실란 기능화 양친성 고분자 전구체를 이용한 소수성 항균물질 담지 나노 입자 제조 및 항균 특성 Preparation of Hydrophobic Antimicrobal Compounds Encapsulated Nanoparticles Using Alkoxysilane-functionalized Amphiphilic Polymer Precursor and Their Antimicrobial Properties원문보기
본 연구에서는 50 wt%의 매우 높은 담지량과 70%의 높은 고형분을 가지면서도 물속이나 다양한 제품에 나노 입자 형태로 분산이 가능한 새로운 형태의 소수성항균 물질 담지 나노 입자를 제조하였다. 실란 기능화 양친성 고분자 전구체(Alkoxysilane-functionalized Amphiphilic Polymer Precursor; 이하 AAPP)와 다양한 실란 화합물을 이용하여 전형적인 Hydrolytic Sol-Gel 공정으로 제조된 수분산 유-무기 하이브리드 나노 입자들을 제조하고, 이를 이용하여서 나노 침전법을 사용하여서 소수성 항균물질을 고함량으로 담지할 수 있는 새로운 공정으로 소수성 항균물질인 Eugenol이 담지된 유-무기 하이브리드 형태의 나노입자 제조하였다. 나노 입자 제조시 제조 조건의 변화에 따른 나노 입자들의 크기, 담지량, 항균 활성 및 방출거동 등에 영향을 미치는 인자들을 조사하였다. 나노 입자의 종류에 관계없이 Minimal Inhibitory Concentration (MIC)는 50 mg/ml로 동일하였고, 모든 균주에서 99 %에 해당하는 우수한 항균력과 Pseudomonas aeruginosa (PSE)를 제외하고는 2주 이상의 항균 지속력을 나타내었다. 특히, Tetraethoxysilane (TEOS)를 첨가한 경우에는 견고한 무기물 도메인으로 인해 가장 높은 담지량 (50 wt.%)과 서방출 (Sustained release)을 나타내었고, Hexanediol (HD)을 첨가한 경우에는 HD 자체의 항균력과 용매로서의 역할도 하였기 때문에 가장 높은 항균력과 70%의 고형분을 나타내었다.
본 연구에서는 50 wt%의 매우 높은 담지량과 70%의 높은 고형분을 가지면서도 물속이나 다양한 제품에 나노 입자 형태로 분산이 가능한 새로운 형태의 소수성 항균 물질 담지 나노 입자를 제조하였다. 실란 기능화 양친성 고분자 전구체(Alkoxysilane-functionalized Amphiphilic Polymer Precursor; 이하 AAPP)와 다양한 실란 화합물을 이용하여 전형적인 Hydrolytic Sol-Gel 공정으로 제조된 수분산 유-무기 하이브리드 나노 입자들을 제조하고, 이를 이용하여서 나노 침전법을 사용하여서 소수성 항균물질을 고함량으로 담지할 수 있는 새로운 공정으로 소수성 항균물질인 Eugenol이 담지된 유-무기 하이브리드 형태의 나노입자 제조하였다. 나노 입자 제조시 제조 조건의 변화에 따른 나노 입자들의 크기, 담지량, 항균 활성 및 방출거동 등에 영향을 미치는 인자들을 조사하였다. 나노 입자의 종류에 관계없이 Minimal Inhibitory Concentration (MIC)는 50 mg/ml로 동일하였고, 모든 균주에서 99 %에 해당하는 우수한 항균력과 Pseudomonas aeruginosa (PSE)를 제외하고는 2주 이상의 항균 지속력을 나타내었다. 특히, Tetraethoxysilane (TEOS)를 첨가한 경우에는 견고한 무기물 도메인으로 인해 가장 높은 담지량 (50 wt.%)과 서방출 (Sustained release)을 나타내었고, Hexanediol (HD)을 첨가한 경우에는 HD 자체의 항균력과 용매로서의 역할도 하였기 때문에 가장 높은 항균력과 70%의 고형분을 나타내었다.
In this study, nanoparticles which encapsulated hydrophobic antimicrobial compounds with 50wt% of payload and 70%of solid content were prepared. These nanoparticles could be dispersed at water as well as various medium. Water dispersible organic-inorganic (O-I) hybrid nanoparticles were first prepar...
In this study, nanoparticles which encapsulated hydrophobic antimicrobial compounds with 50wt% of payload and 70%of solid content were prepared. These nanoparticles could be dispersed at water as well as various medium. Water dispersible organic-inorganic (O-I) hybrid nanoparticles were first prepared using alkoxysilane-functionalized amphiphilic polymer precursors through a conventional sol-gel process. Hydrophobic antimicrobial compound, Eugenol encapsulated nanoparticles were prepared using these O-I hybrid nanoparticles through a new nanoprecipitation process. The effect of various preparation on the size of nanoparticles, amount of payload, antimicrobial activity, and release rate of encapsulated compounds was investigated. All eugenol-encapsulated O-I nanoparticles regardless of preparation condition showed the same minimal inhibitory concentration (MIC) (50mg/ml) and 99% of antimicrobial activity for every strain. Their antimicrobial activity could maintain longer than two weeks. Especially, eugenol-encapsulated O-I nanoparticles prepared using tetraethoxysilane (TEOS) exhibited the highest payload (50wt%) and the lowest release rate which was owing to higher inorganic content in the O-I nanoparticles. And these O-I nanoparticles dispersed in hexanediol (HD) showed the highest antimicrobial activity and solid content (70wt%) because HD acted as a solvent as well as a antimicrobial agent.
In this study, nanoparticles which encapsulated hydrophobic antimicrobial compounds with 50wt% of payload and 70%of solid content were prepared. These nanoparticles could be dispersed at water as well as various medium. Water dispersible organic-inorganic (O-I) hybrid nanoparticles were first prepared using alkoxysilane-functionalized amphiphilic polymer precursors through a conventional sol-gel process. Hydrophobic antimicrobial compound, Eugenol encapsulated nanoparticles were prepared using these O-I hybrid nanoparticles through a new nanoprecipitation process. The effect of various preparation on the size of nanoparticles, amount of payload, antimicrobial activity, and release rate of encapsulated compounds was investigated. All eugenol-encapsulated O-I nanoparticles regardless of preparation condition showed the same minimal inhibitory concentration (MIC) (50mg/ml) and 99% of antimicrobial activity for every strain. Their antimicrobial activity could maintain longer than two weeks. Especially, eugenol-encapsulated O-I nanoparticles prepared using tetraethoxysilane (TEOS) exhibited the highest payload (50wt%) and the lowest release rate which was owing to higher inorganic content in the O-I nanoparticles. And these O-I nanoparticles dispersed in hexanediol (HD) showed the highest antimicrobial activity and solid content (70wt%) because HD acted as a solvent as well as a antimicrobial agent.
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제안 방법
AAPP는 3단계 합성 공정을 통해서 제조되었으며, 기계교반기, 질소 유입구, 온도계가 장착된 3구 유리반응기내에서 진행하였다. 질소 분위기 하에 GP와 IPDI를 반응 몰비 1:3으로 70∼80℃에서 4 시간 동안 교반 반응시켜 우레탄 결합을 형성시킨다.
AAPP를 이용한 유-무기 하이브리드 형태의 나노입자 용액 제조에는 전형적인 Sol-Gel 공정이 사용되었으며, 제조되는 유-무기 하이브리드 나노입자의 크기는 분자설계에 따라서 다양하게 조절이 가능하다. AARP를 사용하여서 유용성 천연유래 항균 물질이 담지된 유-무기 하이브리드 나노입자 용액을 제조하는 공정은 AAPP를 Ethanol에 1:4의 무게비율로 상온에서 혼합한후 항균 물질인 Eugenol을 AARP와 1:1, 1:2, 1:3, 1:4의 무게비로 첨가하여 용해시켜서 균일한 용액을 제조하고, 제조된 용액에 AARP와 1:1의 무게비율을 갖는 촉매를 함유한 수용액에 천천히 적하시킨 후 (0.1M의 염산 수용액을 서서히 적하시켜) 60℃에서 48 시간 동안 반응시켜 Eugenol이 담지된 유/무기 하이브리드 형태의 용액을 제조하였고, 자세한 조성은 Table 1에 나타내었다. 즉 AARP와 Eugenol의 혼합물을 물속에 적하하면 소수성 항균 물질과 AARP의 소수성 세그먼트인 Polypropylene oxide 세그먼트는 회합하여서 입자 내부(Core)를 형성하게 되고, 친수성 세그먼트인 Polyethylene oxide 세그먼트는 입자 외부로 배향하면서 미셀(Micelle)과 같은 나노입자를 형성하게 된다.
이는 Sol-Gel 반응이 진행됨에 따라 견고한 실리카(SiO2) 층을 형성하기 때문에 소수성도메인과 무기 실록산 층이 친수성도메인보다 커지므로 물에 분산되지 못하고 석출된 것으로 생각된다. TEOS를 첨가하여 제조된 용액의 경우에는 물에는 분산되지 않기 때문에 최소저해농도(MIC) 및 항균력을 확인하기 위하여 필름 형태로 제조하였다. 제조된 필름은 Figure 4에 나타낸 것처럼 투명하였다.
WD-SPH 나노입자 내 항균제의 담지량(payload)를 향상시키기 위하여 WD-SPH 나노입자 제조시 실란화합물(APTES 및 TEOS)을 첨가하였다. 먼저 10 g의 AARP를 40 g의 에탄올에 상온에서 혼합한 후 혼합 용액에 실란화합물(APTES 및 TEOS)을 다양한 조성비로 첨가하고 0.
WD-SPH, WD-SPH-X 나노입자들을 각 농도 별로 첨가한 액체 배지에 2 x 105 CFU/ml의 균수의 현탁액을 접종하고 37℃에서 24∼48 시간 동안 배양하였다.
먼저, 분자설계에 따른 WD-SPH-X 나노입자에 대한 항균력을 확인하기 위하여 KS J 4206 규격에 준하여 항균 시험(Antimicrobial test)을 진행하였다. 각 균주는100 mL의 액체배지에 접종하고 37℃에서 24 시간씩 3회 계대 배양하여 항균활성 시험균주로 사용하였으며, 항균성은 각각의 시험균 농도를 2 x 105 CFU/ml가 되게 한 후, 각각의 나노캡슐화 항균소재를 첨가하여 37℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 배양 후 배양액을10-1∼10-4으로 희석하여 생존 균수를 측정하였고, 이생존 균수를 대조군의 생존 균수와 비교하여 항균력을 분석하였다.
본연구를 수행하기에 앞서 본 연구에서 사용할 유용성천연유래 항균 물질을 선택하기 위하여, 천연 항균소재 추출, 분석 및 응용분야 조사(국내/외 논문) 및 천연항균소재 추출물 실험방법 조사를 진행하였으며, 천연항균 물질(IPC: A01N, A23L, A61K) 관련 최근 5년간 한국, 미국, 유럽 및 일본에서의 출원 동향을 분석하였다[35]. 그 결과, 메밀, 정향, 백자인, 강황(심황, 울금)등을 포함하여 약 20여 가지의 천연유래 항균 물질들을 확보하였고, 이들 중 항균 활성이 우수한 백자인 추출물(Carvacrol), 정향 추출물(Eugenol), 강황추출물(Curcumin)을 선택하여 실험을 진행하였으며[35], 실험결과를 바탕으로 가장 우수한 항균력을 나타낸 정향추출물인 Eugenol을 천연유래 항균 물질로 선택하였다.
분자설계에 따른 Eugenol의 담지량과 방출거동에 미치는 영향을 관찰하기 위하여, Mw 3,500 membrane 안에 2 ml의 샘플을 넣고 밀봉한 뒤 100 ml의 PBS에 넣어 일정 시간에 따라 방출 용액을 취하여 고성능 액체크로마토그래피(High Performance Lipid Chromatography ; HPLC, 254 nm)로 분석하였다. 농도(%)의 경우WD-SPH-X 나노입자 안에 담지 되어있는 Eugenol 양만을 이용하여 수치화 하였다.
따라서 본 연구에서는 유용성 천연유래 항균 물질들을 담지 할 수 있는 기능을 가지면서도 수용액에서 매우 안정적인 나노입자를 형성할 수 있는 물질로서, 친수성 세그먼트와 소수성 세그먼트가 화학적으로 결합된 물질이면서 소수성 세그먼트의 Hydrolysis Polycondensation 반응을 통해서 Si-O 결합을 생성시킬 수 있는 알콕시실란기가 존재하는 형태를 가지는 실란기능화 양친성 고분자 전구체를 합성하고 이를 이용하여서 One-shot공정으로 Eugenol이 담지된 유-무기 하이브리드 형태의 나노입자 제조를 제안하였다. 또한 고함량의 Eugenol이 담지된 나노입자를 제조하기 위하여 4관능성 실란화합물인 TEOS(Tetraethyl orthosilicate)와 3관능성 실란화합물인 APTES(3-Aminopropyltriethoxysilane)를 다양한 혼합비로 혼합하여 유-무기 하이브리드 형태의 나노입자 용액을 제조하였고, 유용 성분 100%로 제조하기 위하여 자체 항균특성을 가지고 있는 헥산디올(Hexanediol; HD)을 첨가하였다.
5 층을 형성하기 때문에 견고한 무기 실록산 층이 형성되지 못하여 Eugenol이 휘발되어 냄새가 잔존하는 것으로 생각된다. 따라서 전술한 문제점들을 해결하기 위해서 방부효과를 가지고 있어서 현재 화장품 방부용 첨가제 및 용제로 사용되고 있는 Hexanediol(HD)을 반응 용매로 사용하여서 무용매(solvent-free)공정으로 Eugenol이 담지된 WD-SPH-HD 나노입자를 제조하였다. 제조된WD-SPH-HD 나노입자의 경우, 약 80-150 nm 정도의 크기를 나타내었고 다른 나노입자들보다 Eugenol의 냄새가 많이 감소하였는데, 이는 용매로 사용된 HD 고유의 냄새가 Eugenol의 냄새를 약하게 만든 것으로 생각된다.
따라서 본 연구에서는 유용성 천연유래 항균 물질들을 담지 할 수 있는 기능을 가지면서도 수용액에서 매우 안정적인 나노입자를 형성할 수 있는 물질로서, 친수성 세그먼트와 소수성 세그먼트가 화학적으로 결합된 물질이면서 소수성 세그먼트의 Hydrolysis Polycondensation 반응을 통해서 Si-O 결합을 생성시킬 수 있는 알콕시실란기가 존재하는 형태를 가지는 실란기능화 양친성 고분자 전구체를 합성하고 이를 이용하여서 One-shot공정으로 Eugenol이 담지된 유-무기 하이브리드 형태의 나노입자 제조를 제안하였다. 또한 고함량의 Eugenol이 담지된 나노입자를 제조하기 위하여 4관능성 실란화합물인 TEOS(Tetraethyl orthosilicate)와 3관능성 실란화합물인 APTES(3-Aminopropyltriethoxysilane)를 다양한 혼합비로 혼합하여 유-무기 하이브리드 형태의 나노입자 용액을 제조하였고, 유용 성분 100%로 제조하기 위하여 자체 항균특성을 가지고 있는 헥산디올(Hexanediol; HD)을 첨가하였다. 이를 위해서 폴리에틸렌 옥사이드(Polyethylene oxide)(PEO) 기반 친수성 세그먼트와 폴리프로필렌 옥사이드(Polypropylene oxide)(PPO) 기반 소수성 세그먼트를 가지고 있으면서 반응성 알콕시 실란을 가지고 있는 실란 기능화 양친성 고분자 전구체(Alkoxysilane-functionalized Amphiphilic Polymer Precursor; 이하 AAPP)를 합성하고, 이를 전형적인 Hydrolytic Sol-Gel 공정을 통하여 수분산이 가능하면서 고함량의 Eugenol의 담지가 가능한 유-무기 하이브리드 형태의 나노입자 제조하는 공정을 제안하였으며, Eugenol의 담지효율 및 분자 설계(나노입자 제조시 제조 조건의 변화)에 따른 나노입자들의 크기, 담지량, 항균 활성 및 방출거동 등에 영향을 미치는 인자들을 조사하였다.
배양 후 배양액을10-1∼10-4으로 희석하여 생존 균수를 측정하였고, 이생존 균수를 대조군의 생존 균수와 비교하여 항균력을 분석하였다.
본 연구에서는 알콕시실란기가 존재하는 형태를 가지는 실란 기능화 양친성 고분자 전구체(AAPP)를 이용하여서 분자설계에 따른 유용성 천연유래 항균 물질인 Eugenol의 담지량, 항균력, 항균지속력 및 방출거동을 관찰하였다. AAPP와 실란 화합물을 사용하여서 One-shot 공정으로 소수성 항균물질인 70%의 높은 고형분을 가지면서도 Eugenol이 고농도 (50 wt%)로 담지된 수분산 유-무기 하이브리드 나노 입자들을 제조 할 수 있었다.
이전 연구에서 반응성 양친성 고분자 전구체(RAPP)를 합성하고 이를 이용하여서 코아 가교 양친성 고분자 나노입자(CCAP)를 제조한 후, 나노 침전법 공정을 사용하여 항암제 및 유용 약물을 담지하였다[34]. 본연구를 수행하기에 앞서 본 연구에서 사용할 유용성천연유래 항균 물질을 선택하기 위하여, 천연 항균소재 추출, 분석 및 응용분야 조사(국내/외 논문) 및 천연항균소재 추출물 실험방법 조사를 진행하였으며, 천연항균 물질(IPC: A01N, A23L, A61K) 관련 최근 5년간 한국, 미국, 유럽 및 일본에서의 출원 동향을 분석하였다[35]. 그 결과, 메밀, 정향, 백자인, 강황(심황, 울금)등을 포함하여 약 20여 가지의 천연유래 항균 물질들을 확보하였고, 이들 중 항균 활성이 우수한 백자인 추출물(Carvacrol), 정향 추출물(Eugenol), 강황추출물(Curcumin)을 선택하여 실험을 진행하였으며[35], 실험결과를 바탕으로 가장 우수한 항균력을 나타낸 정향추출물인 Eugenol을 천연유래 항균 물질로 선택하였다.
항균 지속력 또한 항균력 시험과 마찬가지로 각 균주를 100 mL의 액체배지에 접종하고 37℃에서 24 시간씩 3회 계대 배양하여 항균활성 시험균주로 사용하였다. 분자 설계에 따른 항균 지속력을 확인하기 위하여 제조된 WD-SPH-X 나노입자들을 각각 액체배지에 희석하여 농도를 맞춘 후 멸균한 용기에 담고 여기에 2 x 105 CFU/ml의 균수의 현탁액을 접종하여 37℃에서 14 일 동안 배양하였다. 시간이 경과함에 따라 육안으로 변화를 관찰하고 분광 광도계를 이용하여 항균지속력을 측정하였다.
분자설계에 따른 Eugenol의 담지량과 방출거동에 미치는 영향을 관찰하기 위하여, Mw 3,500 membrane 안에 2 ml의 샘플을 넣고 밀봉한 뒤 100 ml의 PBS에 넣어 일정 시간에 따라 방출 용액을 취하여 고성능 액체크로마토그래피(High Performance Lipid Chromatography ; HPLC, 254 nm)로 분석하였다. 농도(%)의 경우WD-SPH-X 나노입자 안에 담지 되어있는 Eugenol 양만을 이용하여 수치화 하였다.
앞서 합성된 프리폴리머 (Prepolymer)에 아민기를 갖는 APTES를 반응 몰비 1:2로 첨가하여 50℃에서 다시 4 시간 교반 반응시킨다. 상기 과정으로 얻어진 합성물에 분자량이 1500 g/mol인 PEG를 1:1의 반응 몰비로 첨가 후 12 시간 동안 반응시켜 최종적으로 양친성 고분자 사슬을 가지는 실란 기능화 양친성 고분자 전구체를 합성하였다. 합성된 반응성 전구체인 AAPP의 자세한 분석 및 분자량 측정은 이전의 논문에서 자세하게 기술하였고[36], 모식도를 Figure 1에 나타내었다.
분자 설계에 따른 항균 지속력을 확인하기 위하여 제조된 WD-SPH-X 나노입자들을 각각 액체배지에 희석하여 농도를 맞춘 후 멸균한 용기에 담고 여기에 2 x 105 CFU/ml의 균수의 현탁액을 접종하여 37℃에서 14 일 동안 배양하였다. 시간이 경과함에 따라 육안으로 변화를 관찰하고 분광 광도계를 이용하여 항균지속력을 측정하였다.
또한 고함량의 Eugenol이 담지된 나노입자를 제조하기 위하여 4관능성 실란화합물인 TEOS(Tetraethyl orthosilicate)와 3관능성 실란화합물인 APTES(3-Aminopropyltriethoxysilane)를 다양한 혼합비로 혼합하여 유-무기 하이브리드 형태의 나노입자 용액을 제조하였고, 유용 성분 100%로 제조하기 위하여 자체 항균특성을 가지고 있는 헥산디올(Hexanediol; HD)을 첨가하였다. 이를 위해서 폴리에틸렌 옥사이드(Polyethylene oxide)(PEO) 기반 친수성 세그먼트와 폴리프로필렌 옥사이드(Polypropylene oxide)(PPO) 기반 소수성 세그먼트를 가지고 있으면서 반응성 알콕시 실란을 가지고 있는 실란 기능화 양친성 고분자 전구체(Alkoxysilane-functionalized Amphiphilic Polymer Precursor; 이하 AAPP)를 합성하고, 이를 전형적인 Hydrolytic Sol-Gel 공정을 통하여 수분산이 가능하면서 고함량의 Eugenol의 담지가 가능한 유-무기 하이브리드 형태의 나노입자 제조하는 공정을 제안하였으며, Eugenol의 담지효율 및 분자 설계(나노입자 제조시 제조 조건의 변화)에 따른 나노입자들의 크기, 담지량, 항균 활성 및 방출거동 등에 영향을 미치는 인자들을 조사하였다.
% 이상의 Eugenol을 담지하지 못하고 불안정해져서 입자가 파괴되는 것으로 생각된다. 이를 해결하기 위하여 (담지량(payload)을 향상시키기 위하여) TEOS와 APTES를 각각 첨가하여서 무기 실록산 층이 강화된 Eugenol이 담지된 WD-SPH-T와 WD-SPH-A 나노입자를 제조하였고, 모식도를 Figure 3에 나타내었다.
WD-SPH, WD-SPH-X 나노입자들을 각 농도 별로 첨가한 액체 배지에 2 x 105 CFU/ml의 균수의 현탁액을 접종하고 37℃에서 24∼48 시간 동안 배양하였다. 이후 배양액을 취하여 분광 광도계(Spectrophotometer)로 620 nm에서의 흡광도를 측정하여 각 균주의 증식 여부를 검증함으로써 최소저해농도(MIC)를 확인하였다.
HD 자체도 약간의 항균성을 가지고 있기 때문에 실제로 화장품 제조시 방부 첨가제, 용제의 목적으로 사용되고 있다. 제조방법은 전술한 것처럼, 10 g의 AARP를 40 g의 HD에 상온에서 혼합한 후 혼합 0.1M의 염산 수용액을 서서히 적하시켜 60℃에서 48시간 동안 반응시켰으며, 자세한 조성은 Table 1에 나타내었다. 제조된 WD-SPH-HD 나노입자의 유용성분은 100 %이다.
항균 지속력 또한 항균력 시험과 마찬가지로 각 균주를 100 mL의 액체배지에 접종하고 37℃에서 24 시간씩 3회 계대 배양하여 항균활성 시험균주로 사용하였다. 분자 설계에 따른 항균 지속력을 확인하기 위하여 제조된 WD-SPH-X 나노입자들을 각각 액체배지에 희석하여 농도를 맞춘 후 멸균한 용기에 담고 여기에 2 x 105 CFU/ml의 균수의 현탁액을 접종하여 37℃에서 14 일 동안 배양하였다.
대상 데이터
AAPP 물질의 합성에는 (본 연구에서는) Glycerol Propoxylate(GP, Mw = 1000 g/moL, Sigma Aldrich Co.,Ltd, USA), Isophorone Diisocyanate(IPDI, Sigma Aldrich Co., Ltd, USA), 3-Aminopropyltriethoxysilane(APTES, Sigma Aldrich Co., Ltd, USA), Polyethylene Glycol(PEG, Mw = 1500 g/moL), 용매는 아세톤(Acetone, Sigma Aldrich Co., Ltd, USA)이 사용되었으며, Sol-Gel반응에 함께 사용한 알콕시실란은 Tetraethoxysilane(TEOS), APTES, Hexanediol(HA, Sigma Aldrich Co., Ltd, USA)가 사용되었고 유용성 천연유래 항균 물질로는 백자인 추출물(Carvacrol)과 정향 추출물(Eugenol), 강황추출물(Curcumin) 중에서 가장 우수한 항균력을 나타내었던[35] 정향 추출물인 Eugenol을 Sigma Aldrich Co., Ltd, USA에서 구입해서 대표적으로 사용하였다. GP와 PEG는 합성 24시간 전 80℃에서 감압 하에 건조 후 사용하였고, 그 외의 시약은 별도의 정제과정을 거치지 않고 사용하였다.
고형분 및 유용성분을 향사시키기 위하여 Hexanediol(HD)을 용매로 사용하여 WD-SPH-HD 나노입자 용액을 제조하였다. HD 자체도 약간의 항균성을 가지고 있기 때문에 실제로 화장품 제조시 방부 첨가제, 용제의 목적으로 사용되고 있다.
분자설계에 따른 WD-SPH-X 나노입자의 최소저해농도(Minimal Inhibitory Concentration; MIC)를 확인하기 위하여 한국미생물센터에서 균주 6종을 분양받아Mueller Hinton Agar (MHA) 배지를 이용하여서 균주를 각각 100 mL의 액체배지에 접종하고 37℃에서 24 시간씩 3 회 계대 배양하여서 시험균주로 사용하였다[37]. 시험균주 및 배양조건은 Table 2에 자세히 나타내었다.
유-무기 하이브리드 형태의 양친성 반응성 전구체인 AARP의 실란기간의 Sol-Gel 반응을 이용하여서 유용성 천연유래 항균 물질 담지를 시도한 것은 휘발성이 높은 천연 항균 물질의 휘발성과 독성을 크게 감소시키기 위해서이다. 전술한 것처럼, Eugenol을 선택하여 실험을 진행한 것은 20여 가지 천연 유래 항균물질 들 중 캡슐화가 가능하였던 백자인 추출물(Carvacrol)과 정향 추출물(Eugenol), 강황추출물(Curcumin)을 선정하여 실험을 진행한 결과, 3가지 항균 물질 중에서 가장우수한 항균력을 나타내었던[35] 정향 추출물인 Eugenol을 Sigma Aldrich Co., Ltd, USA에서 구입해서대표적으로 사용하였다. AAPP만을 사용하여 제조된 WD-SPH 나노입자는 전술한 것처럼, Sol-Gel 반응 동안 회합반응에 의하여 내부 소수성도메인을 갖고 외부에 친수성도메인이 위치하며 두 도메인 사이에 무기 실록산층이 존재하는 형태로, 물에 적하하면 물과 혼화가 가능한 PEG가 수상으로 확산 이동함에 따라서 AARP의 소수성 세그먼트들은 “Hydrophobic interaction”으로 인해서 서로 회합하게 되고 친수성 세그먼트들은 소수성 세그먼트들과 미세상분리(Microphase-separation)되어서 수상으로 이동하게 된다.
이론/모형
먼저, 분자설계에 따른 WD-SPH-X 나노입자에 대한 항균력을 확인하기 위하여 KS J 4206 규격에 준하여 항균 시험(Antimicrobial test)을 진행하였다. 각 균주는100 mL의 액체배지에 접종하고 37℃에서 24 시간씩 3회 계대 배양하여 항균활성 시험균주로 사용하였으며, 항균성은 각각의 시험균 농도를 2 x 105 CFU/ml가 되게 한 후, 각각의 나노캡슐화 항균소재를 첨가하여 37℃에서 24 시간 동안 배양하였다.
성능/효과
본 연구에서는 알콕시실란기가 존재하는 형태를 가지는 실란 기능화 양친성 고분자 전구체(AAPP)를 이용하여서 분자설계에 따른 유용성 천연유래 항균 물질인 Eugenol의 담지량, 항균력, 항균지속력 및 방출거동을 관찰하였다. AAPP와 실란 화합물을 사용하여서 One-shot 공정으로 소수성 항균물질인 70%의 높은 고형분을 가지면서도 Eugenol이 고농도 (50 wt%)로 담지된 수분산 유-무기 하이브리드 나노 입자들을 제조 할 수 있었다. 기존의 연구와 비교하여 상대적으로 높은 담지율과 고형분을 나타내는 것은 항균 물질 담지에 사용된 유-무기 하이브리드 나노입자들이 화학적으로 매우 견고한 구조를 가지고 있기 때문인 것으로 생각된다.
제조된WD-SPH-HD 나노입자의 경우, 약 80-150 nm 정도의 크기를 나타내었고 다른 나노입자들보다 Eugenol의 냄새가 많이 감소하였는데, 이는 용매로 사용된 HD 고유의 냄새가 Eugenol의 냄새를 약하게 만든 것으로 생각된다. HD를 첨가함으로써 잔존 용매제거 문제를 해결할 수 있었고, 동시에 고함량의 유효 성분(Eugenol+HD)을 담지 할 수 있었다.
분자설계에 따른 WD-SPH-X 나노입자(농도 1 %)에서 각 균주에 대한 항균 지속력 결과를 Figure 7에 나타내었다. 가장 우수한 항균 지속력을 나타내는 나노입자는 MIC 및 항균력 시험 결과와 일치하는 결과로, HD를 첨가하여 제조된 WD-SPH-HD 나노입자(E)였으며 모든 균주에서 2주 이상의 항균 지속력을 나타냄을 확인할 수 있었다. WD-SPH-HD 나노입자를 제외한 나머지 나노입자들의 경우에는 PSE를 제외한 나머지 균주에서 2 주 이상의 항균 지속력을 나타내었다.
마지막으로 HD를 첨가하여 WD-SPH-HD 나노입자(E)의 경우에는 다른 나노입자들 보다 낮은 10 mg/ml의 MIC를 나타내었고, PSE 균주를 제외하면 5 mg/ml의 MIC를 나타내었다. 결과적으로 분자설계의 종류에 관계없이 50 mg/ml의 MIC를 확인하였으며, 항균제를 사용하고 있는 산업에서 통상적으로 사용되는 농도인 0.5 - 2 %를 만족하는 것을 확인할 수 있었다.
특히, TEOS를 첨가한 경우에는 견고한 무기물도메인으로 인해 가장 높은 담지량과 서방출(Sustained release)을 나타내었고, HD를 첨가한 경우에는 HD 자체의 항균력과 용매로서의 역할도 하였기 때문에 가장 높은 항균력과 고형분을 나타냄을 확인할 수 있었다. 본 연구를 통하여 유/무기 하이브리형 양친성 반응성 전구체를 이용한 WD-SPH-X 나노입자를 제조함에 있어 분자설계가 중요하며, Eugenol의 담지량, 항균력, 항균지속력 및 방출 거동이 가장 우수한 조건은 자체 항균력을 가지는 HD을 첨가하여 제조된 용액임을 확인할 수 있었다.
Eugenol의 표준검량곡선을 작성하기 위해 Eugenol의 최대 흡광도를 측정한 결과 254 nm에서 관찰되었으며, 일정시간 마다 시료를 채취하여서, 측정한 용액의 흡광도를 근거로 측정한 방출된 Eugenol의 농도는 Figure 8과 같이 누적 방출 경향을 나타내었다. 분자설계에 따른 Eugenol 담지량은 무기실록산 층이 가장 조밀하게 형성된 TEOS를 첨가하여 제조된 경우에서 가장 높은 담지량을 나타내었다. HD을 첨가하여 제조된 WD-SPH-HD 나노입자(E)의 경우에는 AARP만 이용하여 제조된 WD-SPH 나노입자(B)와 마찬가지로 가장 낮은 담지량을 나타내었는데, 이는 유효 성분은 높지만 무기 실록산 층이 얇고 견고하지 못하기 때문에 코아 안에 Eugenol이 가장 적게 담지된 것으로 생각된다.
분자설계에 따른 항균 시험 결과를 Table 4에 나타내었다. 분자설계에 따른 항균력은 MIC(1 mg/ml)와 마찬가지로 다양한 농도(0.5 - 20 %)에서 99 %에 해당하는 우수한 항균력을 나타냄을 확인할 수 있었다. Table4에 나타낸 것처럼, 가장 우수한 항균력을 나타내는 입자는 예상한 했던바와 같이 HD를 용매로 사용하여서 제조된 WD-SPH-HD(E) 나노입자였다.
기존의 연구와 비교하여 상대적으로 높은 담지율과 고형분을 나타내는 것은 항균 물질 담지에 사용된 유-무기 하이브리드 나노입자들이 화학적으로 매우 견고한 구조를 가지고 있기 때문인 것으로 생각된다. 분자설계의 종류에 관계없이 MIC는 50 mg/ml임을 확인 할 수 있었고, 99 %에 해당하는 우수한 항균력과 PSE를 제외하고는 2주 이상의 항균 지속력을 나타내었다. 특히, TEOS를 첨가한 경우에는 견고한 무기물도메인으로 인해 가장 높은 담지량과 서방출(Sustained release)을 나타내었고, HD를 첨가한 경우에는 HD 자체의 항균력과 용매로서의 역할도 하였기 때문에 가장 높은 항균력과 고형분을 나타냄을 확인할 수 있었다.
분자설계의 종류에 관계없이 MIC는 50 mg/ml임을 확인 할 수 있었고, 99 %에 해당하는 우수한 항균력과 PSE를 제외하고는 2주 이상의 항균 지속력을 나타내었다. 특히, TEOS를 첨가한 경우에는 견고한 무기물도메인으로 인해 가장 높은 담지량과 서방출(Sustained release)을 나타내었고, HD를 첨가한 경우에는 HD 자체의 항균력과 용매로서의 역할도 하였기 때문에 가장 높은 항균력과 고형분을 나타냄을 확인할 수 있었다. 본 연구를 통하여 유/무기 하이브리형 양친성 반응성 전구체를 이용한 WD-SPH-X 나노입자를 제조함에 있어 분자설계가 중요하며, Eugenol의 담지량, 항균력, 항균지속력 및 방출 거동이 가장 우수한 조건은 자체 항균력을 가지는 HD을 첨가하여 제조된 용액임을 확인할 수 있었다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
실생활에서 유해 세균 제거를 위해 무엇을 사용하는가?
현재, 실생활에서 유해 세균의 제거를 위해 화학 항균제 및 천연 항균제 등 여러 종류의 항균제가 사용되고 있다. 항균 물질들은 액상이나 고분자 물질에 첨가된 혼합형이었기 때문에 사용 중 항균활성이 급격히 저하되어 지속성의 문제 및 섭취나 흡입 시 구토나 복통, 토혈, 피부알레르기 반응 등 많은 부작용이 발생하고 있다[1-5].
항균 물질의 부작용은 무엇인가?
현재, 실생활에서 유해 세균의 제거를 위해 화학 항균제 및 천연 항균제 등 여러 종류의 항균제가 사용되고 있다. 항균 물질들은 액상이나 고분자 물질에 첨가된 혼합형이었기 때문에 사용 중 항균활성이 급격히 저하되어 지속성의 문제 및 섭취나 흡입 시 구토나 복통, 토혈, 피부알레르기 반응 등 많은 부작용이 발생하고 있다[1-5]. 이에 따라 응용하기가 쉽고 사용에 편리하면서 항균 활성이 뛰어난 항균 물질의 개발이 요구되고 있는 실정이다.
인체에 해가 없으며, 제품의 안정성과 경제성이 우수한 천연 성분을 이용한 항균 및 방부제의 개발이 활발하게 이루어지게 된 이유는 무엇인가?
이에 따라 응용하기가 쉽고 사용에 편리하면서 항균 활성이 뛰어난 항균 물질의 개발이 요구되고 있는 실정이다. 미용과 화장품 산업에서 미생물의 오염을 방지하기 위해 사용되고 있는 파라벤(Paraben)류, 페녹시에탄올(Phenoxyethanol) 등과 같은 화학약품 방부제들은 독성 성분들을 띄고 있어 피부에부작용을 일으킬 뿐만 아니라 미생물들의 내성을 일으켜 많이 문제가 되고 있으며[1,5], 식품 산업에서 미생물에 의한 변패를 억제하기 위해 사용되는 데하이드로아세트산(Dehydroacetic Acid), 소르빈산(Sorbic Acid), 벤조산(Benzoic Acid), p-히드록시벤조산에스테르(p-OxbenzoicAcid Ester) 등과 같은 보존료들은 그 안전성에 대해 우려를 갖고 있어 근래에는 건강에 대한 요구가 증가함에 따라 점차 사용량을 제한하는 추세이다[1, 4-5]. 이러한 문제점들로 인하여 인체에 해가 없으며, 제품의 안정성과 경제성이 우수한 천연 성분을 이용한 항균 및 방부제의 개발 등이 활발하게 이루어지고 있으며, 향신료 및 어류 등의 식품류, 천연식물의 정유(Essential Oil), 한약재 등으로부터 많은 천연 항균성물질이 보고되고 있다.
참고문헌 (37)
J. Weiss, S. Gaysinsky, M. Davidson, and J. McClements, Global Issues in Food Science and Technology 24, 425 (2009).
Lee DS, Innovations in Food Packaging, 65, 108 (2005).
P. Appendini and J. H. Hotchkiss, Innovative Food Science Emerging Technol. 3, 113 (2002).
(Environmental Toxicology and Pharmacology 32 (2011) 63) Chemical composition and antimicrobial activity of the essential oil of Rosemary / Jianga Y, Wu N, Fu YJ, Wang W, Luo M, Zhao CJ, Zu YJ, Liu XL., Environ Toxicol Pharmacol 32, 63 (2011).
Bell LN, "Stability testing of nutraceuticals and functional foods, In: Handbook of nutraceuticls and functional foods", Wildman REC, 501, CRC Press, New York, (2001).
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