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문제 정의
- 바나나는 주로 과실이 이용되어 왔으며 줄기, 잎은 수확과 함께 폐기 혹은 퇴비로 쓰이고 있다. 이에 과실이 아닌 잎의 피부미용 기능성 소재로서 피부노화를 예방할 수 있는 가능성을 확인하고자 한다.
제안 방법
- 동일한 시험담당자가 5회 연속으로 측정하였고 최대값과 최소값을 제외한 3회 측정 결과를 평균값으로 산정하여 분석하였다. 22명의 피검자를 대상으로 색소가 침착된 부위의 L-value (채도인자) 변화를 측정하여 미백효능을 확인하였다. 평가는 육안평가와 동일한 시점에 측정하였다.
- B16F10 세포에 바나나잎 추출물의 세포독성을 측정하기 위하여 MTT assay를 수행하여 실험에 사용될 유효농도 범위를 결정하였다. B16F10 세포에 대한 세포독성을 측정한 결과, 10%의 농도에서도 세포생존율이 음성대조군과 유사하게 나타났다(Figure 1).
- In vitro 실험에서 바나나잎 추출물의 멜라닌 합성 억제효과 및 TRP1, TRP2, tyrosinase 유전자 발현 억제의 효과가 실제적으로 사람 피부의 미백에 도움을 주는지 확인하기 위하여 바나나잎 추출물을 0.75% 함유한 크림에 대하여 인체 적용시험을 수행하였다. 자외선 조사 직후, 크림 도포 4주, 6주, 8주 경과 후 피험자들을 대상으로 분광광도계(spectrophotometer CR-2600D)를 이용하여 색소 침착된 부위의 피부밝기를 총 5회 측정하여 최소값과 최대값을 배제한 평균값을 얻었다.
- RNA 분석을 위해 세포 내의 total RNA를 TRIzol reagent (Gibco, USA)을 사용하여 추출하였다. RNA의 순도와 무결성은 A260 nm / A280 nm 비율 측정을 통해 확인하였으며, RNA 수득율은 260 nm에서 흡광도로 측정하였고, 사용 전까지 –70 ℃에서 보관하였다.
- 15 mL에 1/15 M의 phosphate buffer를 넣은 후, 25 ℃ 5 min 간 pre-incubation 시키고 L-DOPA를 섞은 후에 475 nm 5 min 간 흡광도를 측정하였다. 각 실험군은 모두 triplicate로 실행하였으며 아래의 수식을 활용하여 효소 저해율(%)을 산출하였다.
- PCR 열 순환 조건은 95 ℃에서 2 min 동안 pre-denaturation을 하고, 30 cycle 동안 94 ℃에서 5 s 간 denaturation, 55 ℃에서 20 s 간 annealing, 72 ℃에서 10 s 간 extension을 한 후 마지막으로 72 ℃에서 5 min 동안 extension을 진행하였다. 결과는 GAPDH의 발현량에 대한 상대적인 발현량으로 계산하였다. 실험에 사용된 특정 SYBR gene expression assay는 Table 1과 같다.
- 잘 말린 바나나잎을 70% 에탄올로 50 ∼ 60 ℃의 온도에서 4 h 동안 추출한 후 이를 진공증발기를 이용하여 1/10로 농축하였다. 농축액에 포함된 다당체를 제거하기 위하여 농축액의 10배 용량의 cold ethanol을 첨가하여 다당체를 침전시키고 여과하여 여과된 여액을 파우더로 수거하여 다당체 제거 추출물을 확보하였다. 확보한 다당체 제거 추출물 내의 유효물질을 분리하기 위하여 클로로폼을 이용하여 분획을 하였고, 얻어진 분획물은 진공증발기를 이용하여 용매를 제거한 후 동결건조하여 파우더로 수거하고 실험에 이용하였다.
- 바나나잎 추출물 함유 크림의 미백효과를 육안으로 확인하기 위하여 22명의 피검자를 대상으로 최소 홍반량(MED)을 판정한 후 색소 침착을 유발하기 위해 인공 자외선 방출기(multiport stimulator 601-300W, Solar Light Company, Inc., USA)를 사용하여 2.5 MED 광량으로 1회 조사하고 24 h이 경과한 후 밝고 균일한 광원 하에서 피부과 전문의가 이중맹검법으로 평가하였다. 평가는 시험제품 사용전과 4주, 6주, 8주 사용 후에 하고, 색소 침착 정도를 10단계로 구분하여 평가하였다.
- 바나나잎 추출물의 미백효능을 평가하기 위해서 B16F10 세포를 이용하여 멜라닌 생성률을 확인하였다. 바나나잎 추출물을 각각 0.
- 양성대조군은 arbutin으로 사용하였다. 배양된 세포의 배지를 제거하고 PBS로 세척 후 trypsin/EDTA (Gibco, USA)를 처리하여 세포를 수획하였다. 수획한 세포는 원심분리하여 상등액을 제거한 후 1N NaOH 용액을 200 µL 넣어 멜라닌을 용해시킨 후 microplate reader (Biotek, USA)로 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 75% 함유한 크림에 대하여 인체 적용시험을 수행하였다. 자외선 조사 직후, 크림 도포 4주, 6주, 8주 경과 후 피험자들을 대상으로 분광광도계(spectrophotometer CR-2600D)를 이용하여 색소 침착된 부위의 피부밝기를 총 5회 측정하여 최소값과 최대값을 배제한 평균값을 얻었다. 결과는 바나나잎 추출물을 포함한 크림과 양성대조군으로 사용된 알부틴 2%가 첨가된 크림 간의 평균값 차이를 paired t-test를 통해 95% 신뢰구간에서 p < 0.
- RNA의 순도와 무결성은 A260 nm / A280 nm 비율 측정을 통해 확인하였으며, RNA 수득율은 260 nm에서 흡광도로 측정하였고, 사용 전까지 –70 ℃에서 보관하였다. 추출한 RNA로부터의 cDNA의 합성은 Maxime RT PreMix (iNtRON, Korea)를 사용하여 합성하였으며, B16F10 세포 표지인자의 발현을 비교 측정하기 위하여 Light Cycler 96 (Roche, Germany)을 사용하여 다음의 방법으로 real-time RT-PCR을 진행하였다. 2 µL의 cDNA template와 Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG (Invitrogen, USA), 5 pmol of sense and anti-sense primers, ROX reference dye, bovine serum albumin를 넣어준 후 total volume이 20 µL가 되도록 증류수를 넣어주었다.
- 통계학적으로 유의한 바나나잎 추출물의 미백개선 효과를 추가적으로 확인하기 위하여 기기적 평가 방법과 동일하게 바나나잎 추출물을 0.75% 함유한 크림에 대하여 육안 평가를 실시하였다. 자외선 조사 직후, 크림 도포 4주, 6주, 8주 경과 후 피험자들을 대상으로 10단계로 구분하여 바나나잎 추출물을 포함한 크림과 알부틴이 2% 첨가된 크림간의 판정값 차이를 구하여 paired t-test를 통해 양성대조군과 바나나잎 추출물이 함유된 크림간의 통계적 유의성을 보이지 않았으나(p = 0.
- 5 MED 광량으로 1회 조사하고 24 h이 경과한 후 밝고 균일한 광원 하에서 피부과 전문의가 이중맹검법으로 평가하였다. 평가는 시험제품 사용전과 4주, 6주, 8주 사용 후에 하고, 색소 침착 정도를 10단계로 구분하여 평가하였다.
- 농축액에 포함된 다당체를 제거하기 위하여 농축액의 10배 용량의 cold ethanol을 첨가하여 다당체를 침전시키고 여과하여 여과된 여액을 파우더로 수거하여 다당체 제거 추출물을 확보하였다. 확보한 다당체 제거 추출물 내의 유효물질을 분리하기 위하여 클로로폼을 이용하여 분획을 하였고, 얻어진 분획물은 진공증발기를 이용하여 용매를 제거한 후 동결건조하여 파우더로 수거하고 실험에 이용하였다.
대상 데이터
- 마우스에서 유래한 흑색종 세포인 B16F10 세포는 한국세포주은행에서 구매하여 사용하였으며, 세포배양을 위해 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, Welgene, Korea)에 10%의 fetal bovine serum (FBS, Welgene, Korea)와 1%의 penicillin/streptomycin (Invitrogen, USA)을 첨가하여 37 ℃, 5% CO2, 100% 습윤배양기에서 배양하였다.
- 이는 바나나잎 추출물이 새로운 피부 노화개선 후보물질로서의 가능성을 보여준다. 본 연구를 위하여 헥산, 클로로포름, 에틸 아세테이트, 에탄올, 메탄올, 증류수 등 다양한 용매로, 혹은 상온, 45 ℃, 65 ℃의 온도에서 바나나잎 추출물을 획득하였다. 에탄올을 촉매로 하여 65 ℃의 온도에서 추출할 때, 미백효능이 가장 뛰어난 추출물을 얻을 수있었다.
- 2 µM α-MSH 가 포함된 배지로 바나나잎 추출물을 농도별로 제조하여 처리한 후 72 h 배양하였다. 양성대조군은 arbutin으로 사용하였다. 배양된 세포의 배지를 제거하고 PBS로 세척 후 trypsin/EDTA (Gibco, USA)를 처리하여 세포를 수획하였다.
데이터처리
- 인공 색소 침착 부위의 피부미백개선 평가를 위해 분광광도계(spectro photo meter CR-2600D, Minolta, Japan)를 적용하였다. 동일한 시험담당자가 5회 연속으로 측정하였고 최대값과 최소값을 제외한 3회 측정 결과를 평균값으로 산정하여 분석하였다. 22명의 피검자를 대상으로 색소가 침착된 부위의 L-value (채도인자) 변화를 측정하여 미백효능을 확인하였다.
- 통계처리는 Student’s t-test법을 이용하여 유의 수준을 0.05 (p < 0.05)로 하여 검정하였다.
이론/모형
- B16F10 cells (3 × 103 cells/mL) were seeded in 96-well plate and treated indicated concentration of banana leaf for 24 h. Cell viability was measured by MTT assay. The results are presented as the mean ± S.
- 바나나잎 추출물의 멜라닌 합성 저해능이 멜라닌 생성과정의 중요한 효소인 tyrosinase, TRP1, TRP2에 의한 효과인지 알아보기 위하여 RT-PCR 실험법을 수행하였다. 그 결과 바나나잎 추출물은 양성대조군인 알부틴과 유사하게 TRP1, tyrosinase 유전자 발현을 감소시키는 효과가 있었다(Figure 4A, C)[11].
- 인공 색소 침착 부위의 피부미백개선 평가를 위해 분광광도계(spectro photo meter CR-2600D, Minolta, Japan)를 적용하였다. 동일한 시험담당자가 5회 연속으로 측정하였고 최대값과 최소값을 제외한 3회 측정 결과를 평균값으로 산정하여 분석하였다.
성능/효과
- 10%의 농도에서는 세포의 생존율에 영향을 미치지 않음을 Figure 1에서 확인하였다. 10%의 바나나잎 추출물은 대표적인 양성대조군인 알부틴보다 tyrosinase activity를 현저히 감소시킴을 확인하였다(Figure 2). TRP1과 TRP2, Tyr의 유전자 발현 측정에서 바나나잎 추출물이 유의성 있게 대조군 대비, 발현을 감소시키는 결과를 나타내었다(Figure 4).
- Improvement of whitening effect by mechanical evaluation after cream treatment. After 8 weeks, the group who treated by banana leaf extract cream showed statistically significant whitening effect than positive control (2% of arbutin). The data represent the mean ± S.
- 결과는 바나나잎 추출물을 포함한 크림과 양성대조군으로 사용된 알부틴 2%가 첨가된 크림 간의 평균값 차이를 paired t-test를 통해 95% 신뢰구간에서 p < 0.01로 유의성 여부를 확인한 결과, 바나나잎 추출물을 포함한 크림 도포 8주 후 통계학적으로 유의한 수준의 미백 효능을 나타내었다(Figure 6).
- 바나나잎 추출물의 멜라닌 합성 저해능이 멜라닌 생성과정의 중요한 효소인 tyrosinase, TRP1, TRP2에 의한 효과인지 알아보기 위하여 RT-PCR 실험법을 수행하였다. 그 결과 바나나잎 추출물은 양성대조군인 알부틴과 유사하게 TRP1, tyrosinase 유전자 발현을 감소시키는 효과가 있었다(Figure 4A, C)[11]. TRP2 유전자의 경우, 양성대조군인 알부틴은 유전자 발현양을 감소시키지 못했지만 바나나잎 추출물의 경우 40% 가량 감소시키는 효과를 보여주었다(Figure 4B).
- TRP2 유전자의 경우, 양성대조군인 알부틴은 유전자 발현양을 감소시키지 못했지만 바나나잎 추출물의 경우 40% 가량 감소시키는 효과를 보여주었다(Figure 4B). 따라서 본 실험 결과를 통해 바나나잎 추출물은 tyrosinase, TRP1, TRP2의 유전자 발현을 감소시켜 멜라닌 생성 억제를 유도하는 것으로 판단된다.
- 1%, 1%, 10%농도로 처리하여 tyrosinase의 효소 활성을 측정한 결과, 바나나잎 추출물의 농도에 의존적으로 tyrosinase 저해 활성을 확인할 수 있었다(Figure 2). 바나나잎 추출물 10%에서 51.3%의 tyrosinase 저해능을 나타내어 우수한 미백효과를 입증하였다.
- 1%, 1%, 10% 농도로 처리한 B16F10 세포를 수획하여 멜라닌 양을 측정한 결과, 농도 의존적으로 멜라닌의 생성이 저해됨을 확인하였다. 바나나잎 추출물을 1%와 10% 처리할때 멜라닌 생성률이 각각 38% , 65% 감소하여 대조군대비 유의성 있게 감소하였다(Figure 3).
- 바나나잎 추출물의 미백효능을 평가하기 위해서 B16F10 세포를 이용하여 멜라닌 생성률을 확인하였다. 바나나잎 추출물을 각각 0.01%, 0.1%, 1%, 10% 농도로 처리한 B16F10 세포를 수획하여 멜라닌 양을 측정한 결과, 농도 의존적으로 멜라닌의 생성이 저해됨을 확인하였다. 바나나잎 추출물을 1%와 10% 처리할때 멜라닌 생성률이 각각 38% , 65% 감소하여 대조군대비 유의성 있게 감소하였다(Figure 3).
- 바나나잎 추출물의 tyrosinase 저해 활성을 평가하기 위하여 코직산을 양성대조군으로 사용하고 바나나잎 추출물을 각각 0.01%, 0.1%, 1%, 10%농도로 처리하여 tyrosinase의 효소 활성을 측정한 결과, 바나나잎 추출물의 농도에 의존적으로 tyrosinase 저해 활성을 확인할 수 있었다(Figure 2). 바나나잎 추출물 10%에서 51.
- 또한 자외선은 표피 내 각질형성세포를 자극하여 α-MSH의 분비를 촉진시키고, 이는 멜라닌형성세포를 자극하여 멜라닌의 합성을 유도하여 기미, 색소침착 등을 유발한다[3]. 본 연구에서 바나나잎 추출물을 B16F10 세포에 처리할 적절한 농도를 확인할 수 있었다. 10%의 농도에서는 세포의 생존율에 영향을 미치지 않음을 Figure 1에서 확인하였다.
- 본 연구를 위하여 헥산, 클로로포름, 에틸 아세테이트, 에탄올, 메탄올, 증류수 등 다양한 용매로, 혹은 상온, 45 ℃, 65 ℃의 온도에서 바나나잎 추출물을 획득하였다. 에탄올을 촉매로 하여 65 ℃의 온도에서 추출할 때, 미백효능이 가장 뛰어난 추출물을 얻을 수있었다. 바나나잎 추출물은 자극적인 화학 합성 물질 대신 천연물 소재로서 바나나의 기능성 성분 분석과 연구에 크게 기여할 것으로 예상되며, 폐기물로써 버려지는 대신 새로운 활용 방안으로 기능성 항노화 화장품 소재로의 차별화 및 경쟁력을 통해 새로운 화장품 원료로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
- 자외선 조사 직후, 크림 도포 4주, 6주, 8주 경과 후 피험자들을 대상으로 10단계로 구분하여 바나나잎 추출물을 포함한 크림과 알부틴이 2% 첨가된 크림간의 판정값 차이를 구하여 paired t-test를 통해 양성대조군과 바나나잎 추출물이 함유된 크림간의 통계적 유의성을 보이지 않았으나(p = 0.48), 자외선 조사 직후와 바나나잎 추출물이 함유된 크림을 8주간 도포한 후의 육안평가 결과를 확인했을 때 95% 신뢰구간에서 p < 0.01로 통계적으로 유의한 미백 효과를 확인할 수 있었다(Figure 5).
- TRP1과 TRP2, Tyr의 유전자 발현 측정에서 바나나잎 추출물이 유의성 있게 대조군 대비, 발현을 감소시키는 결과를 나타내었다(Figure 4). 추가적으로 바나나잎 추출물은 인체 적용 실험에서도 피부 이상 반응이 없고, 8주 후 피부 미백효과에 도움을 주는 것으로 나타났다(Figure 5, 6). 이는 바나나잎 추출물이 새로운 피부 노화개선 후보물질로서의 가능성을 보여준다.
후속연구
- 에탄올을 촉매로 하여 65 ℃의 온도에서 추출할 때, 미백효능이 가장 뛰어난 추출물을 얻을 수있었다. 바나나잎 추출물은 자극적인 화학 합성 물질 대신 천연물 소재로서 바나나의 기능성 성분 분석과 연구에 크게 기여할 것으로 예상되며, 폐기물로써 버려지는 대신 새로운 활용 방안으로 기능성 항노화 화장품 소재로의 차별화 및 경쟁력을 통해 새로운 화장품 원료로 활용될 수 있을 것으로 기대된다. 바나나잎 추출물의 피부 미백 개선 효과를 확인한 결과는 본 연구가 최초로, 추후 피부미용에 실질적으로 응용이 될 수 있고 피부노화를 예방할 수 있는 가능성을 제시한 결과라 사료된다.
- 바나나잎 추출물은 자극적인 화학 합성 물질 대신 천연물 소재로서 바나나의 기능성 성분 분석과 연구에 크게 기여할 것으로 예상되며, 폐기물로써 버려지는 대신 새로운 활용 방안으로 기능성 항노화 화장품 소재로의 차별화 및 경쟁력을 통해 새로운 화장품 원료로 활용될 수 있을 것으로 기대된다. 바나나잎 추출물의 피부 미백 개선 효과를 확인한 결과는 본 연구가 최초로, 추후 피부미용에 실질적으로 응용이 될 수 있고 피부노화를 예방할 수 있는 가능성을 제시한 결과라 사료된다. 향후 바나나잎 추출물이 어떠한 기전으로 피부 미백을 개선하는지에 대해 추가연구와 심도 있는 임상연구가 필요할 것으로 보인다.
- 바나나잎 추출물의 피부 미백 개선 효과를 확인한 결과는 본 연구가 최초로, 추후 피부미용에 실질적으로 응용이 될 수 있고 피부노화를 예방할 수 있는 가능성을 제시한 결과라 사료된다. 향후 바나나잎 추출물이 어떠한 기전으로 피부 미백을 개선하는지에 대해 추가연구와 심도 있는 임상연구가 필요할 것으로 보인다.
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