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문제 정의
- 이에 본 연구에서는 부산지역 2011년 1월에서 2013년 11월까지 급성호흡기감염증으로 내원한 환자에서 호홉기바이러스 검사를 시행하여 아데노바이러스 및 보카바이러스의 특징적인 임상증상과 연도별 계절적 유행양상을 알아보고 바이러스별 계통과 유전적 변이를 분석하여 호흡기 감염증의 진단, 치료 및 예방에 필요한 정보를 제공하고자 하였다.
제안 방법
- 접종 후 7일 동안 CPE가 관찰되지 않을 경우 1차로 배양한 세포배양액 200 μl를 새로 배양한 세포에 한 번 더 접종하여 7일 더 배양하였다. CPE가 확인된 well의 세포배양액에서 핵산을 추출하여 염기서열 분석에 사용하였다.
- 보카바이러스로 확인된 검체 중 68건을 염기서열 분석을 위해 Nested PCR를 시행하였다. Primer는 보카바이러스 1~4형에 특이적인 VP1/2 유전자의 염기서열을 분석하기 위한 것으로, 1차 PCR primer로 VP-F1, VP-R2를, nested PCR primer로 VP-F2, VP-R2을 이용하여 다음과 같은 조건으로 실시하였다. 1차 PCR에서는 95℃ 35초, 58℃ 1분(각 cycle마다 0.
- 그 후, 전처리된 바이러스 접종용 검체를 200 μl씩 접종하고 2% FBS가 포함된 DMEM 배지를 첨가하여 5% CO2, 35℃ 조건에서 7일간 배양하며, 세포병변효과(cytopathic effect: CPE)를 관찰하였다.
- 추출된 핵산을 진단키트에 각각 첨가한 후, 실시간 유전자 증폭기 ABI 7500 Fast System (Applied Biosystems, USA)을 사용하여 유전자 진단을 하였다. 반응은 ADV와 hBoV의 경우, 50℃ 2분 1회, 95℃ 10분 1회, 95℃ 15초, 60℃ 1분 40회 조건으로 실시하였고 나머지 바이러스는 역전사반응을 위해 50℃ 30분을 초기에 포함시켜 실시하였다.
- 보카바이러스로 확인된 검체 중 68건을 염기서열 분석을 위해 Nested PCR를 시행하였다. Primer는 보카바이러스 1~4형에 특이적인 VP1/2 유전자의 염기서열을 분석하기 위한 것으로, 1차 PCR primer로 VP-F1, VP-R2를, nested PCR primer로 VP-F2, VP-R2을 이용하여 다음과 같은 조건으로 실시하였다.
- 아데노바이러스로 확인된 검체 257건을 염기서열 분석을 위해 바이러스 배양을 실시하였다. 검체 1 ml에 penicillin (5 units/ml) / streptomycin (5 μg/ml) 및 nystatin (1,000 units/ml)을 첨가하여 4℃에서 1시간 방치한 후, 3,000 rpm 으로 20분간 원심 분리하여 상층액을 바이러스 접종용 검체로 사용하였다.
- 1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, USA)와 ABI 3730XLGenetic Analyzer (Applied Biosystems, USA)를 이용해 염기서열 분석을 하였다. 염기서열분석을 위한 primer는 PCR에 사용한 것과 같으며, 확인된 염기서열은 ClustalX를 이용하여 align하였다. 계통분석은 MEGA 4를 사용하여 Kimura 2-parameter의 근린결합분석(neighbor-joining: NJ)방법으로 시행하였고 계통수 분지에 대한 지지도를 측정하기 위해서 NJ의 부스트랩(bootstrap)값을 1,000회 반복하였다.
- 운반된 검체 140 μl을 QIAamp viral RNA Mini kit (QIAGEN, Germany)를 이용하여 핵산을 추출하였다.
- 증폭된 DNA는 ExoSAP-IT kit (Affymetrix, USA)를 이용하여 정제하였다. 이를 주형으로 하여 Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, USA)와 ABI 3730XLGenetic Analyzer (Applied Biosystems, USA)를 이용해 염기서열 분석을 하였다. 염기서열분석을 위한 primer는 PCR에 사용한 것과 같으며, 확인된 염기서열은 ClustalX를 이용하여 align하였다.
- 증폭된 DNA는 ExoSAP-IT kit (Affymetrix, USA)를 이용하여 정제하였다. 이를 주형으로 하여 Terminator v3.
- 운반된 검체 140 μl을 QIAamp viral RNA Mini kit (QIAGEN, Germany)를 이용하여 핵산을 추출하였다. 추출된 핵산은 다중 실시간 PCR/RTPCR 시약(multiplex real-time PCR/RT-PCR kit)으로 구성된 kit를 이용하여 8종 16아형 호흡기바이러스 ADV, hBoV, PIV(type 1, 2, 3), hCoV (229E, OC43, NL63), RSV (type A, B), hMPV, hRV, IFV (A/H1N1pdm09, A/H3N2, A/H5N1, B)를 검사하였다.
- 추출된 핵산을 진단키트에 각각 첨가한 후, 실시간 유전자 증폭기 ABI 7500 Fast System (Applied Biosystems, USA)을 사용하여 유전자 진단을 하였다. 반응은 ADV와 hBoV의 경우, 50℃ 2분 1회, 95℃ 10분 1회, 95℃ 15초, 60℃ 1분 40회 조건으로 실시하였고 나머지 바이러스는 역전사반응을 위해 50℃ 30분을 초기에 포함시켜 실시하였다.
- 추출한 핵산은 Maxim PCR PreMix Kit (iNtRON Biotechnology, Korea)를 사용하여 95℃ 15분 1회로 초기변성 시킨 후, 95℃ 20초, 54℃ 40초, 72℃ 1분 35회, 72℃ 5분의 조건으로 PCR을 수행하였다. PCR 생성물은 1% agarose gel (Invitrogen, USA)에 2 μl씩 loading하여 100 V에 30분간 전기영동 하였다.
대상 데이터
- 2011년 1월부터 2013년 11월까지 부산시내 1, 2차 병의원을 내원한 3,230명의 급성호흡기감염증환자를 대상으로 8종의 호흡기바이러스를 확인진단 하였으며 이 중 아데노바이러스, 보카바이러스에 대한 연구를 진행하였다.
- 이 중 아데노바이러스와 보카바이러스를 살펴보면, 아데노바이러스는 1953년 소아의 편도와 아데노이드 조직을 이용해 폴리오바이러스를 연구하던 중 분리된 것으로 아데노바이러스과(Adenoviridae)에 속한다. 대략 3.5 kb 길이의 double strand DNA바이러스이며 피막은 252 개의 캡소머(capsomere)로 구성되어있다. 캡소머는 240 개의 헥손(hexon)과 12개의 펜톤(penton)으로 구성되어 캡시드(capsid)를 형성하고 펜톤은 정 20면체의 각 꼭지점으로 바이러스 입자 내부에 펜톤 기저와 외부에 돌출된 화이버(fiber)를 가지고 있다[20].
- 검체 1 ml에 penicillin (5 units/ml) / streptomycin (5 μg/ml) 및 nystatin (1,000 units/ml)을 첨가하여 4℃에서 1시간 방치한 후, 3,000 rpm 으로 20분간 원심 분리하여 상층액을 바이러스 접종용 검체로 사용하였다. 바이러스 분리를 위해 질병관리본부 호흡기바이러스과로부터 분양 받은 human laryngeal carcinoma (HEp-2)를 사용하였고 세포는 5% fetal bovine serum (FBS, Gibco, USA)이 첨가된 Dulbecco`s minimum essential medium (DMEM, Gibco, USA) 배지를 사용하여 5% CO2, 37℃에서 배양하였다. 24-well 배양용기에 단층 배양한 후, 세포의 밀도가 약 70%정도 되었을 때 세포배양액을 제거하고 phosphate buffered saline buffer (PBS)를 이용하여 2회 세척하였다.
- 아데노바이러스 분리주 중 세포병변효과(cytopathic effect: CPE)를 보인 2011년 14건, 2012년 49건, 2013년 114건에 대하여 유전자분석을 통한 아형을 확인하였다. 확인된 아데노바이러스는 subgroup B에 속하는 3형, subgroup C에 속하는 1, 2, 5, 6형, subgroup D에 속하는 8형 그리고 subgroup E에 속하는 4형이었으며 이 중 2011년 14건 중 1형 6건, 3형 3건, 2형․4형이 각 2건, 6형 1건이었고 2012년 49건 중 3형․4형이각 16건, 2형 8건, 1형 5건, 5형 3건, 8형 1건이었으며, 2013년 114건 중 3형 62건, 4형 25건, 2형 12건, 5형 8건, 1형 6건, 6형 1건이었다.
- 보카바이러스는 2005년 9월 스웨덴에서 호흡기감염증을 가진 소아의 비인두 흡인물에서 확인된 것으로 파보바이러스과(Parvoviridae)에 속한다. 정 20면체 구조를 가진 선형의 single strand DNA바이러스로 대략 5.2 kb 길이의 2 개의 비구조단백질인 NS1과 NP1 그리고 두개의 capsid 단백질인 VP1과 VP2를 인코딩하는 open-reading frame 3 개로 이루어져 있다. 현재 보카바이러스 1, 2, 3, 4형의 유전자형이 보고되어 있고 보카바이러스 2형의 경우 nonstructure gene의 nucleotide의 차이에 의해 A와 B로 다시 나뉘어진다[10].
데이터처리
- 염기서열분석을 위한 primer는 PCR에 사용한 것과 같으며, 확인된 염기서열은 ClustalX를 이용하여 align하였다. 계통분석은 MEGA 4를 사용하여 Kimura 2-parameter의 근린결합분석(neighbor-joining: NJ)방법으로 시행하였고 계통수 분지에 대한 지지도를 측정하기 위해서 NJ의 부스트랩(bootstrap)값을 1,000회 반복하였다.
- 채취된 검체에 대해서는 성별, 연령별, 임상증상, 과거력 등의 임상정보들을 동시에 확보하였다. 확보된 자료의 분석은 급성호흡기환자 3,230명 중 3,150명에 대하여 실시하였고, 통계 처리는 SPSS version 21.0 (SPSS Inc Chicago, IL, USA) 프로그램을 이용하였다.
성능/효과
- 아데노바이러스는 연중 검출되는 바이러스로 알려져 있는데[13, 16] 본 연구에서도 모든 달에 걸쳐서 검출되었다(2011년 8월 제외). 2013년에는 2011, 2012년에 비해 검출률이 2배 정도 높았고 2011년에는 봄(3~6월), 2012년에는 가을(9~11월), 2013년에는 여름(6~8월)에 검출률이 높은 것으로 나타났으며, 여름철에 아데노바이러스 검출률이 높은 해는 아데노바이러스에 의한 급성호흡기감염증이 크게 유행함을 알 수 있었다[14, 22](Fig. 3).
- 4%)을 보였으며, 이는 6세 이하의 영유아에서 가장 발병률이 높다는 이전의 연구[15, 22]와도 일치하는 결과였다. 3년 동안의 추이를 살펴보면 아데노바이러스의 경우, 20~49세의 검출률이 줄어드는데 비해 상대적으로 1~5세의 검출률은 늘어나는 것을 확인할 수가 있었다. 보카바이러스의 경우에는 6~19세 이하 검출률이 줄어들었고 1세 미만의 검출률이 늘어난 것으로 확인되었다(Fig.
- Subgroup B에 속하는 79주는 모두 아데노바이러스 3형으로 분석한 염기서열 부위가 기존에 보고된 분리주(accession no. AF542129, KC747639)와 98~99%의 상동성을 보였고, subgroup C에 속하는 분리주 중 2형은 22주로 기존 분리주(accession no. AY224391)와 1형은 17주로 기존 분리주(accession no. AB43323, AB43327)와 5형은 11주로 기존 분리주(accession no. AF542121, KC747641)와 6형은 2주로 기존 분리주(accession no. KC747642)와 98~99%의 상동성을 보였다. subgroup E에 속하는 아데노바이러스 4형은 43주로 기존 분리주(accession no.
- KC747642)와 98~99%의 상동성을 보였다. subgroup E에 속하는 아데노바이러스 4형은 43주로 기존 분리주(accession no. KC747640)와 97~99%의 상동성을, subgroupD에 속하는 8형은 1주로 기존 분리주(accession no. KC747644)와 98%의 상동성을 보였다(Fig. 5).
- 5%)이었다. 그리고 보카바이러스는 총 검출 건수 68건 중에 45건(66.2%)가 단독 검출이었고, 2개 바이러스가 확인된 중복검출은 18건(26.5%)이었으며, 3건(4.4%)은 3개 바이러스가 검출되었다(Table 4). 보카바이러스는 호흡기바이러스 중에 중복감염률이 호흡기검체에서는 최대 83%, 대변검체에서는 최대 100%로 높다고 보고되고 있는데[8] 본 연구결과에서는 중복감염이 33.
- 급성호흡기감염증환자 3,230명 중 204명의 검체에서 아데노바이러스가 단독 검출되었고, 2개 이상의 바이러스가 확인된 중복검출은 53건(20.6%)이었다. 이 중 2개 바이러스가 검출된 것은 50건(19.
- 0%)의 호흡기바이러스가 검출되었다. 라이노바이러스와 인플루엔자바이러스가 각각 482건(14.9%), 304건(9.4%)으로 가장 많이 검출되었으며, 아데노바이러스가 257건(8.0%), 파라인플루엔자바이러스가 152건(4.7%), 호흡기세포융합바이러스가 129건(4.0%), 코로나바이러스가 77건(2.4%), 보카바이러스가 68건(2.1%) 그리고 휴먼메타뉴모바이러스가 16건(0.5%)검출되었다(Table 2). 급성호흡기감염을 일으키는 주요인자로 라이노바이러스, 인플루엔자바이러스, 아데노바이러스라 볼 수 있으며 이는 기존 보고와도 일치한다[9, 14].
- 바이러스별 주요증상은 아데노바이러스의 경우 발열(83.7%), 콧물(53.7%), 기침(53.3%), 인후통(31.9%), 가래(27.6%)였고 기타증상으로는 눈꼽, 결막충혈, 복통, 설사 등이 있었으며 통계적으로 유의한 증상으로는 발열, 두통으로 나타났다(p<0.001).
- 3년 동안의 추이를 살펴보면 아데노바이러스의 경우, 20~49세의 검출률이 줄어드는데 비해 상대적으로 1~5세의 검출률은 늘어나는 것을 확인할 수가 있었다. 보카바이러스의 경우에는 6~19세 이하 검출률이 줄어들었고 1세 미만의 검출률이 늘어난 것으로 확인되었다(Fig. 2)
- 아데노바이러스(n=257) 및 보카바이러스(n=68) 검출 환자의 임상특성을 살펴본 결과(Table 3), 빈번하게 나타나는 임상 증상은 발열로 확인되었고 발열과 관련이 있다는 기존 보고와도 일치한다[9, 22]. 바이러스별 주요증상은 아데노바이러스의 경우 발열(83.
- 이 중 아데노바이러스가 검출된 환자는 남자 138명(8.6%), 여자 116명(7.1%)이었고, 보카바이러스가 검출된 환자는 남자 44명(2.8%), 여자 24(1.5%)명으로 남자가 여자보다 아데노바이러스, 보카바이러스로 인한 호흡기감염증에 취약한 것으로 나타났으며, 통계적으로도 유의한 것으로 나타났다(p<0.05).
후속연구
- 본 연구에서 아데노바이러스 및 보카바이러스의 특징적인 임상증상과 연도별 계절적 유행양상들은 호흡기 감염증의 진단, 치료 및 예방에 필요한 기초정보를 제공할 수 있을 것이다. 그리고 바이러스별 계통 및 유전적 변이 분석을 통해 변종을 포함한 새로운 바이러스를 확인하는데 중요한 정보로 사용될 수 있을 것으로 사료된다.
- 본 연구에서 아데노바이러스 및 보카바이러스의 특징적인 임상증상과 연도별 계절적 유행양상들은 호흡기 감염증의 진단, 치료 및 예방에 필요한 기초정보를 제공할 수 있을 것이다. 그리고 바이러스별 계통 및 유전적 변이 분석을 통해 변종을 포함한 새로운 바이러스를 확인하는데 중요한 정보로 사용될 수 있을 것으로 사료된다.
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