[논문]도심공원으로부터 산내성 xylanase를 생산하는 박테리아 분리 및 효소학적 특성

장민영; 박화랑; 이총규; 추갑철; 조현서; 박삼봉; 오기철; 김봉규

doi:10.3839/jabc.2017.014

도심공원으로부터 산내성 xylanase를 생산하는 박테리아 분리 및 효소학적 특성
Isolation and biochemical characterization of acid tolerance xylanase producing Bacteria, Bacillus sp. GJY from city park soil 원문보기

Journal of applied biological chemistry, v.60 no.1, 2017년, pp.79 - 86

장민영 (Department of Forest Resources, Gyeongnam National University of Science and Technology) , 박화랑 (Department of Forest Resources, Gyeongnam National University of Science and Technology) , 이총규 (Department of Forest Resources, Gyeongnam National University of Science and Technology) , 추갑철 (Department of Forest Resources, Gyeongnam National University of Science and Technology) , 조현서 (Department of Forest Resources, Gyeongnam National University of Science and Technology) , 박삼봉 (Department of Forest Resources, Gyeongnam National University of Science and Technology) , 오기철 (Nakdong River Basin Environmental Office) , 김봉규 (Department of Forest Resources, Gyeongnam National University of Science and Technology)

초록
AI-Helper

토양 내에 존재하는 미생물은 다양한 종류의 다당류 분해 효소들을 생산함으로써 토양의 비옥도 증진뿐만 아니라 토양내의 생태계를 건전하게 유지하게 위해 중요한 역할을 한다. 본 연구는 경남과학기술대학교에 위치한 쥬라기숲에서 0.4 % carboxymethyl cellulose와 0.01 % trypan blue가 첨가된 LB agar plate를 이용하여 CMCase와 xylanase를 생산하는 박테리아를 분리하였다. 16S rRNA 유전자 염기서열 분석과 API kit 분석을 바탕으로 분리된 박테리아는 Bacillus 종에 속하는 것으로 동정되었으며, Bacillus sp. GJY으로 명명하였다. Bacillus sp. GJY에서 CMCase와 xylanase의 활성을 책임지고 있는 단백질을 알아보기 위하여 Zymogram 분석을 실시하였다. 그 결과 CMCase의 경우 약 28 kDa 크기에 xylanase의 경우 약 25 kDa 크기에 활성밴드가 하나씩 존재하였다. Bacillus sp. GJY의 최적 생장온도는 $37^{\circ}C$이었으며, CMCase와 xylanase의 활성은 배양 후 12시간에 최고에 달하였다. CMCase의 경우 pH 5.0, 온도 $40^{\circ}C$에서 최적의 활성을 보인 반면, xylanase는 pH 4.0, $40^{\circ}C$에서 최적의 활성을 보였다. CMCase와 xylanase 모두 40, $50^{\circ}C$에서는 열 안정성을 보였지만, $60^{\circ}C$ 이상에서는 두 효소의 열 안정성이 급격하게 감소하는 경향을 보였다.

Abstract ▼ AI-Helper

Microbes in forest are very important due to not only to enhance soil fertility but also maintain a healthy ecosystem by supplying the energy available to living organisms by producing various kinds of enzymes related to degradation of lignocellulosic biomass. In order to isolate a lignocellulosic biomass degrading bacterial strain from the Jurassic park located in Gyeongnam National University of Science and Technology, We used the Luria-Bertani-Carboxymethyl cellulose (CMC) agar trypan blue method containing 0.4 % carboxymethyl cellulose and 0.01 % trypan blue. As a result, we isolated a bacterial strain showing both activity on the CMC and xylan. To identify the isolated strain, 16S rRNA sequencing and API kit analysis were used. The isolated strain turned out to belong to Bacillus species and then named Bacillus sp. GJY. In the CMC zymogram analysis, it showed that one active band of about 28kDa in size is present. Xylan zymogram analysis also showed to have one active band of about 25kDa in size. The optimal growth temperature of Bacillus sp. GJY was $37^{\circ}C$. The maximal activities of CMCase and xylanase were 12 hour after incubation. The optimal pH and temperature for CMCase were 5.0 and $40^{\circ}C$, respectively, whereas the optimal pH and temperature for xylanase was 4.0 and $40^{\circ}C$. Both activities for CMCase and xylanase showed to be thermally stable at 40and $50^{\circ}C$, while both activities rapidly decreased at over $60^{\circ}C$.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.

문제 정의

4 % CMC을 담고 있는 SDSPAGE 분석방법은 Bacillus sp. GJY에서 CMCase와 xylanase의 활성을 책임지고 있는 단백질을 알아보기 위하여 사용하였다. Bacillus sp.

제안 방법

API kit (bioMerieux. Vitek, Marcy l'Etoile, France)의 그람 양성 API 50CH kit를 이용하여 분리한 균주의 생화학적 특성을 분석하였다(Table 1).
30분간 반응 후 생성된 환원당은 동량의 1 % dinitrosalicyclic acid (DNS) 첨가한 후 100 ^oC에서 5분간 끓여 반응물을 발색 시킨 후 분광광도계를 이용하여 540 nm에서 측정하였다. CMCase 또는 xylanase 의 적정반응온도를 결정하기 위하여 각 각의 반응액은 20, 30, 40, 50, 60,70 ^oC의 온도에서 30분간 반응하여 효소활성을 측정하였다. CMCase 또는 xylanase의 열 안정성은 각기 다른 온도(40, 50,70 ^oC)에서 효소를 전 배양한 후 남아있는 효소 활성을 측정하였다.
CMCase 또는 xylanase 의 적정반응온도를 결정하기 위하여 각 각의 반응액은 20, 30, 40, 50, 60,70 ^oC의 온도에서 30분간 반응하여 효소활성을 측정하였다. CMCase 또는 xylanase의 열 안정성은 각기 다른 온도(40, 50,70 ^oC)에서 효소를 전 배양한 후 남아있는 효소 활성을 측정하였다. CMCase 또는 xylanase의 적정 pH를 결정하기 위하여 pH 3.
Bacillus sp. GJY 유래 CMCase와 xylanase의 활성에 영향을 미치는 온도의 영향을 알아보기 위하여 20-70 ^oC 사이의 6가지의 서로 다른 온도에서 각각의 효소활성을 측정하였다. 그 결과 CMCase와 xylanase는 40 ^oC에서 가장 높은 효소활성을 보였으며, 다음으로 50 ^oC로 40 ^oC의 효소활성에 비교해서 약 85%이상의 효소 활성을 가지는 것으로 나타났다(Fig.
Bacillus sp. GJY 의 조효소액을 이용하여 CMCase 또는 xylanase의 효소활성은 50 ^oC에서 30분간 xylan 또는 CMC를 기질로 첨가하여 배양하는 동안 생성되는 환원당의 양을 측정하는 것에 의하여 결정하였다. 효소의 1 unit는 분당 1 μmol을 생성하는데 필요한 효소의 양으로 정의하였다.
GJY를 분리·동정 하고, Bacillus sp. GJY가 생산 하는 CMCase와 xylanase의 활성에 영향을 미치는 특성들을 구명하였다.
Bacillus sp. GJY에서 CMCase와 xylanase의 활성을 책임지고 있는 단백질을 알아보기 위하여 Zymogram 분석을 실시하였다. 그 결과 CMCase의 경우 약 28 kDa 크기에 xylanase의 경우 약 25 kDa 크기에 활성밴드가 하나씩 존재하였다.
Bacillus sp. GJY의 배양기간 동안 생장과 효소활성과의 관계를 알아보기 위하여 37 ^o C가 유지되는 배양기에서 배양 시간(0, 4, 8, 12, 24, 48시간) 별로 CMCase와 xylanase의 효소활성을 측정하였다. Bacillus sp.
Bacillus sp. GJY의 적정생장 온도를 조사하기 위하여 20, 25, 30, 37, 45 ^oC에서 48시간 동안 정치배양을 실시하였다. Bacillus sp.
PCR 반응용액은 게놈 DNA의 1 μL, 2.5 mM dNTPs 의 3 μL, 10X 반응 완충용액의 3 μL, 각각의 primer (10 pmol/uL)의 3 μL, nTaq-HOT polymerase (Enzynomics, Daejeon, Korea)의 0.3 μL와 멸균수를 첨가하여 최종볼륨이 30 μL가 되게 조제 하였다.
PCR은 Taq-HOT polymerase를 활성화시키기 위하여 94 ^oC 10분간 반응한 후 94 ^oC에서 30초, 55 ^oC에서 1분, 72 ^oC에서 1분 30초의 사이클을 총 40회 실시한 후 72^oC에서 10분간 반응을 실시하였다. PCR반응물 1.5 % 아가로스 겔을 이용하여 전기영동을 실시하였다. 아가로스겔상에서 예상되는 크기에 위치한 DNA를 면도칼로 자른 후 DNA 정제 키트(Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 순수한 DNA를 정제하였다.
3 μL와 멸균수를 첨가하여 최종볼륨이 30 μL가 되게 조제 하였다. PCR은 Taq-HOT polymerase를 활성화시키기 위하여 94 ^oC 10분간 반응한 후 94 ^oC에서 30초, 55 ^oC에서 1분, 72 ^oC에서 1분 30초의 사이클을 총 40회 실시한 후 72^oC에서 10분간 반응을 실시하였다. PCR반응물 1.
각 비율로 희석된 샘플은 0.01 % trypan blue (Sigma-Aldrich, St, Louis, MO, USA)와 0.4 % carboxymethyl cellulose (CMC)가 첨가된 Luria-Bertani (LB) agar plate에 100 μL씩 도말 하여 30 oC 인큐베이터에서 2일간 배양하였다.
0)를 이용하여 50 ^oC, 120 rpm이 유지되는 인큐베이터에 서 CMCase를 위해서는 8시간, xylanase를 위해서는 14시간 배양 하였다. 그 후 상온에서 0.5 % (w/v) Congo red 로 30분간 SDS-PAGE gel을 염색하고, 1 M NaCl을 이용하여 붉은 색의 배경을 가진 gel에서 옅은 붉은 색의 가수분해 zone이 나타날 때까지 탈색하였다. 최종적으로 선명한 결과 사진을 얻기 위하여 0.
그 후 샘플은 10−1, 10−2, 10−3, 10−4, 10−5, 10−6 배로 희석하여 10분간 정치 배양 후 실험에 이용하였다.
10개의 박테리아는 2 mL LB 액체 배지를 담고 있는 각각의 시험관(20×150 mm)에 접종하여 37 ^oC에서 밤샘 배양하였다. 다음 날 원심분리를 통하여 상등 액을 회수하여 CMC를 기질로 하여 반응한 후 DNS 방법으로 효소활성을 측정하였고 여기서 상대적으로 높은 활성을 보이는 박테리아를 선발하여 다음 실험에 이용하였다.
CMC-SDS-PAGE와 xylan-SDS-PAGE는 Lee 등(2016)에 의해 기술된 방법을 따라 수행하였다. 단백질의 전기영동은 0.4 % CMC 또는 xylan을 포함하고 있는 10 % SDS-PAGE를 이용하여 실시하였다. 전개된 단백질의 refolding을 위하여, 1 % (v/v) Triton X-100이 첨가된 10 mM sodium acetate buffer (pH 5.
도심공원으로부터 채취한 토양을 2-mm 직경 체를 이용하여 큰 부피의 토양을 제거한 후 멸균수에 10배씩 희석하여 LB-CMC trypan blue agar 배지 plate에 도말 하여 30도 배양기에서 배양하였다. 배양 48시간 후 균의 주변에 생기는 halo의 유무에 따라 섬유소 분해 균주를 구분하였다. 그 중에 상대적으로 넓은 범위의 halo를 보이는 약 50여개의 박테리아를 동일 배지에 계대배양 하였으며, 상대적으로 높은 활성을 보이는 10개의 박테리아를 순수 분리하였다.
선발된 균주의 액체 배양은 LB배지를 이용하여 30 ^oC, 200 rpm의 조건에서 24시간 진탕 배양하였다. 배양액은 4 ^oC, 3,500 rpm의 환경에서 10분간 원심 분리하여 조효소 액이 들어 있는 상등액을 회수하였으며, CMCase 및 xylanase의 활성 검정에 이용하였다.
토양 내에 존재하는 미생물은 다양한 종류의 다당류 분해 효소들을 생산함으로써 토양의 비옥도 증진뿐만 아니라 토양내의 생태계를 건전하게 유지하게 위해 중요한 역할을 한다. 본 연구는 경남과학기술대학교에 위치한 쥬라기숲에서 0.4 % carboxymethyl cellulose와 0.01 % trypan blue가 첨가된 LB agar plate를 이용하여 CMCase와 xylanase를 생산하는 박테리아를 분리하였다. 16S rRNA 유전자 염기서열 분석과 API kit 분석을 바탕으로 분리된 박테리아는 Bacillus 종에 속하는 것으로 동정되었으며, Bacillus sp.
9에 나타내었다. 분리된 균주의 CMCase와 xylanase의 적정 pH는 40 ^oC에서 pH 3.0-9.0까지 7개의 서로 다른 pH 조건에서 각각 효소활성을 측정하였다. CMCase의 경우 pH 5.
16S rRNA유전자의 염기서열 유사성과 multiple sequence alignment는 National Center for Biotechnology Information (NCBI)에서 제공하는 BLSTN과 CLUSTAL W 프로그램을 이용하여 분석하였다. 분리한 Bacillus 종의 16S rRNA유전자의 염기서열과 기존에 보고된 다른 박테리아의 16S rRNA유전자 염기서열을 이용하여 계통도를 작성하였다. 계통도는 Molecular Evolutionary Genetics Analysis 6.
이에 부가적으로 16S rRNA 유전자의 염기서열을 이용하여 균을 동정하였다. 분리한 균주의 게놈DNA를 주형으로 하여 리보솜의 소단위체를 코딩하는 16S rRNA 유전자 부분을 PCR을 통하여 증폭하였으며, PCR 산물을 pGEMTeasy 벡터(promega)에 클로닝 하여 염기서열을 분석하였다. 염기서열을 이용하여 NCBI site의 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)에 탑재되어 있는 blastn프로그램을 이용하여 16S ribosomal RNA sequences의 데이터베이스와 비교하여 분리된 균을 동정하였다.
5 % 아가로스 겔을 이용하여 전기영동을 실시하였다. 아가로스겔상에서 예상되는 크기에 위치한 DNA를 면도칼로 자른 후 DNA 정제 키트(Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 순수한 DNA를 정제하였다. 정제한 16S rRNA 유전자는 pGEMT-easy 벡터(Promega, Madison, WI, USA)에 클로닝 하여 염기서열을 분석하였다.
GJY 유래 CMCase와 Xylanase의 열 안정성에 대한 결과를 Fig 10에 나타내었다. 열 안정성 평가는 기질 없이 15, 30, 45, 60, 70분까지 배양한 후 남아 있는 효소의 활성을 측정하였다. CMCase의 경우 40 ^oC에서 30분까지 효소활성에 거의 영향을 미치지 않았고 45-70분간 배양 한 후 남아 있는 효소 활성도 80% 이상을 유지하고 있는 것을 보였다.
분리한 균주의 게놈DNA를 주형으로 하여 리보솜의 소단위체를 코딩하는 16S rRNA 유전자 부분을 PCR을 통하여 증폭하였으며, PCR 산물을 pGEMTeasy 벡터(promega)에 클로닝 하여 염기서열을 분석하였다. 염기서열을 이용하여 NCBI site의 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)에 탑재되어 있는 blastn프로그램을 이용하여 16S ribosomal RNA sequences의 데이터베이스와 비교하여 분리된 균을 동정하였다. 그 결과 산림토양으로부터 분리된 균주는 Bacillus subtilis strain IAM 12118 (99 %), Bacillus mojavensis strain IFO15718 (99 %), Bacillus subtilis strain 168 (99 %), Bacillus mojavensis strain ifo 15718 (100 %), Bacillus axarquiensis strain LMG 22476 (100 %), Brevibacterium halotolerans strain DSM 8802 (100 %) 등과 높은 상동성을 보였다.
이상의 생화학적 특성에 기초하여 분석한 결과 본 균주는 Bacillus subtililis/amyloquefaciens/atrophaeus 종일 가능성이 약 98 %이상이었다(Table 1). 이에 부가적으로 16S rRNA 유전자의 염기서열을 이용하여 균을 동정하였다. 분리한 균주의 게놈DNA를 주형으로 하여 리보솜의 소단위체를 코딩하는 16S rRNA 유전자 부분을 PCR을 통하여 증폭하였으며, PCR 산물을 pGEMTeasy 벡터(promega)에 클로닝 하여 염기서열을 분석하였다.
GJY을 2 mL의 LB배지에 접종하여 30 ^oC에서 12시간 이상 배양 하여 원심분리로 회수한 조효소액과, 세포를 분리하여 실험에 사용하였다. 전기영동을 위하여 변성시킨 단백질은 단백질의 전개가 끝난 후 CMCase 또는 xylanase의 활성을 확인하기 위하여 단백질을 refolding 시킨 후 효소반응을 실시하였다. 각각의 효소 반응이 끝난 SDS 겔은 0.
아가로스겔상에서 예상되는 크기에 위치한 DNA를 면도칼로 자른 후 DNA 정제 키트(Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 순수한 DNA를 정제하였다. 정제한 16S rRNA 유전자는 pGEMT-easy 벡터(Promega, Madison, WI, USA)에 클로닝 하여 염기서열을 분석하였다. 16S rRNA유전자의 염기서열 유사성과 multiple sequence alignment는 National Center for Biotechnology Information (NCBI)에서 제공하는 BLSTN과 CLUSTAL W 프로그램을 이용하여 분석하였다.
5 % (w/v) Congo red 로 30분간 SDS-PAGE gel을 염색하고, 1 M NaCl을 이용하여 붉은 색의 배경을 가진 gel에서 옅은 붉은 색의 가수분해 zone이 나타날 때까지 탈색하였다. 최종적으로 선명한 결과 사진을 얻기 위하여 0.1 M HCl을 gel의 배양액에 조금씩 첨가하여 배경색을 변화시켜가며 가수분해 zone이 선명하게 나타날 때 사진을 촬영하였다.

대상 데이터

각기 다른 세 군데의 장소에서 소독한 원예용 모종삽을 이용하여 지표면으로부터 10 cm 아래 부분에서 약 100 g의 토양샘플을 채취하였다.
도시공원 토양으로부터 분리한 목질바이오매스 분해 박테리아균의 동정을 위해 사용된 16S rRNA universal primer는 Forward primer로서 877F: 5'-CGGAGAGTTTGATCCTGG-3'와 Reverse primer로서 878R: 5'-TACGGCTACCTTGTTAGCG AC-3'이었다.
도심공원 토양으로부터 셀룰로오스 가수분해가 가능한 박테리아를 분리하기 위해 LB-CMC trypan blue agar 선발 방법을 이용하였다. 도심공원으로부터 채취한 토양을 2-mm 직경 체를 이용하여 큰 부피의 토양을 제거한 후 멸균수에 10배씩 희석하여 LB-CMC trypan blue agar 배지 plate에 도말 하여 30도 배양기에서 배양하였다. 배양 48시간 후 균의 주변에 생기는 halo의 유무에 따라 섬유소 분해 균주를 구분하였다.
4 % carboxymethyl cellulose (CMC)가 첨가된 Luria-Bertani (LB) agar plate에 100 μL씩 도말 하여 30 ^oC 인큐베이터에서 2일간 배양하였다. 목질바이오매스 분해 박테리아는 균락의 주변에 생기는 밝은 색의 halo의 존재 유무에 근거 하여 선발하였다. 선발된 균주의 액체 배양은 LB배지를 이용하여 30 ^oC, 200 rpm의 조건에서 24시간 진탕 배양하였다.
목질바이오매스 분해 토양 박테리아 분리를 위해 경남과학기술대학교내의 약 60-80년생의 활엽수와 침엽수가 약 8:2의 비율로 이루어진 쥬라기 숲에서 2015년 3월에 토양샘플을 채집하였다. 각기 다른 세 군데의 장소에서 소독한 원예용 모종삽을 이용하여 지표면으로부터 10 cm 아래 부분에서 약 100 g의 토양샘플을 채취하였다.
각기 다른 세 군데의 장소에서 소독한 원예용 모종삽을 이용하여 지표면으로부터 10 cm 아래 부분에서 약 100 g의 토양샘플을 채취하였다. 토양은 실험실로 운반한 후 가는체(2-mm)를 사용하여 큰 부유물을 제거하고 남은 부드러운 토양을 실험에 이용하였다. 토양 1g을 멸균수 9 mL에 첨가하여 소용돌이 교반기를 이용하여 잘 섞어 주었다.

데이터처리

정제한 16S rRNA 유전자는 pGEMT-easy 벡터(Promega, Madison, WI, USA)에 클로닝 하여 염기서열을 분석하였다. 16S rRNA유전자의 염기서열 유사성과 multiple sequence alignment는 National Center for Biotechnology Information (NCBI)에서 제공하는 BLSTN과 CLUSTAL W 프로그램을 이용하여 분석하였다. 분리한 Bacillus 종의 16S rRNA유전자의 염기서열과 기존에 보고된 다른 박테리아의 16S rRNA유전자 염기서열을 이용하여 계통도를 작성하였다.

이론/모형

0) 프로그램에 내장되어 있는 neighbor-joining 방법을 이용하였다(Tamura 등, 2013). 1,000번의 반복에 의해 생성된 데이터를 이용한 Bootstrap 분석은 계통도의 신뢰도와 분지 패턴을 평가하기 위하여 사용하였다.
CMC-SDS-PAGE와 xylan-SDS-PAGE는 Lee 등(2016)에 의해 기술된 방법을 따라 수행하였다.
CMCase와 xylanase 활성은 환원당 정량에 널리 사용되는 DNS법(Nelson, 1994)을 사용하였다. Bacillus sp.
GJY with 16S rRNA gene sequences from other bacteria. The distance matrix was determined using the Kimura two-parameter model. The bootstrap values were calculated with 1000 replicates regenerated with random method.
분리한 Bacillus 종의 16S rRNA유전자의 염기서열과 기존에 보고된 다른 박테리아의 16S rRNA유전자 염기서열을 이용하여 계통도를 작성하였다. 계통도는 Molecular Evolutionary Genetics Analysis 6.0 (MEGA 6.0) 프로그램에 내장되어 있는 neighbor-joining 방법을 이용하였다(Tamura 등, 2013). 1,000번의 반복에 의해 생성된 데이터를 이용한 Bootstrap 분석은 계통도의 신뢰도와 분지 패턴을 평가하기 위하여 사용하였다.
도심공원 토양으로부터 셀룰로오스 가수분해가 가능한 박테리아를 분리하기 위해 LB-CMC trypan blue agar 선발 방법을 이용하였다. 도심공원으로부터 채취한 토양을 2-mm 직경 체를 이용하여 큰 부피의 토양을 제거한 후 멸균수에 10배씩 희석하여 LB-CMC trypan blue agar 배지 plate에 도말 하여 30도 배양기에서 배양하였다.

성능/효과

4). 30 ^oC의 반응온도에서 CMCase와 xylanase의 효소 활성은 최대 활성 온도에 비해서 약 70 % 이상을 가지는 것으로 나타났다. 하지만, 60 ^oC 이상의 반응온도에서는 CMCase와 xylanase의 효소활성이 급격하게 감소하는 경향을 보였다.
1)를 가지고 있었다. AJW87252.1 유전자는 1500 bp의 open reading frame (ORF)를 가지며, 약 55.5 kDa의 단백질을 코딩하고 있는 것으로 나타났다. 그에 반하여 AJW87391.
Bacillus subtilis strain T30 (CP011051.1)의 게놈의 분석에서 하나의 β1,4-betaxylanase (AJW87205.1) homologue 유전자가 존재하는 것으로 나타났다.
0, 40oC에서 최적의 활성을 보였다. CMCase와 xylanase 모두 40, 50^oC에서는 열 안정성을 보였지만, 60^oC 이상에서는 두 효소의 열 안정성이 급격하게 감소하는 경향을 보였다.
0에서의 활성과 비교해서 약 95 % 정도의 활성을 유지하고 있었다. CMCase와 달리 xylanase는 pH 8.0과 pH 9.0과 같은 높은 산도에서도 30% 이상의 효소 활성을 유지하고 있는 것으로 나타났다. 이상의 결과를 살펴보면 Bacillus sp.
이러한 결과는 박테리아의 생장에 공급된 에너지원이 24시간 정도 배양하면 영양분의 대부분이 고갈되기 때문에 더 이상 박테리아 세포의 밀도증가가 일어나지 않는 것으로 보인다. CMCase의 효소 활성은 박테리아 배양 후 4시간부터 급격하게 증가되다가 12시간에 최대의 효소활성을 보였으며 그이 후 약 50 %까지 활성이 줄어들었다(Fig. 3). Xylanase의 효소활성은 CMCase의 효소활성에 대한 상대 활성 값으로 나타내었을 때 약 70 % 정도의 활성을 가지는 것으로 나타났다.
16S rRNA 분석에서 Bacillus sp. GJY와 Bacillus subtilis strain T30 (CP011051.1)의 게놈은 99%이상의 높은 상동성을 보였다. 게놈 분석에 의하면 Bacillus subtilis strain T30은 총 2개의 glucanase 유전자(AJW87252.
GJY의 생장은 배양 후 24시간에 세포밀도가 최고에 도달하였으며 24시간 이후 박테리아의 생장량이 조금씩 감소 하였다(Fig. 3).
Bacillus sp. GJY의 최적 생장온도는 37 oC이었으며, CMCase와 xylanase의 활성은 배양 후 12시간에 최고에 달하였다. CMCase의 경우 pH 5.
3). Xylanase의 효소활성은 CMCase의 효소활성에 대한 상대 활성 값으로 나타내었을 때 약 70 % 정도의 활성을 가지는 것으로 나타났다. Xylanase역시 박테리아 세포의 생장에 따라 활성이 점점 증가하였다.
60 ^oC의 경우 에서 배양한 후 70분까지 약 40%의 활성을 유지하고 있는 결과를 보인 반면 70 ^oC에서 배양했을 경우에는 대부분의 효소활성을 잃어버리는 경향을 보였다. 결론적으로 CMCase 또는 xylanase는 40-50 ^oC 비교적 안정하였지만, 60-70 ^oC에서는 굉장히 불안정한 결과를 보였다. 이러한 결과는 Bacillus sp.
GJY 유래 CMCase와 xylanase의 활성에 영향을 미치는 온도의 영향을 알아보기 위하여 20-70 ^oC 사이의 6가지의 서로 다른 온도에서 각각의 효소활성을 측정하였다. 그 결과 CMCase와 xylanase는 40 ^oC에서 가장 높은 효소활성을 보였으며, 다음으로 50 ^oC로 40 ^oC의 효소활성에 비교해서 약 85%이상의 효소 활성을 가지는 것으로 나타났다(Fig. 4). 30 ^oC의 반응온도에서 CMCase와 xylanase의 효소 활성은 최대 활성 온도에 비해서 약 70 % 이상을 가지는 것으로 나타났다.
그 결과 본 균주는 β-xylosidase, leucine arylamidase, phenylalanine arylamidase, β-galactosidase, L-pyrrolydonyl-arylamidase, α-galactosidase, alanine arylamidase, tyrosine arylamidase, β-glucosidase, β-mannosidase, α-glucosidase, esculin hydrolyase 등과 같은 효소활성을 가지는 것으로 나타났다.
염기서열을 이용하여 NCBI site의 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)에 탑재되어 있는 blastn프로그램을 이용하여 16S ribosomal RNA sequences의 데이터베이스와 비교하여 분리된 균을 동정하였다. 그 결과 산림토양으로부터 분리된 균주는 Bacillus subtilis strain IAM 12118 (99 %), Bacillus mojavensis strain IFO15718 (99 %), Bacillus subtilis strain 168 (99 %), Bacillus mojavensis strain ifo 15718 (100 %), Bacillus axarquiensis strain LMG 22476 (100 %), Brevibacterium halotolerans strain DSM 8802 (100 %) 등과 높은 상동성을 보였다. 게다가 Phylogenetic 분석에 의하면 분리된 균주는 Brevibacterium halotolerans LMG 21660T (AJ620368), Bacillus mojavensis IFO 15718T (AB021191), Bacillus subtilis subsp.
Xylanase역시 박테리아 세포의 생장에 따라 활성이 점점 증가하였다. 배양 후 12시간에 가장 높은 xylanase활성을 보였으며 그 시간 이후 점차 활성이 감소되는 경향을 보였다. 12시간 이후 CMCase와 xylanase의 두 효소활성이 급격하게 감소하는 경향을 보였는데 이러한 이유는 배지 내에 사용 가능한 탄소원의 고갈로 인하여 CMC와 xylanan 분해 단백질의 생합성이 줄어든 원인으로 보인다.
5 %의 NaCl 용액에서 생장이 가능한 반면, kanamycin과 oleandomycin에 대한 저항성은 없었다. 이상의 생화학적 특성에 기초하여 분석한 결과 본 균주는 Bacillus subtililis/amyloquefaciens/atrophaeus 종일 가능성이 약 98 %이상이었다(Table 1). 이에 부가적으로 16S rRNA 유전자의 염기서열을 이용하여 균을 동정하였다.

후속연구

1가 Bacillus sp. GJY에서 CMCase의 활성에 책임지고 있는지에 대하여 알아보기 위하여 유전자의 클로닝, 재조합 단백질을 생산 등의 향후의 연구가 필요할 것으로 보인다. Xylanase의 zymogram분석에서 조효소액과 cell pellet에서 동일하게 약 20 kDa의 부근에 각각 밴드 하나씩이 나타났다.
1유전자가 Bacillus sp. GJY에서 Xylanase의 활성을 책임지고 있을 가능성이 높아 보이지만, 향후 유전자 클로닝과 재조합단백질 생산에 대한 연구가 필요할 것으로 보인다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	Bacillus 종은 왜 산업적으로 많이 쓰이는가?	목질바이오매스 분해에 중요한 역하는 하는 미생물들은 또한 종이산업, 식품 산업, 바이오에탄올 생산 등과 같은 각종 산업에 이용 가능하기 때문에 숲은 우수한 섬유소 분해 미생물을 얻기 위한 좋은 자원 중의 하나이다. 특히, Bacillus 종은 다양한 종류의 목질바이오매스 분해 효소들을 생산하고 곰팡이나 효모에 비해서 생장속도가 굉장히 빠르고, 배양이 쉽고, 유전자 조작이 가능하기 때문에 산업적으로 많이 사용된다(Tjalsma 등, 2004; Khandeparker 등, 2011; Zang과 Zhang 2011). 현재 상업적으로 사용되고 있는 섬유소 분해 효소의 약 50 % 이상은 Bacillus 종으로부터 기원한다(Schallmey 등, 2004).
	숲에 유입되는 대부분의 영양원은 어떤 형체를 형성하고 있는가?	숲에 유입되는 대부분의 영양원은 광합성에 의하여 생성되는 낙엽, 낙지 또는 고사한 식물과 같은 목질바이오매스이다(Potter과 Kloster 1997). 이러한 유기물의 대부분은 β-1,4-glucan의 불용성 섬유로 이루어진 셀룰로오스와 xylan, mannans, glucans을 포함하는 비셀룰로오스 다당류인 헤미셀룰로오스가 리그닌과 강력한 복합체를 형성하고 있다(Urbanová 등, 2015). 피자식물(angiosperm) 목질부의 경우 42-50 %의 셀룰로오스, 25-30 %의 헤미셀룰로오스, 20- 35 %의 리그닌과 약 25-30 %의 수용액으로 이루어져 있다(Whistler과 Richards 1970; Kumar 등, 2008).
	목질바이오매스가 생물의 영양원이 되기 위해서는 무엇이 필요한가?	목질바이오매스는 숲 토양의 특성과 비옥도 개량뿐만 아니라 숲 생태계의 균형을 조절하기 위한 중요한 탄소원으로 제공된다(Potter과 Klooster 1997; Waldrop 등, 2004; Ayres 등, 2009). 목질바이오매스가 숲 생태계를 이루고 있는 생물의 영양원으로 이용되기 위해서는 다당류형태의 목질바이오매스가 단당류로 형태로 전환이 되어야 한다. 다양한 종류의 미생물에 의해 체외로 분비되는 폴리페놀 산화효소, cellulase, xylanase, β-glucosidase와 같은 다양한 종류의 탄수화물 분해효소 등에 의해서 목질바이 오매스는 D-glucose, D-galactose, D-mannose, L-arabinose, Dribose, D-xylose와 같은 단당류와 페놀릭 화합물로 가수분해 된다(Kumar 등, 2008; Urbanová 등, 2015).

참고문헌 (22)

Ayres E, Steltzer H, Berg S, Wall DH (2009) Soil biota accelerate decomposition in high-elevaion forests by specializing in the breakdown of litter produced by the plant species above them. J Ecol 97: 901-912

상세보기
Demain AL, Newcom M, Wu JHD (2005) Cellulase, clostridia, and ethanol. Microbiol Mol Bio Rev 69: 124-154

상세보기
Khandeparker R, Verma P, Deobagkar D (2011) A novel halotolerant xylanase from marine isolate Bacillus subtilis cho40: gene cloning and sequencing. N Biotechnol. 28: 814-821

상세보기
Kim YK, Lee SC, Cho YY, Oh HJ (2012) Isolation of cellulolytic Bacillus subtilis strains from agricultural environments. ISRN Microbiol Article ID 650563 1-9
Kuhad RC, Gupta R, Singh A (2011) Microbial cellulases and their industrial applications. Enzyme Res ID 280696 1-10
Kuhad RC, Manchanda M, Singh A (1999) Hydrolytic potential of extracellular enzymes from a mutant strain of Fusarium oxysporum. Bioprocess Engineering 20(2): 133-135

상세보기
Kumar R, Singh S, Singh OV (2008) Bioconversion of lignocellulosic biomass: biochemical and molecular perspectives. J Ind Microbiol Bioechnol. 35: 377-391

상세보기
Lee CK, Jang MY, Park HR, Choo GC, Cho HS, Park SB, Oh KC, An JB, Kim BG (2016) Cloning and characterization of xylanase in cellulolytic Bacillus sp. strain JMY1 isolated from forest soil. App Bil Chem 59(3): 415-423

상세보기
Min SY, Kim BG, Lee C, Hur HG, Ahn JH (2002) Purification, characterization, and cDNA cloning of xylanase from Fungus Trichoderma strain SY. J. Microbiol biotechnol 12: 890-894

원문보기 상세보기
Potter CS, Klooster SA (1997) Global model estimates of carbon and nitrogen storage in litter and soil pools: Response to change in vegetation quality and biomass allocation. Tellus 49: 1-17

상세보기
Qu W, Shao W (2011) Cloning, expression and characterization of glycoside hydrolase family 11 endoxylanase from Bacillus pumilus ARA. Biotechnol Lett 33: 1407-1416

상세보기
Schallmey M, Singh A, Ward OP (2004) Developments in the use of Bacillus species for industrial production. Can J Microbiol 50: 1-17

상세보기
Sukumaran RK, Singhania RR, Pandey A (2005) Microbial cellulasesproduction, applications and challenges. Journal of Scientific and Industrial Research. 6(11): 832-844
Sun Y, Cheng J (2002) Hydrolysis of lignocellulosic materials for ethanol production: a review. Bioresource Technology 83(1): 1-11

상세보기
Tamura K, Stecher G, Peterson D, Filipski A, Kumar S (2013) MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0. Mol Biol Evol 30: 2725-2729

상세보기
Tjalsma H, Antelmann H, Jongbloed JD, Braun PG, Darmon E, Dorenbos R, Dubois JY, Westers H, Zanen G, Quax WJ, Kuipers OP, Bron S, Hecker M, van Dijl JM (2004) Proteomics of protein secretion by Bacillus subtilis: separating the secrets of the secreome. Microbiol Mol Biol Rev 68: 207-233

상세보기
Urbanova M, Snajdr J, Baldrian P (2015) Composition of fungal and bacterial communities in forest litter and soil is largely determined by dominant trees. Soil Biol Biochem 84: 53-64

상세보기
Waldrop MP, Zak DR, Sinsabaugh RL, Gallo M. Lauber C (2004) Nitrogen deposition modifies soil carbon storage through changes in microbial enzymatic activity. Eco Appl 14: 1172-1177

상세보기
Whistler RL, Richards EL (1970) Hemicelluloses. In: Pigman W, Horton D, editors. The carbohydrates. New York: Academic press. 173: 697-703
Wilson DB (2011) Microbial diversity of cellulose hydrolysis. Curr Opin Microbiol 14: 1-5

상세보기
Yang JK, Zhang JJ, Yu HY, Cheng JW, Miao LH (2014) Community composition and cellulase activity of cellulolytic bacteria from forest soils planted broad-leaved deciduous and evergreen trees. Appl Microbiol Biotechnol 98: 1449-1458

상세보기
Zang XZ, Zhang YHP (2011) Simple, fast and high-efficiency transformation system for directed evolution of cellulase in Bacillus subtilis. Microbial Biotechnology 4: 98-105

상세보기

저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

내보내기 구분	파일저장 인쇄 메일전송
구성항목	기본정보 상세정보 관리번호, 논문명, 저널/프로시딩명, 저자 , 발행년, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, 발행기관 관리번호, 논문명, 대등논문명, 저자 , 저널/프로시딩명, 발행기관, 발행년, 발행언어, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, ISBN, ISSN, 주제분야, 키워드, 초록(한글), 초록(영문), 저자(소속기관)
저장형식	Text(ASCII format) Excel format RefWorks Direct Export RIS format (for Reference Manager, ProCite, EndNote), Scholar's Aids, Mendeley
메일정보	받는사람 (필수) @ 보내는사람 (선택) @ 제목 내용 KISTI 검색결과 이메일 서비스
안내	총 건의 자료가 검색되었습니다. 다운받으실 자료의 인덱스를 입력하세요. (1-10,000) 검색결과의 순서대로 최대 10,000건 까지 다운로드가 가능합니다. 데이타가 많을 경우 속도가 느려질 수 있습니다.(최대 2~3분 소요) 다운로드 파일은 UTF-8 형태로 저장됩니다. 파일의 내용이 제대로 보이지 않을실 때는 웹브라우저 상단의 보기 -> 인코딩 -> 자동선택 여부를 확인하십시오. ~ Text(ASCII format) Excel format

연합인증