 군 간의 비교를 위해 ONE-Way ANOVA test를 하였고, 여러 군 간의 차이는 Duncan’s multiple range test를 하여 유의 수준 P값이 0.05 이하일 때 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
- 실험의 모든 측정값은 SPSS(ver. 19, IBM, Armonk, NY, USA) 통계 처리 프로그램을 사용하였고, 각 항목에 따라 평균값±표준오차(Standard error, S.E.)를 구하였다.
성능/효과
- 16주 동안 식이를 공급한 결과 실험동물들의 체중증가량은 HFD군이 ND군에 비하여 유의적으로 높았으며 CUR군의 체중증가량은 ND군 수준으로 감소하였다(Table 2). 식이 섭취량은 세 군 모두 비교하였을 때 유의적으로 차이가 나지 않았다.
- 식이급여실험 종료 후 혈장 지질 농도를 분석한 결과, 혈장 T-C 농도는 HFD군이 가장 높았고 CUR군은 ND군 수준으로 감소하였다(Table 3). HDL-C 농도는 CUR군이 다른 두 군과 비교하였을 때 유의적으로 높았으며, LDL-C 농도는 HFD군에서 가장 높았고 CUR군과 ND군이 같은 수준으로 나타났다. 혈장 TG 농도는 ND군과 HFD군의 유의적인 차이는 없었으며 CUR군(54.
- 혈장 T-C 농도는 고지방식이군에 비하여 curcumin 급여 군에서 유의적인 감소가 나타났다. HDL-C 농도는 curcumin섭취군이 고지방식이군과 비교하였을 때 유의적으로 높았으며 그와 반면에 LDL-C 농도는 고지방식이군에 비해 curcumin 섭취군이 유의적으로 낮았다. 또한 간 조직에서 IGF-1R와 Akt의 활성을 증가시킨 반면 S6K1 활성은 감소시킨 것으로 보아 insulin signaling을 증가시킴으로써 인슐린 저항성 및 지질대사를 개선시킨 것으로 사료된다.
- 고지방식이의 급여가 인슐린 저항성을 유발하였는지, 그리고 curcumin 급여가 인슐린 저항성을 개선시켰는지를 확인하기 위하여 인슐린 신호전달체계에 관여하는 인슐린 유사 성장인자1수용체 (insulin like growth factor-1 receptor, IGF-1), p-Akt, p-S6K1의 단백질 발현 수준을 간 조직에서 분석하였다. IGF-1R와 p-Akt의 발현은 ND군보다 HFD군에서 증가하였으며, CUR군에서 가장 많이 발현 되었다(Fig. 2). 반면, p-S6K1의 발현량은 ND군보다 HFD군에서 높았으며 CUR군에서 가장 낮았다.
- HDL-C 농도는 curcumin섭취군이 고지방식이군과 비교하였을 때 유의적으로 높았으며 그와 반면에 LDL-C 농도는 고지방식이군에 비해 curcumin 섭취군이 유의적으로 낮았다. 또한 간 조직에서 IGF-1R와 Akt의 활성을 증가시킨 반면 S6K1 활성은 감소시킨 것으로 보아 insulin signaling을 증가시킴으로써 인슐린 저항성 및 지질대사를 개선시킨 것으로 사료된다. 여러 임상시험결과, curcumin 중재는 건강한 정상인의 혈당에는 영향을 미치지 않는 반면 내당능장애와 같은 당뇨 전 단계나 제2형 당뇨환자의 혈당은 유의적으로 감소시키는 것으로 나타나[24-26] 앞으로 지속적으로 curcumin의 세포내 작용기전을 연구하여 당뇨 예방 및 치료를 위한 다양한 건강기능성 식의 약품으로 개발할 가치가 있을 것으로 사료된다.
- 고지방식이(지방함량: 총 칼로리의 60%)를 급여한 C57BL/6마우스에서 curcumin(80 mg/kg/day)을 12주 동안 매일 경구투여 하였을 때에는 체중, 혈액과 간 및 지방조직의 지방함량, 혈당, 그리고 인슐린 저항성 등이 고지방식이군에 비해 유의적으로 감소하였다[21]. 또한 근육조직에서 인슐린 자극에 대한 IRS-1과 Akt 단백질의 활성화가 증가되는 인슐린 신호체계의 개선도 보였다. C2C12 근육세포에서 curcumin의 처리는 세포막 GLUT4의 발현과 포도당 수송을 증가시켰고[22] streptozotocin으로 유도한 당뇨쥐에서는 췌장의 GLUT2 발현과 포도당 수송을 유지시킴으로써 혈당상승을 예방하였다[23].
- C2C12 근육세포에서 curcumin의 처리는 세포막 GLUT4의 발현과 포도당 수송을 증가시켰고[22] streptozotocin으로 유도한 당뇨쥐에서는 췌장의 GLUT2 발현과 포도당 수송을 유지시킴으로써 혈당상승을 예방하였다[23]. 본 연구모델에서는 고지방식이급여에 의해 증가된 체중, 혈당, 혈장 지질함량, 인슐린 저항성이 0.02% curcumin 첨가에 의해 감소함을 보인 반면 혈당조절에 가장 중요한 역할을 하는 장기중의 하나인 간 조직에서 인슐린 민감도와 GLUT2 발현이 증가함을 보임으로써 curcumin이 간조직 포도당 수송과 이용에도 좋은 효과를 나타냄을 보였다는데 의의가 있다.
- 식이급여실험 종료 후 혈장 지질 농도를 분석한 결과, 혈장 T-C 농도는 HFD군이 가장 높았고 CUR군은 ND군 수준으로 감소하였다(Table 3). HDL-C 농도는 CUR군이 다른 두 군과 비교하였을 때 유의적으로 높았으며, LDL-C 농도는 HFD군에서 가장 높았고 CUR군과 ND군이 같은 수준으로 나타났다.
- 02%의 curcumin을 급여한 후 체중, 혈당 및 지질의 변화를 확인하고 IGF-1 receptor를 통한 mTORC1 신호전달체계에 미치는 영향을 분석하였다. 체중증가량은 정상군과 curcumin 섭취군이 고지방식이군에 비하여 유의적으로 감소하였으며 혈장 포도당 및 인슐린 농도는 curcumin을 급여한 군이 고지방식이군에 비하여 유의적으로 감소하였다. 혈장 T-C 농도는 고지방식이군에 비하여 curcumin 급여 군에서 유의적인 감소가 나타났다.
- 총 16주 동안 정상식이 또는 고지방식이를 급여한 마우스의 골격근에서는 두식이군 간에 S6K1(T389)과 IRS-1(S636)의 인산화에 차이가 없었고 mTORC1 억제제인 rapamycin을 처리했을 때도 인슐린 저항성이 개선되지 않았다는 보고도 있다[19]. 한편, 본 연구에서는 ND군에 비해 HFD군의 간 조직에서 Akt의 인산화가 증가하는 것으로 나타났는데 이는 아마도 HFD군에서 증가한 혈장 인슐린농도와 IGF-1R 발현에 의한 인슐린신호전달체계의 반응일 것으로 사료된다.
- 혈장 인슐린 농도는 HFD군이 1486.14±146.9 mg/dL로 ND군(522.17±43.5 mg/dL)에 비하여 유의적으로 증가하였으며, CUR군은 666.33±16.2 mg/dL로 HFD군의 인슐린 농도에 비해 55.2% 감소하였다.
- 혈장 포도당 및 인슐린 농도를 분석한 결과, 포도당 농도는 HFD군이 ND군에 비하여 유의적으로 증가하였으며 CUR군은 245.58±58.1 mg/dL로 HFD군(295.26±21.4 mg/dL)에 비해 16.8% 감소하였다(Table 4).
후속연구
- 또한 간 조직에서 IGF-1R와 Akt의 활성을 증가시킨 반면 S6K1 활성은 감소시킨 것으로 보아 insulin signaling을 증가시킴으로써 인슐린 저항성 및 지질대사를 개선시킨 것으로 사료된다. 여러 임상시험결과, curcumin 중재는 건강한 정상인의 혈당에는 영향을 미치지 않는 반면 내당능장애와 같은 당뇨 전 단계나 제2형 당뇨환자의 혈당은 유의적으로 감소시키는 것으로 나타나[24-26] 앞으로 지속적으로 curcumin의 세포내 작용기전을 연구하여 당뇨 예방 및 치료를 위한 다양한 건강기능성 식의 약품으로 개발할 가치가 있을 것으로 사료된다.
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