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문제 정의
- 본 연구에서는 저비용 고효율의 astaxanthin을 생산하고, 이를 양식 어류 사료 첨가제로 개발하기 위한 기초 데이터를 제공하고자 한국 연근해에서 분리·동정된 C40계열 carotenoids 중 최종산물로 astaxanthin을 생합성하는 Paracoccus haeundaensis를 돌연변이 유도를 통해 astaxanthin 생합성 효율이 높은 변이주로 전환 시키고, 이들로부터 최적의 배양 조건과 astaxanthin 생합성 조건을 분석하고자 한다.
- 미생물의 carotenoid 함량은 활성 산소의 수준과 carotenoid 생합성에 관여하는 효소의 활성에 따라 각 개체의 carotenoid 생산량이 달라진다. 이에 본 연구에서는 UV 등을 이용하여 astaxanthin 생합성 균주인 P. haeundaensis (wild type strain)의 변이주를 제조하여 고함량의 astaxanthin 생산 변이주를 발굴하였다.
제안 방법
- Astaxanthin 생산량을 증대시키는 조건(UV 20 min, EMS 400 mM)을 순차적으로 wild type에 처리하여 UV와 EMS를 동시 처리한 돌연변이 균주를 확보하였으며, 이를 변이주를 PUE로 명명하였다. PU20, PE400, PUE 변이주의 astaxanthin 생산량을 비교한 결과 PUE 변이주에서 70.
- 22 μm, nylon filter)를 이용해 여과하여 HPLC 분석 시료로 사용하였다. HPLC 분석은 Bio-rad(Hercules, CA, U.S.A.)사의 automated biologic HR system(#750-0047)을 이용하였다. Column은 Nova-Pak HR 6U C18 column (3.
- PUE 변이주의 온도 변화 조건은 15~42℃이며, pH는 4~13, NaCl 농도는 0~7%으로 설정하였다. 각 조건에서 가장 높은 astaxanthin 생산량을 조사한 결과 온도 변화의 경우 37~42℃구간에서 10.
- PUE 변이주의 탄소원과 질소원의 영향에 따른 astaxanthin 생산량 변화를 분석하기 위해서 1% 탄소원 8종류(Lactose, Mannitol, Fructose 등)와 3% 질소원 4종류(ammonium sulfate, ammonium chloride 등)를 첨가하여 사용하였다. PUE 균주의 배양에 사용된 배지 및 HPLC 분석법은 재료 및 방법에 설명하였다.
- Wild type 균주의 돌연변이 유도를 위하여 돌연변이원으로 UV 및 EMS를 각기 다른 조사 시간과 농도로 처리하였다. 최초 wild type 균주를 1×106cells/ml이 되도록 배양한 후 UV조사의 경우 5, 10, 15, 20, 25, 30 min 단위로 조사하였으며, EMS의 경우 10, 50, 100, 200, 400 mM의 농도를 처리하여 돌연변이를 유도하였다.
- Wild type와 PUE 변이주의 최적 배양 조건하에서의 astaxanthin 생산량을 비교하였다. 앞선 연구 결과에서 관찰된 astaxanthin 생산량 증대를 위한 최적 조건을 충족하기 위하여 1% raffinose와 3% potassium nitrate를 기본 배지인 PPES-II 배지에 첨가하여 200 ml의 배지를 제조하였다.
- 앞선 연구 결과에서 관찰된 astaxanthin 생산량 증대를 위한 최적 조건을 충족하기 위하여 1% raffinose와 3% potassium nitrate를 기본 배지인 PPES-II 배지에 첨가하여 200 ml의 배지를 제조하였다. 그리고 제조된 배지에 wild type과 PUE 변이주를 1%씩 접종하여 25℃, 150rpm에서 72시간 동안 배양하여 각 균주에서 생산된 astaxanthin 함량을 비교하였다.
- 돌연변이 유발을 위하여 UV 조사와 EMS를 이용하였다. UV 돌연변이는 PPES-II broth에서 25℃, 150 rpm 조건으로 24시간 동안 배양한 다음 OD600 값 0.
- Post-running은 10분간 이루어졌으며, Column 내 유속은 분당 1 ml이 되게 하였다. 분리된 astaxanthin은 photodiode array detector를 이용하여 absorption maxima인 470 nm에서 측정하여 표준물질과 비교분석하였으며, astaxanthin standard는 Sigma-Aldrich에서 구입하였다.
- 선별된 PUE 변이주에 대하여 온도, pH, NaCl 농도에 따른 astaxanthin 생산량을 분석하기 위해서 재료 및 방법에 설명한 PPES-II 배지를 이용하여 각 조건에 대한 astaxanthin 생산량을 HPLC (재료 및 방법 참조)로 분석하였다. 변이주에 대한 온도, pH, NaCl의 최적 조건은 Lee 등[12]이 발표한 논문을 참조로 하였다.
- Wild type와 PUE 변이주의 최적 배양 조건하에서의 astaxanthin 생산량을 비교하였다. 앞선 연구 결과에서 관찰된 astaxanthin 생산량 증대를 위한 최적 조건을 충족하기 위하여 1% raffinose와 3% potassium nitrate를 기본 배지인 PPES-II 배지에 첨가하여 200 ml의 배지를 제조하였다. 그리고 제조된 배지에 wild type과 PUE 변이주를 1%씩 접종하여 25℃, 150rpm에서 72시간 동안 배양하여 각 균주에서 생산된 astaxanthin 함량을 비교하였다.
- 2B). 이 결과를 바탕으로 EMS 400 mM로 처리한 변이주를 PE400으로 지정하였다. 화학적 돌연변이 유도에 관한 선행 연구인 Kamath [19] 등이 발표한 논문과 비교 시 H.
- 그 후 50 mM PBS 완충액에 현탁하여 PPES-II 평판 배지에 도말하여 생존율 및 변이주를 분리하였다[4]. 이와 같은 방법으로 각 돌연변이원에 대한 변이주를 선별하였으며, 우수 균주 선별을 위해서는 각각의 방법을 혼합하여 wild type 균주와 각각의 변이주의 astaxanthin 생산량을 HPLC로 비교 분석하였다.
- 1(약 106 cells/ml)이 되도록 희석하여 멸균된 평판에 200 μl을 분주하였다. 이후 무균 평판에서부터 광원과의 거리를 20 cm로 고정한 후 조사 시간은 5-30 min 동안 UV (UV lamp: 254 nm, 30 W)를 조사하고 항온 배양기 25℃에서 18시간 동안 배양 후 PPES-II 평판 배지(1.5% agar 함유)에 도말하여 25℃에서 3일간 배양, 그 생존율 및 변이 균주를 분리하였다[22]. EMS 돌연변이는 PPES-II broth에서 상기 배양법과 동일하게 배양하여 균체를 원심분리하고 50 mM Phosphate buffered saline (PBS buffer) 완충액(pH 5.
- 최종 선별된 변이주의 배양조건 최적화를 위하여 탄소원, 질소원, 온도, pH, NaCl 농도 변화에 따른 변이주의 astaxanthin 생산량을 HPLC로 비교 분석하였으며, 균주 배양은 앞서 설명한 wild type 배양법과 동일하게 진행하였다.
- 최초 wild type 균주를 1×106cells/ml이 되도록 배양한 후 UV조사의 경우 5, 10, 15, 20, 25, 30 min 단위로 조사하였으며, EMS의 경우 10, 50, 100, 200, 400 mM의 농도를 처리하여 돌연변이를 유도하였다.
대상 데이터
- 본 연구에 사용된 Ethyl methanesulfonate (EMS), Ferric citrate 및 그 외의 일반 시약은 Sigma Chemical사의 특급 및 일반 시약을 사용하였고, Bacto-Tryptone, Bacto-Soytone, BactoYeast extract, Poly peptone, NaCl은 Difco사에서 구입하였다. Astaxanthin 표준시약(Sigma, St.
- 본 연구에 사용된 균주는 부산 해운대 연안에서 분리·동정된 밝은 오렌지색 색소를 띄는 Paracoccus haeundaensis이며, 이 균주는 PPES-II (0.2 g polypeptone, 1.0 g bacto soytone, 1.0 g proteose peptone, 1.0 g yeast extract, 3% NaCl, 0.1% ferric citrate) 배지를 이용하여 25℃, 48시간 진탕 배양하여 실험에 사용하였다.
- 탄소원으로는 단당류인 glucose, lactose, mannitol, fructose, maltose, sucrose, raffinose, galactose를 사용하였다. Astaxanthin 함량을 가장 높이 증대시킨 탄소원은 glucose, lactose, fructose, raffinose이었으며, 1% 첨가 시 81.
데이터처리
- 대조군과 실험 군간의 유의성 검정은 Student’s t-test를 통해 이루어졌으며, p<0.05일 때 유의적인 차이가 있는 것으로 판단하였다.
이론/모형
- Carotenoid 추출은 Johnson 등[9] 발표한 논문을 참고하여 배양된 균주로 부터 carotenoid를 추출하였으며, 그 과정은 다음과 같다. 균주 배양액 1 ml를 13,000 rpm, 5분간 원심 분리하여 상층액을 제거하고, pellet에 90% acetone 1 ml을 첨가 후 3분간 homogenizer를 이용하여 세포를 파쇄한다.
- 선별된 PUE 변이주에 대하여 온도, pH, NaCl 농도에 따른 astaxanthin 생산량을 분석하기 위해서 재료 및 방법에 설명한 PPES-II 배지를 이용하여 각 조건에 대한 astaxanthin 생산량을 HPLC (재료 및 방법 참조)로 분석하였다. 변이주에 대한 온도, pH, NaCl의 최적 조건은 Lee 등[12]이 발표한 논문을 참조로 하였다.
성능/효과
- Astaxanthin 함량을 가장 높이 증대시킨 탄소원은 glucose, lactose, fructose, raffinose이었으며, 1% 첨가 시 81.8~84.3 μg/ml의 함량을 보여 PPES-II 배지에서 배양하여 생산된 astaxanthin 함량 보다 약 2배 정도의 함량이 증가하는 것으로 밝혀졌다(Fig. 4B).
- EMS 처리에 따른 변이주 선별을 위하여 UV 조사 선별법과 동일하게 실험을 진행하였으며, 그 결과 EMS를 농도별 처리시 세포 생존율이 UV 처리와 유사하게 감소되는 경향성을 보였다(Fig. 2A). EMS 처리 시 세균 세포 생존율은 10 mM에서 94.
- NaCl 농도는 해양성 세균인 P. haeundaensis의 특성을 그대로 유지하는 것으로 분석되며 생산량은 3~4% NaCl 농도에서 70.2±1.2 μg/ml(p<0.05)로 astaxanthin 생산 효율이 가장 높은 것으로 분석되었다(Fig. 3C).
- PU20, PE400, PUE 변이주의 astaxanthin 생산량을 비교한 결과 PUE 변이주에서 70.7±1.3 μg/g의 astaxanthin을 생합성하는 것으로 분석되어, wild type 균주를 포함하여 astaxanthin을 가장 많이 생산하는 것으로 확인되었으며(Table 1), wild type 균주와 비교하여 약 1.6배(p<0.05)로 유의적으로 증가한 것으로 분석되었다.
- PUE는 wild type과 비교 시 높은 astaxanthin 생산량을 보이는 것을 확인하였다. 이러한 생산량 증대를 이룬 이유는 Pollmann [18] 등이 설명한 바와 같이 돌연변이원의 작용에 의한 carotenoid 생합성 경로에 작용하는 효소 활성 증가(혹은 관련 유전자의 변이)와 활성산소 증가에 따른 세균 세포의 방어 기작으로 카로티노이드 생산량 증대 등으로 알려져 있다.
- 1A). UV 조사에 의한 변이주 선별은 각 시간대별 형성된 colony 중 가장 선명하게 밝은 오렌지색을 보이는 colony 6 개(각 시간대별 1 개의 colony)를 선별하였으며, 이들로부터 biomass와 astaxanthin 생산량을 분석한 결과, UV 조사에 의해 선별된 6개의 colony는 wild type에 비해 PPES-II 배지에서의 성장 속도가 늦어지는 것을 확인 할 수 있었다. 이는 wild type대비 선별된 변이주의 biomass 양이 감소하는 결과가 도출되었다.
- 각 조건에서 가장 높은 astaxanthin 생산량을 조사한 결과 온도 변화의 경우 37~42℃구간에서 10.2±0.5 μg/ml로 가장 낮은 생산량을 보였고, 25℃에서 70.9±1.6 μg/ml (p<0.05)로 유의적으로 가장 높은 생산량을 보였다(Fig. 3A).
- 그 결과 UV의 경우 조사 시간에 비례하여 colony 수가 감소하는 것을 알 수 있었으며, 세포 사멸율은 조사 시간 15 min이상에서 50% 이하의 생존율을 보이는 것을 확인하였다(Fig. 1A). UV 조사에 의한 변이주 선별은 각 시간대별 형성된 colony 중 가장 선명하게 밝은 오렌지색을 보이는 colony 6 개(각 시간대별 1 개의 colony)를 선별하였으며, 이들로부터 biomass와 astaxanthin 생산량을 분석한 결과, UV 조사에 의해 선별된 6개의 colony는 wild type에 비해 PPES-II 배지에서의 성장 속도가 늦어지는 것을 확인 할 수 있었다.
- 이는 wild type대비 선별된 변이주의 biomass 양이 감소하는 결과가 도출되었다. 그러나 astaxanthin 생산량의 경우 5, 10 min 구간에서 선별된 변이주의 경우 wild type과 비교적 동일한 생산량을 보였으나, 15 min 이후 구간에서 선별된 변이주는 생산량이 증가되었다. 최대 생산량을 보이는 변이주는 UV 조사 20 min구간에서 선별된 변이주로 64.
- 또한, EMS 처리 후 제조된 각 변이주(처리농도당 1개의 colony 선별)의 astaxanthin 생산량을 비교한 결과 EMS 400 mM 처리에 의해 제조된 변이주에서 가장 높은 astaxanthin을 생합성하는 것으로 밝혀졌으며, astaxanthin 생산량은 최대 51.1±2.9 μg/ml였다.
- 또한, 효과적인 4종류의 당류 중 가장 효과적인 당은 1% raffinose로 함량은 84.3±1.2 μg/ml이었다(p<0.05).
- 모든 군의 실험 결과 수치는 평균±표준 오차(mean±SEM)로 나타내었다.
- pluvialis의 경우 EMS 처리는 astaxanthin 생산량 증가 유도에 효율적이지 않은 방법으로 보고하고 있다. 본 연구에서도 EMS 처리에 의한 변이주 제조 방법이 UV 조사에 의한 제조 법보다는 효율적이지 못한 것으로 사료된다.
- 1B). 이 결과를 바탕으로 UV 조사 20 min에서 선별된 변이주를 PU20으로 명명하였다.
- 92 μg/ml)이었다. 이는 PUE 변이주에서의 astaxanthin의 생산량이 wild type과 비교하여 1.5배 정도 증가한 결과이며, 그 생산 시간은 3시간 단축시킨 효과를 얻었다.
- 05)로 유의적으로 증가한 것으로 분석되었다. 이러한 결과들을 종합하여 astaxanthin 생산 최적화된 균주로 PUE 균주를 지정하였다.
- 4B). 이러한 결과를 분석하면 PUE 변이주의 astaxanthin 생산량 증대에 관여하는 조건은 탄소원의 경우 1% raffinose, 질소원은 3% potassium nitrate를 첨가 시 가장 효과적인 생산량 증대를 이끌 수 있다고 분석된다.
- 질소원은 ammonium sulfate, ammonium chloride, sodium nitrate, potassium nitrate를 사용하였으며, 가장 효과적인 질소원으로 potassium nitrate로 3% 첨가 시 약 59.7±1.5 μg/ml의 astaxanthin 함량을 보였다(p<0.05).
- 최대 생산량을 보이는 변이주는 UV 조사 20 min구간에서 선별된 변이주로 64.2±1.3 μg/ml으로 wild type 생산량 대비 약 1.45배(p<0.05)로 유의적으로 증가한 것으로 분석되었다 (Fig. 1B).
후속연구
- PUE 균주의 경우 astaxanthin 생산량과 시간을 단축하는 결과를 도출하였지만, 앞서 설명한 관련 유전자 또는 효소의 활성에 의한 생산량 증대를 이룬 결과는 분석하지 못하였다. 향후 계속되는 연구에서 카로티노이드 생합성 경로에 관여하는 유전자 및 효소의 작용에 대해 분석할 것이다.
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