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문제 정의
- 병어를 대상으로 질병 검사를 실시한 결과, 기생충, 세균 및 바이러스는 검출되지 않았으나 팽창된 위에서 진균이 분리되었다. 본 연구에서는 해수 사육 무지개송어에 발생되어진 위팽창증후군을 보고하고자 하며, 또한 분리된 진균을 이용한 감염 실험을 통하여 질병과의 연관성을 조사한 결과를 보고하고자 한다.
제안 방법
- 2013년 경상북도에 위치한 양식장에서 사육 중인 담수 무지개송어(체중 300~400 g) 2만미를 지하수가 들어 있는 수조(제주도에 위치한 양식장 수조)에 수용한 후 해수의 유입을 점차적으로 늘리는 방법으로(염분의 농도: 1일에 약 1‰씩 상승시킴) 해수 순치를 실시하였다.
- PCR 반응은 30 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 9.0), 1.5 mM MgCl2, 250 μM의 각 dNTP, 1 U Taq DNA polymerase가 포함되어 있는 혼합물(PCR premix, Bioneer, Korea)에 20 pmol의 각 primer와 추출된 DNA 1 μL를 첨가하여 실시하였다.
- 반응조건은 95℃에서 5분간 pre-denature시킨 후, 95℃에서 1분간 denature, 55℃에서 1분간 annealing, 72℃에서 1분간 extension 반응을 30 cycles을 진행시키고, 72℃에서 5분간 post-extension 하였다. PCR 증폭 산물은 1.5% agarose gel을 이용하여 확인하였고, gel purification kit (Bioneer, Korea)를 이용하여 정제 후 ABI PRISM dye terminator sequencing chemistry (Applied Biosystems, USA)를 사용하여 염기서열을 분석하였다. 분석된 염기서열은 national center for biotechnology information (NCBI) GenBank의 blast 분석을 실시하여 기존에 보고된 진균종과 비교하였다.
- SDA 배지에 자란 진균을 동정하기 위해 형태학적 및 생화학적 특성을 분석하였고, internal transcribed spacer (ITS)-5.8SrDNA-ITS 부위의 염기서열을 분석하였다. 진균의 형태는 광학현미경을 사용하여 관찰하였고, API 20C AUX kit (BioMérieux, France)를 사용하여 상법에 따라 동화시험 (assimilation test)을 실시하였다.
- 가 위팽창증후군과 관련성이 있는지를 조사하기 위해, 해수(염분 농도 25‰와 30~32‰)로 사육 중인 무지개송어에 Candida sp.를 경구로 2일 간격으로 사료와 함께 42일 이상 투여한 후 위팽창 유무를 관찰하였다. 25‰의 염분 농도에서는 실험구에서만 1마리가 폐사되었다(data not shown).
- 무지개송어의 팽창된 위로부터 분리한 진균을 SDA 배지에 3~7일간 배양한 후, 경구 투여 방법으로 감염 실험을 2회 실시하였다. 실험 1에서는 무지개송어(체중 925~1,750 g, 체장 41~49 cm)를 수온 12.
- 또한 위 내용물을 penicillin과 streptomycin이 첨가된 sabouraud dextrose agar (SDA, Difco, USA) 위에 100 μL씩 도말한 후 15℃에서 7일간 배양하여 진균을 분리하였다. 세균검사는 간, 비장 및 신장 조직을 무균적으로 채취하여 brain heart infusion agar (BHIA, Difco, USA)에 도말한 후, 15℃에서 7일간 배양하여 세균을 분리하였다. 바이러스 검사는 신장과 비장 조직을 Hanks’ balanced salt solution (HBSS; Gibco, USA)으로 1 : 9 (0.
- 실험 1에서는 무지개송어(체중 925~1,750 g, 체장 41~49 cm)를 수온 12.5~14℃, 염분 농도 25‰로 유지된 36톤 수조 2개에 각각 23마리씩 수용한 후, 1개의 수조에는 진균을 흡착시킨 사료 500 g (진균수: 107~3×107 colony forming unit (CFU)/g)을 2일 간격으로 무지개송어에 투여하였고(실험구), 다른 1개의 수조에는 진균 미흡착 사료 500 g을 위와 동일한 방법으로 투여하였다 (대조구).
- 실험 2에서는 무지개송어(체중 700~1,640 g, 체장 35~48 cm)를 수온 13~16℃, 염분 농도 30~32‰로 유지된 3톤 수조 2개에 각각 20마리씩 수용한 후, 1개의 수조에는 진균을 흡착시킨 사료 200 g (1.4×107~2×107 CFU/g)을 2일 간격으로 무지개송어에 투여하였고(실험구), 다른 1개의 수조에는 진균 미흡착 사료 200 g을 위와 동일한 방법으로 투여하였다(대조구).
- 실험어는 유수식으로(1일 약 24회전) 55일간 사육하였고, 1일에 1번씩 외부증상을 관찰하여 복부 팽만 유무를 확인하였다. 실험 완료일에는 실험어를 모두 채집하여 외부 및 내부 증상을 관찰하였고, 위팽창 유무를 조사하였다.
- 5~14℃, 염분 농도 25‰로 유지된 36톤 수조 2개에 각각 23마리씩 수용한 후, 1개의 수조에는 진균을 흡착시킨 사료 500 g (진균수: 107~3×107 colony forming unit (CFU)/g)을 2일 간격으로 무지개송어에 투여하였고(실험구), 다른 1개의 수조에는 진균 미흡착 사료 500 g을 위와 동일한 방법으로 투여하였다 (대조구). 실험어는 유수식으로 (1일 약 12회전) 42일간 사육하였고, 1일에 1번씩 외부증상을 관찰하여 복부 팽만 유무를 확인하였다. 실험 2에서는 무지개송어(체중 700~1,640 g, 체장 35~48 cm)를 수온 13~16℃, 염분 농도 30~32‰로 유지된 3톤 수조 2개에 각각 20마리씩 수용한 후, 1개의 수조에는 진균을 흡착시킨 사료 200 g (1.
- 4×107~2×107 CFU/g)을 2일 간격으로 무지개송어에 투여하였고(실험구), 다른 1개의 수조에는 진균 미흡착 사료 200 g을 위와 동일한 방법으로 투여하였다(대조구). 실험어는 유수식으로(1일 약 24회전) 55일간 사육하였고, 1일에 1번씩 외부증상을 관찰하여 복부 팽만 유무를 확인하였다. 실험 완료일에는 실험어를 모두 채집하여 외부 및 내부 증상을 관찰하였고, 위팽창 유무를 조사하였다.
- 진균의 형태는 광학현미경을 사용하여 관찰하였고, API 20C AUX kit (BioMérieux, France)를 사용하여 상법에 따라 동화시험 (assimilation test)을 실시하였다. 진균의 DNA는 Proteinase K와 phenolchloroform 용액을 사용하여 분리하였고, ITS5 (5ʹ-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3ʹ)와 ITS4 (5ʹ-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3ʹ) primer를 사용하여 polymerase chain reaction (PCR)을 실시하였다(White et al., 1990). PCR 반응은 30 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 9.
- 진균의 형태는 광학현미경을 사용하여 관찰하였고, API 20C AUX kit (BioMérieux, France)를 사용하여 상법에 따라 동화시험 (assimilation test)을 실시하였다.
- 2014년 3월 제주도에 위치한 육상 수조식 양식장에서 해수로 사육 중이던 무지개송어에서 복부가 팽만되어 복부를 위로한 채 물 위로 떠올라 옆으로 누워 유영하는 증상을 나타낸, 4마리(체중 900~1,400 g, 체장 32~37 cm)를 채집하여 질병검사를 실시하였다. 채집된 시료는 외부 및 내부 증상을 육안으로 관찰하였고, 아가미, 피부, 위를 비롯한 각종 장기를 대상으로 광학현미경을 사용하여 기생충 및 진균 검사를 실시하였다. 또한 위 내용물을 penicillin과 streptomycin이 첨가된 sabouraud dextrose agar (SDA, Difco, USA) 위에 100 μL씩 도말한 후 15℃에서 7일간 배양하여 진균을 분리하였다.
- 45 μm syringe filter로 여과하여 바이러스 분리용시료로 사용하였다. 해당 시료는 fathead minnow caudal trunkcell line (FHM)과 Chinook salmon embryo cell line (CHSE-214)에 접종하여 15℃에 배양하면서 세포변성효과 (Cytopathic effect, CPE)를 관찰하였다.
대상 데이터
- 2014년 3월 제주도에 위치한 육상 수조식 양식장에서 해수로 사육 중이던 무지개송어에서 복부가 팽만되어 복부를 위로한 채 물 위로 떠올라 옆으로 누워 유영하는 증상을 나타낸, 4마리(체중 900~1,400 g, 체장 32~37 cm)를 채집하여 질병검사를 실시하였다. 채집된 시료는 외부 및 내부 증상을 육안으로 관찰하였고, 아가미, 피부, 위를 비롯한 각종 장기를 대상으로 광학현미경을 사용하여 기생충 및 진균 검사를 실시하였다.
- 바이러스 검사는 신장과 비장 조직을 Hanks’ balanced salt solution (HBSS; Gibco, USA)으로 1 : 9 (0.5 g/4.5 mL)가 되게 처리하여 마쇄하고, 그 마쇄액을 0.45 μm syringe filter로 여과하여 바이러스 분리용시료로 사용하였다.
- 본 연구에서는 2014년 제주도에 위치한 양식장에서 해수로 사육 중인 무지개송어에서 만성질병으로 인해 약 10%의 누적폐사가 발생하였다. 병어는 복부가 팽만되어 있었고 위가 심하게 팽창되어 있었다.
데이터처리
- 5% agarose gel을 이용하여 확인하였고, gel purification kit (Bioneer, Korea)를 이용하여 정제 후 ABI PRISM dye terminator sequencing chemistry (Applied Biosystems, USA)를 사용하여 염기서열을 분석하였다. 분석된 염기서열은 national center for biotechnology information (NCBI) GenBank의 blast 분석을 실시하여 기존에 보고된 진균종과 비교하였다.
성능/효과
- 2). 2번과 4번 개체로부터 분리한 진균집락 중 무작위로 각각 1개씩을 선택한 후(분리주: RF2, RF4) ITS-5.8S rDNA-ITS 부위를 타겟으로 한 PCR을 실시한 결과, 400 bp (RF2)와 700 bp (RF5)의 PCR 산물이 확인되었다(datanot shown). PCR 산물을 사용하여 염기서열을 분석한 결과, 두종 모두 Candida sp.
- 30~32‰의 염분 농도에서는 실험구와 대조구 모두 폐사되는 개체는 관찰되지 않았으며, 모든 개체에서 복부 팽만과 위 팽창 증상은 관찰되지 않았다(data not shown).
- API 20C AUX kit를 사용하여 RF2과 RF4의 동화작용을 검사한 결과, RF2는 D-glucose, methyl-αD-glucopyranoside, D-cellobiose, D-maltose, D-saccharose, D-trehalose, D-melezitose, Adonitol, D-sorbitol, calcium 2-keto-gluconate, N-acetyl-glucosamine에 양성 반응하여 C. iusitaniae와 99.8%의 상동성을 나타내었다(Table 1).
- 가 유입되었는지를 확인하기 위해, 사료 투여 후 2시간 후와 1일이 경과된 시점에서 실험어를 채집하여 위 내의 진균수를 측정한 결과, 2.8×106~2.1×107 CFU/g (염분 농도 25‰에서 사육한 무지개송어의 위)와 1.6~4.9×106 CFU/g (염분 농도 30~32‰에서 사육한 무지개송어의 위)의 진균이 분리되었다(data not shown).
- , 2008). 병어를 대상으로 병원체 검사를 실시한 결과, 기생충, 세균 및 바이러스는 검출되지 않았으나(data not shown) 팽창된 위의 내용물에서 다수의 진균이 분리되었다(1번 개체: 7,840 CFU/mL, 2번 개체: 1,120 CFU/mL, 3번 개체: 7,200 CFU/mL, 4번 개체: 4,000 CFU/mL). 진균은 SDA에서 크림색의 원형 집락을 나타내었다(data not shown).
- 2014년 제주도에 위치한 양식장에서 해수로 사육 중인 무지개송어에서 만성질병으로 인해 약 10%의 누적폐사가 발생하였다. 병어를 대상으로 질병 검사를 실시한 결과, 기생충, 세균 및 바이러스는 검출되지 않았으나 팽창된 위에서 진균이 분리되었다. 본 연구에서는 해수 사육 무지개송어에 발생되어진 위팽창증후군을 보고하고자 하며, 또한 분리된 진균을 이용한 감염 실험을 통하여 질병과의 연관성을 조사한 결과를 보고하고자 한다.
- 는 감염 실험을 통하여 위팽창증후군과 관련성이 낮은 것으로 확인되어, 무지개송어에서 발생한 위팽창증후군은 환경적 요인 등의 비감염성 원인에 의해 발생한 것으로 사료된다. 본 연구에서는 국내에서 처음으로 해수 사육무지개송어에서 위팽창증후군이 발생하는 것을 확인하였다.
- 9%의 상동성을 나타내었다. 이상의 결과, 병어는 위팽창증후군의 임상 증상을 보였으며, 팽창된 위의 내용물에서 진균인 Candida sp.가 분리되는 것을 확인하였다.
- 크림색 원형 집락을 현미경으로 관찰한 결과, 난원형(n=10, 5.5 (4.3~6.7) μm×3.6 (2.9~4.3) μm) 또는 원형(n=10, 2.9 (2.4~3.1) μm×2.9 (2.4~3.1) μm)의 효모가 관찰되었다(Fig. 2).
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