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문제 정의
- 미백 기능성 화장품은 멜라노사이트 내에서의 멜라닌 생성을 억제하는 것, 멜라노사이트 자극물질을 조절하는 것과 멜라닌 배설을 촉진시키는 것으로 구분된다(Jung 2012). 본 논문은 국화과 꽃이 생산하는 대사물질로부터 미백효능을 가지는 기능성 화장품 소재를 개발하기 위하여 꽃 추출물 및 분획물을 제조하고, 이들의 총 페놀, 총 플라보노이드의 양, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 라디칼 소거 활성 및 멜라닌 생합성의 초기단계에 관여하는 타이로시나아제의 활성을 억제하는 정도를 검토하여 미백 기능성 화장품을 개발하는 데 있어서, 꽃의 활용 가능성을 평가하기 위하여 실시하였다(Jung 2012).
제안 방법
- 1)를 사용한다(Behbahani 등, 1993). 18종의 꽃으로부터 얻은 추출물 및 분획물의 미백활성을 탐색하기 위해 tyrosinase 활성 억제 실험을 진행하였다. Tyrosinase 활성 억제 정도는 퍼센트로 계산되어 1,000 ppm 농도의 kojic acid를 대조군으로 비교하여 값이 클수록 억제 효과가 높은 것을 의미한다.
- 꽃으로부터 얻은 추출물과 분획물 시료 용액에(1,000 ppm), 8.3 mM L-DOPA 기질, 2000 unit mushroom tyrosinase 순으로 첨가해 37°C heating block에서 30분 동안 배양한 후, 475 nm에서 dopachrome의 생성 정도를 흡광도로 측정하였다.
- 특히 페놀성 화합물은 항산화활성 (Frankel 등, 1993; Rice-Evans 등, 1995), 항염증활성(Cicerale 등, 2010) 및 다양한 약리활성과 화장품의 기능성을 나타내는 것으로 보고되어 있다. 따라서 이번에 수집한 꽃의 추출물 및 분획물에 대하여 총 페놀 및 총 플라보노이드 함량을 측정하였다.
- 양성 대조군인 α-tocopherol은 농도를 각각 12.5, 25, 100, 200, 400, 800 ppm으로 설정하여 각각의 라디칼 소거활성을 통해 400 ppm의 농도에서 약 50 %의 EDA값을 나타내었으므로 각 추출물과 분획물의 농도를 400 ppm으로 설정하여 실험하였다.
- 얻어진 추출물은 용매의 극성을 이용하여 n-hexane(100 mL ×2), EtOAc (100 mL ×2), n-BuOH (100 mL ×2) 및 물(100 mL)로 분획물을 제조하였다.
- 이후 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 위 과정을 3회 반복하였으며 측정한 값은 naringin 표준정량곡선을 이용하여 1g의 추출물 혹은 분획물 중에 함유된 naringin의 양(mg NAE/g DW)으로 제시하였다.
- 이때 tyrosinase의 효소반응이 멜라닌 생합성 반응의 반응속도결정 단계로 멜라닌 합성을 저해하기 위해서는 이 반응을 억제해야 한다(Shosuke 2003). 이와 같은 이유로 많은 선행 연구에서 tyrosinase의 작용에 대한 억제제를 탐색하는 in vitro 상의 연구를 결과가 보고되었으며, 기능성 화장품의 개발에서 멜라닌 합성을 억제하여 나타내는 미백효과를 평가를 하기 위해 tyrosinase inhibition 정도를 측정한다. Tyrosinase는 tyrosine으로부터 물 한분자를 제거하고 quinone의 구조를 만드는 반응의 촉매역할을 하며 tyrosinase inhibition assay에서는 주로 mushroom tyrosinase (EC 1.
- 총 페놀 함량은 Folin-Cioaclteu’s phenol 시약을 이용한 발색법(Singleton과 Rossi 1965)을 변형하여 측정하였다.
- 총 페놀함량의 측정은 Folin-Cioaclteu’s phenol 시약을 이용한 발색법(singleton과 Rossi 1965)을 변형하여 이용하였으며, 대조화합물로는 gallic acid 를 사용하였다.
- 총 플라보노이드 함량은 diethylene glycol을 이용한 발색법(Abeysinghe 등, 2007)을 변형하여 측정하였다. 추출물 및 분획물을 증류수에 녹여 200 ppm의 시료를 제조하고 그 중 200 μL를 취한 뒤 diethylene glycol 2 mL와 혼합하였다.
- 총 플라보노이드양의 측정은 diethylene glycol을 이용한 발색법(Abeysinghe 등, 2007)을 변형하여 실험하였으며, 대조화합물로는 naringin을 사용하였다.
- Brand-Williams 등의 방법에 의하여 소거활성을 측정하였다. 추출물 및 각 분획물의 농축 건조물을 25 ppm (99.5 % methanol)의 농도로 조제한 용액 0.1 mL (control: 99.5 % methanol)에 0.1 mM DPPH용액(99.5 % methanol) 1.9 mL를 가하였다. Vortex mixer로 10초간 진탕한 후 37°C에서 30분간 반응시켰다.
- 추출물 및 분획물을 증류수에 녹여 200 ppm의 시료를 제조하고 그 중 200 μL를 취한 뒤 100 μL의 50 % Folin-Cioaclteu’s phenol 시약을 첨가하였다.
- Tyrosinase 활성 억제 정도는 퍼센트로 계산되어 1,000 ppm 농도의 kojic acid를 대조군으로 비교하여 값이 클수록 억제 효과가 높은 것을 의미한다. 추출물과 n-hexane, EtOAc, n-BuOH, 물 층의 분획물에 대해서 실험을 진행하였고 그 결과는 Fig. 4와 같다. 양성대조군인 kojic acid의 tyrosinase 활성 억제 정도는 78.
- 9966)의 검량선을 얻었다. 추출물과 n-hexane, EtOAc, nBuOH, 물 층의 분획물에 대해서 실험을 진행하였고 그 결과는 그래프로 나타내었다(Fig. 3). 양성 대조군인 α-tocopherol은 농도를 각각 12.
- 이들을 실온에서 30분간 반응시킨 후 750 nm에서 흡광도를 측정하였으며 위 과정을 3회 반복하였다. 측정한 값은 gallic acid 표준정량곡선을 이용하여 1 g의 추출물 혹은 분획물 중에 함유된 gallic acid의 양(mg GAE/g DW)으로 제시하였다.
- : 시료 대신 methanol을 가한 시험액의 흡광도. 효과가 좋은 분획물은 농도를 낮게 하여 3가지 농도로 같은 방법으로 측정하였다. 각 실험은 3 반복으로 실시하였다.
대상 데이터
- 국화꽃 추출물의 화장품 기능성을 검정하기 위하여, 18종의 꽃을 수집하였다. 이번 실험에 사용된 국화과 꽃은 쑥부쟁이(Aster yomena), 까실쑥부쟁이(A.
- Louis, MO, USA)에서, Na2CO3, diethyleneglycol, NaOH는 덕산약품(Ansan, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 그 외의 실험에 사용한 시약은 대정화금주식회사(Siheung, Korea)에서 1급 시약을 구입하여 사용하였다. 감압 농축기는 Eyela CCA-1110 (Tokyo, Japan)을 사용하였으며, UV spectrophotometer는 Shimadzu UV-16-1 (Tokyo, Japan)와 Tecan UV/Vis (Hombrechtikon, Switzerland)를 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 국화과 꽃은 18종으로 수집 시기는 2015년 10월 12일이며, 충청남도 농업기술원 예산 국화 시험장에서 제공받거나, 서울시 양재 꽃 시장에서 구입하였다. 꽃은 꽃잎, 암술, 수술, 씨방 과 꽃받침으로 나누어져 있는데, 이번에 수집한 꽃은 모든 부위를 사용하였다.
- 본 연구에서 사용된 Folin & Ciocalteu’s phenol 시약, 3,4,5-trihydroxybenzoic acid (gallic acid), naringin, DPPH, kojic acid, mushroom tyrosinase, LDOPA는 Sigma Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA)에서, Na2CO3, diethyleneglycol, NaOH는 덕산약품(Ansan, Korea)에서 구입하여 사용하였다.
- 양성 대조 약물로는 α-tocopherol을 12.5, 25, 50, 100 ppm (99.5 % methanol) 의 4가지 농도로 용액을 조제하여 측정하였다.
- 국화꽃 추출물의 화장품 기능성을 검정하기 위하여, 18종의 꽃을 수집하였다. 이번 실험에 사용된 국화과 꽃은 쑥부쟁이(Aster yomena), 까실쑥부쟁이(A. ageratoides), 해국(A. spathulifolius), 과꽃(Callistephus chinensis), 서양등골나무(Conoclinium coelestinum), 하얀 코스모스(Cosmos bipinnatus White), 분홍 코스모스(C. bipinnatus Pink), 빨간 코스모스(C. bipinnatus Red), 국화 예스모닝(Chrysanthemum morifolium Ramat. Yesmorning), 국화 프로기(C. morifolium Ramat. Froggy), 국화 옐로우 마블(C. morifolium Ramat. Yellow Marble), 국화 로사(C. morifolium Ramat. Rosa), 국화 금화(C. morifolium Ramat. Geumhwa), 국화 백설(C. morifolium Ramat. Baekseol), 국화 하이마야(C. morifolium Ramat. Hi Maya), 국화 퐁퐁(C. morifolium Ramat. Pomponmum), 국화 팝그린(C. morifolium Ramat. Popgreen), 국화 홍심(C. morifolium Ramat. Hongsim)이었다(Table 1).
이론/모형
- Brand-Williams 등의 방법에 의하여 소거활성을 측정하였다. 추출물 및 각 분획물의 농축 건조물을 25 ppm (99.
- 라디컬 소거활성의 측정은 BrandWilliams 법(Brand Williams 등, 1995) 등을 사용하였으며, 대조화합물로는 α-tocopherol을 사용하였다.
성능/효과
- 9996) 의 검량선을 얻었다. Fig. 1을 보면 알 수 있듯이 EtOAc와 n-BuOH 분획이 물 분획과 n-hexane 분획에 비하여 많은 양의 phenol을 함유함을 알 수 있었으며, 그 중에서도 특히 쑥부쟁이의 n-hexane 및 EtOAc 분획, 하얀 코스모스의 nhexane 분획, 분홍 코스모스의 n-hexane 및 EtOAc 분획의 총 페놀 함량이 높음을 알 수 있었다. 각 분획들에 35.
- 대부분의 향기성분은 용매분획 하였을 때, 매우 비극성도가 높은 n-hexane 층에 모이게 된다. n-Hexane 분획의 수율을 보면 국화 백설, 국화 하이마야, 국화 홍심이 각각 0.02 %로 매우 낮았으나, 과꽃, 해국, 까실쑥부쟁이는 각각 1.68, 1.65 및 1.32 %의 순으로 높게 나타났다. EtOAc 분획에는 주로 터페노이드나 플라보노이드 중에서 상대적으로 극성이 낮은 성분들이 함유된다.
- 그 중에서도 쑥부쟁이의 EtOAc 분획, 하얀 코스모스의 EtOAc 분획, 빨간 코스모스의 EtOAc 분획, 국화 프로기의 EtOAc 분획 그리고 국화 하이마야의 EtOAc 분획의 총 플라보노이드 함량이 높음을 알 수 있었다. 각 분획들에 133.48, 54.38, 54.28, 70.75, 34.29 mg NAE/g DW가 함유되어 있는 것으로 나타났다(Fig. 2). 쑥부쟁이의 EtOAc 분획에서 플라보노이드 함량이 다른 식물의 분획에 비해 월등히 높게 나타났다.
- 1을 보면 알 수 있듯이 EtOAc와 n-BuOH 분획이 물 분획과 n-hexane 분획에 비하여 많은 양의 phenol을 함유함을 알 수 있었으며, 그 중에서도 특히 쑥부쟁이의 n-hexane 및 EtOAc 분획, 하얀 코스모스의 nhexane 분획, 분홍 코스모스의 n-hexane 및 EtOAc 분획의 총 페놀 함량이 높음을 알 수 있었다. 각 분획들에 35.33, 29.38, 67.07, 36.58, 26.40 mg GAE/g DW 가 함유되어 있는 것으로 나타났다(Fig. 1). 그래프에서 알 수 있듯이 하얀 코스모스의 nhexane 분획에서 가장 높은 함량을 나타내었다.
- 5 % methanol) 의 4가지 농도로 용액을 조제하여 측정하였다. 각 시료의 항산화작용은 DPPH에 대한 전자공여능(Electron donating ability, EDA %)으로 나타내었다. EDA (%) = {(Control O.
- EtOAc 분획에는 주로 터페노이드나 플라보노이드 중에서 상대적으로 극성이 낮은 성분들이 함유된다. 국화 금화, 국화 백설, 국화 하이마야, 국화 퐁퐁, 국화 홍심은 EtOAc 분획의 수율이 모두 0.01 %로 매우 낮았지만, 하얀 코스모스와 까실쑥부쟁이는 각각 2.24와 1.10 %로 비교적 높게 나타났다. 수율이 높게 나타난 분획에 대하여 TLC 하였을 때, 모두 터페노이드의 spot이 진하게 나타났다.
- n-BuOH 분획에는 터페노이드와 플라보노이드 중에서 상대적으로 극성이 높은 물질이나 페놀산, 사포닌과 같은 배당체가 주로 함유되어 있다. 국화 금화, 국화 백설, 국화 하이마야, 국화 퐁퐁, 국화 홍심의 수율은 모두 0.02 %로 매우 낮게 나타났으며, 높은 것은 분홍 코스모스, 해국, 국화 예스모닝이 각각 4.21, 1.88, 1.80 %로 나타났으며, TLC 실험에서도 플라보노이드, 페놀산 등의 뚜렷한 spot을 보였다. 물 분획에는 당이나 유기산, 아미노산과 같은일차대사산물이 함유되어 있으며, 색이 진한 꽃의 경우 안토시아닌 색소도 물층으로 이동하게 된다.
- 2를 보면 알 수 있듯이 EtOAc와 n-BuOH 분획이 물 분획과 n-hexane 분획에 비하여 많은 양의 플라보노이드를 함유함을 알 수 있었다. 그 중에서도 쑥부쟁이의 EtOAc 분획, 하얀 코스모스의 EtOAc 분획, 빨간 코스모스의 EtOAc 분획, 국화 프로기의 EtOAc 분획 그리고 국화 하이마야의 EtOAc 분획의 총 플라보노이드 함량이 높음을 알 수 있었다. 각 분획들에 133.
- 하얀 코스모스의 n-hexane 분획물은 총 페놀양이 높게 나타났고, EtOAc 분획의 총 플라보노이드의 양이 높게 나타났으며 이 분획은 DPPH radical scavenge 효과도 높고 tyrosinase 활성도 효과적으로 억제하였다. 분홍 코스모스의 n-hexane 및 EtOAc 분획물은 총 페놀 양이 높게 나타났으며, 그 중 EtOAc의 분획은 DPPH radical 소거활성이 높게 나타났다. 빨간 코스모스와 국화 하이마야의 경우는 모두 EtOAc 분획에서 총 플라보노이드 양이 높게 나타났으며 tyrosinase 활성도 효과적으로 억제하였다.
- 분홍 코스모스의 n-hexane 및 EtOAc 분획물은 총 페놀 양이 높게 나타났으며, 그 중 EtOAc의 분획은 DPPH radical 소거활성이 높게 나타났다. 빨간 코스모스와 국화 하이마야의 경우는 모두 EtOAc 분획에서 총 플라보노이드 양이 높게 나타났으며 tyrosinase 활성도 효과적으로 억제하였다. 높은 활성을 보이는 꽃들에 대해 문헌검색을 해본 결과 아직까지 총 페놀, 총 플라보노이드, DPPH radical 소거활성, tyrosinase 저해 활성에 관한 연구가 진행 된 적이 없었다.
- 이번 실험에서 사용한 시료는 꽃이기 때문에 과당, 설탕이 주요 성분으로 존재한다. 수율이 가장 낮은 것이 국화 팝그린의 0.10 %이며, 가장 높은 것은 까실 쑥부쟁이의 4.84 %였으며, 모든 꽃의 분획에서 물 분획의 수율이 비교적 높게 나타났다. TLC에서도 당과 안토시아닌의 spot이 뚜렷하게 나타났다.
- 10 %로 비교적 높게 나타났다. 수율이 높게 나타난 분획에 대하여 TLC 하였을 때, 모두 터페노이드의 spot이 진하게 나타났다. n-BuOH 분획에는 터페노이드와 플라보노이드 중에서 상대적으로 극성이 높은 물질이나 페놀산, 사포닌과 같은 배당체가 주로 함유되어 있다.
- 8 %를 나타내었다. 실험 결과 서양등골나무의 EtOAc 분획이 31.5 %, 하얀 코스모스의 EtOAc 분획이 35.2 %, 빨간 코스모스의 EtOAc 분획이 36.7 %, 국화 하이마야의 EtOAc 분획이 39.8 %, 국화 홍심의 EtOAc 분획이 44.7 %의 억제효과를 보여 우수한 tyrosinase 활성 억제 효과를 가지는 것으로 나타났다.
- 5, 25, 100, 200, 400, 800 ppm으로 설정하여 각각의 라디칼 소거활성을 통해 400 ppm의 농도에서 약 50 %의 EDA값을 나타내었으므로 각 추출물과 분획물의 농도를 400 ppm으로 설정하여 실험하였다. 실험 결과 쑥부쟁이의 EtOAc 분획이 88.5 %, 하얀 코스모스의 EtOAc 분획이 60.0 %, 분홍 코스모스의 EtOAc 분획이 60.1 %, 국화 옐로우마블의 EtOAc 분획이 78.3 %, 국화 로사의 MeOH 추출물이 58.5 %의 높은 라디칼 소거 활성을 나타내었다. 위의 자료들을 모두 종합해 볼 때, 쑥부쟁이의 EtOAc 분획과 국화 옐로우마블의 EtOAc 분획에서 특히 높은 라디칼 소거 활성이 나타나는 것으로 확인되었다.
- 2). 쑥부쟁이의 EtOAc 분획에서 플라보노이드 함량이 다른 식물의 분획에 비해 월등히 높게 나타났다.
- 쑥부쟁이의 n-hexane 및 EtOAc 분획물은 총 페놀양이 높게 나타났으며, 그 중 EtOAc의 분획은 총 플라보노이드의 양 역시 높게 나왔고, DPPH radical scavenge 효과도 높게 나타났다. 하얀 코스모스의 n-hexane 분획물은 총 페놀양이 높게 나타났고, EtOAc 분획의 총 플라보노이드의 양이 높게 나타났으며 이 분획은 DPPH radical scavenge 효과도 높고 tyrosinase 활성도 효과적으로 억제하였다.
- 5 %의 높은 라디칼 소거 활성을 나타내었다. 위의 자료들을 모두 종합해 볼 때, 쑥부쟁이의 EtOAc 분획과 국화 옐로우마블의 EtOAc 분획에서 특히 높은 라디칼 소거 활성이 나타나는 것으로 확인되었다.
- 이 중 MeOH로 생체 꽃 시료를 추출한 추출물의 수율은 국화 금화가 0.19 %로 가장 낮았으며, 분홍 코스모스, 해국, 까실쑥부쟁이가 각각 9.17, 8.81 및 5.59 %로 높게 나타났다. 꽃은 수정 매개충을 유인하기 위하여 향기성분을 함유하고 있다.
- 쑥부쟁이의 n-hexane 및 EtOAc 분획물은 총 페놀양이 높게 나타났으며, 그 중 EtOAc의 분획은 총 플라보노이드의 양 역시 높게 나왔고, DPPH radical scavenge 효과도 높게 나타났다. 하얀 코스모스의 n-hexane 분획물은 총 페놀양이 높게 나타났고, EtOAc 분획의 총 플라보노이드의 양이 높게 나타났으며 이 분획은 DPPH radical scavenge 효과도 높고 tyrosinase 활성도 효과적으로 억제하였다. 분홍 코스모스의 n-hexane 및 EtOAc 분획물은 총 페놀 양이 높게 나타났으며, 그 중 EtOAc의 분획은 DPPH radical 소거활성이 높게 나타났다.
후속연구
- 코스모스는 항산화 효능을 가진다고 보고되었으며(Jang 등, 2008), 코스모스를 비롯한 국화과(Compositae) 식물들이 항염증 효능을 가진다고 보고되었다(Akihisa 등, 1996). 따라서 쑥부쟁이, 하얀 코스모스, 분홍 코스모스, 빨간 코스모스 및 국화 하이마야에 대해서는 미백물질개발에 관한 심도 있는 연구가 필요한 것으로 사료된다.
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