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문제 정의
- 8) 본 실험에서는 20oC에서 약 1 mm정도까지 자라며 대략 20일 정도의 짧은 수명을 가지는 몸이 투명한 예쁜꼬마선충을 대상으로26) 삼백초 추출물이 선충 내의 항산화 체계에 미치는 영향에 대해서 살펴보았다. 삼백초의 분획 중 ethyl acetate 분획은 DPPH radical과, superoxide 소거활성시험에서 가장 강한 소거 활성을 보여 주었다.
- 형질 전환 선충 내 SOD-3의 발현 증가 효능 −선충 내에서 oxidative stress에 저항하기 위한 단백질의 증가 여부를 확인하기 위해서 SOD 발현 유전자의 증가 여부를 확인하였다.
제안 방법
- Catalase activity는 Aebi의 방법을 응용하여 25 mM H2O2에 시료 50 μL(EDZ 250, 500 μg/mL)를 3분 동안 반응시키고 240 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- DPPH Free Radical 소거 활성 측정19)− 96 well plate에 시료를 ethanol로 각 분획 별로 조제한 용액에 13 μM의 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)을 일정량씩 가하였다.
- Light box 안의 온도는 20±1℃, 빛의 밝기는 5,500 lux를 유지하였으며, NBT가 빛 아래에서 blue formazan으로 환원되어 생성되는 blue formazan 형성 억제능을 560 nm에서 측정하였다.
- Oxidative Stress 저항성 증가 효능 –삼백초 ethyl acetate 분획이 선충의 stress 저항성에 미치는 영향은 oxidative stress 조건에서 선충을 배양하여 생존율을 확인하였다.
- −성장 단계가 동일한 선충을 각각의 농도 별 plate에서 배양하였다(EDZ 250, 500 μg/mL). Oxidative stress에 의한 내성은 기존 방법을 약간 변형하여 평가하였으며, 성체가 된 후 7일째에 일시적으로 선충을 1 mM juglone이 함유된 M9 buffer가 담긴 96 well plate의 well에 옮기고 시간 별로 생존율을 확인하였다.
- 5). SOD 활성은 Ibrahim등의 방법을 응용하여 측정하였다. 먼저 10 mM phosphate buffer(pH 8.
- Superoxide 억제 활성20)−시료의 superoxide 억제 능력은 methionine, riboflavin, NBT로 구성된 평가 시스템을 이용하여 광화학 작용을 측정하는 것으로, 반응 혼합액은 2.6 μM riboflavin, 3 mM methionine, 75 μM NBT, 0.1 mM EDTA, PBS(pH 7.4) 및 여러 농도의 시료로 이루어졌다.
- 항산화 효과는 시료를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도와 비교하였다. 각 시료에 대한 DPPH radical 소거 작용을 3회 반복하여 측정하였다.
- 추출 및 분획 − 삼백초 600 g을 분쇄하여 50% 주정으로 가끔 진탕하면서 50℃에서 5시간씩 2회 추출하였다. 그 추출액을 수욕상에서 감압농축하여 ethanol 엑스 약 84 g을 얻었으며, 이 ethanol엑스를 증류수로 현탁시키고 상법에 따라 동량의 methylene chloride(9.3 g), ethyl acetate(7.2 g) 및 nbutanol(17.4 g)의 순으로 용매 분획하여 각각의 분획물을 얻었다.
- 본 연구에서는 삼백초 알코올 추출물의 용매 분획을 DPPH free radical 및 superoxide 소거능을 측정하여 가장 강한 항산화능을 나타낸 ethyl acetate 분획을 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans)을 이용하여 선충 내의 항산화 효소인 superoxide dismutase(SOD)와 catalase의 활성과 세포내의 활성 산소종(ROS)의 축적 억제 능력 을 측정하였다. 또한, juglone으로 유도된 oxidative stress에 대한 저항능력을 확인하고 이와 관련하여 선충 내의 oxidative stress 저항 단백질의 증가 여부를 확인하기 위하여 SOD-3을 포함한 형질 전환 선충 CF1553을 이용하여 SOD 발현 증가 여부를 확인하였다.
- 성체가 된 후 4일째에 사용하였으며, 선충은 sodium azide(2%)로 마취시켰고 GFP 발현은 형광 실체 현미경(Olympus, Japan)으로 관찰하였다. 발현 강도를 정량, 분석하기 위해 현미경을 이용한 사진 촬영과 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 모든 실험은 3회 반복하였다.
- 본 연구에서는 삼백초 알코올 추출물의 용매 분획을 DPPH free radical 및 superoxide 소거능을 측정하여 가장 강한 항산화능을 나타낸 ethyl acetate 분획을 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans)을 이용하여 선충 내의 항산화 효소인 superoxide dismutase(SOD)와 catalase의 활성과 세포내의 활성 산소종(ROS)의 축적 억제 능력 을 측정하였다. 또한, juglone으로 유도된 oxidative stress에 대한 저항능력을 확인하고 이와 관련하여 선충 내의 oxidative stress 저항 단백질의 증가 여부를 확인하기 위하여 SOD-3을 포함한 형질 전환 선충 CF1553을 이용하여 SOD 발현 증가 여부를 확인하였다.
- 선충 세포 내 활성 산소종(ROS) 감소 효능 –삼백초 ethyl acetate 분획의 농도 별 세포 내 활성 산소종의 감소 효능을 알아보기 위해 H2DCF-DA와 선충 내부의 활성 산소종을 반응시켜 형광을 관찰하였다.
- 선충에 oxidative stress를 유도하기 위해서 juglone이 함유된 plate에서 배양한 대조군 선충의 최고 생존 시간은 22시간 이었으나, ethyl acetate분획 500 μg/mL 농도에서는 생존시간을 36시간으로 증가시켰다.
- 형질전환 선충 내 SOD-3::GFP 형광 측정 −형질 전환된 선충으로 SOD-3::GFP를 포함한 CF1553을 농도 별로 투여된 배지에 배양하였다. 성체가 된 후 4일째에 사용하였으며, 선충은 sodium azide(2%)로 마취시켰고 GFP 발현은 형광 실체 현미경(Olympus, Japan)으로 관찰하였다. 발현 강도를 정량, 분석하기 위해 현미경을 이용한 사진 촬영과 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
- 추출 및 분획 − 삼백초 600 g을 분쇄하여 50% 주정으로 가끔 진탕하면서 50℃에서 5시간씩 2회 추출하였다.
- 대조 약물은 L-ascorbic acid를 사용하였다. 항산화 효과는 시료를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도와 비교하였다. 각 시료에 대한 DPPH radical 소거 작용을 3회 반복하여 측정하였다.
대상 데이터
- Statistical difference between the curves was analyzed by log-rank test. All experiments were done in triplicates.
- 10초간 진탕한 후 25℃에서 30분간 방치한 후 microplate reader를 이용하여 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조 약물은 L-ascorbic acid를 사용하였다. 항산화 효과는 시료를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도와 비교하였다.
- 선충 세포 내 활성 산소종(ROS) 분석24)−세포 내 활성 산소종은 2',7'-dichlorodihydro fluorescein diacetate(H2DCFDA)를 사용하여 측정하였다.
- 실험 재료 − 실험에 사용한 삼백초는 2016년에 완주군 구이에서 재배한 것을 제공받아 김대근교수가 검증한 후에 실험에 사용하였으며, 표준품은 우석대학교 약학대학 생약표본실에 보관하고 있다(WSU-16-007).
- 예쁜꼬마선충의 배양21)−예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans, wild type)은 Caenorhabditis Genetic Center(CGC; University of Minnesota, Minneapis, MN)로부터 제공받은 것을 사용하였으며, Escherichia coli OP50을 도말한 Nematode Growth Medium(NGM) agar plate에서 배양하였다(20℃).
- 형질전환 선충 내 SOD-3::GFP 형광 측정 −형질 전환된 선충으로 SOD-3::GFP를 포함한 CF1553을 농도 별로 투여된 배지에 배양하였다.
데이터처리
- Differences compared to the control were considered significant at *p<0.05 and ***p<0.001 by one-way ANOVA.
- Differences compared to the control were considered significant at *p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001 by one-way ANOVA.
- For the oxidative stress assays, worms were transferred to 96-well plate containing 1 mM of juglone liquid culture, and then their viability was scored. Statistical difference between the curves was analyzed by log-rank test. All experiments were done in triplicates.
- 그룹 간의 통계적 유의성 검정은 Student's t-test를 통해서 분석하였고 선충의 연속적인 생존도는 Log-rank test분석 방법을 이용하였다.
이론/모형
- Change in mean lifespan compared with control group (%). Statistical significance of the difference between survival curves was determined by log-rank test using the Kaplan-Meier survival analysis. Differences compared to the control were considered significant at *p<0.
성능/효과
- 또한 선충에 ethyl acetate 분획을 처리하고 juglone을 투여한 후 선충 세포 내 활성 산소종(ROS) 수치를 확인한 결과 상당한 활성 산소종의 축적 억제 효능을 나타냈다. Juglone을 이용하여 oxidative stress를 발생시키고 선충의 stress 저항능력을 확인한 결과 ethyl acetate 분획 처리군이 oxidative stress 조건하에서 대조군과 비교하여 생존율이 농도 의존적으로 상당히 증가하는 것이 확인되었다. 이와 관련하여, GFP-fused transgenic strain CL2070을 이용하여 juglone으로 처리한 oxidative stress 저항성 확인실험에서 형광 발현율이 상당히 증가함을 확인되어 oxidative stress에 저항성이 있는 단백질의 발현이 증가되었음을 확인하였다.
- SOD-3을 포함한 형질 전환 선충 CF1553을 사용하여 실험한 결과 CF1553 형질전환 선충에 삼백초 ethyl acetate 분획 처리군이 처리되지 않은 선충에 비해 상당히 높은 SOD-3::GFP 발현율(41.8%, ***p<0.001)을 보여주었다(Fig. 6A, 6B).
- Superoxide 소거 활성 − Riboflavin 유래 superoxide quenching 활성에서는 대조군 비타민 C가 IC50값이 66.2 μg 으로 superoxide quenching 활성을 보였으며, 삼백초 분획 중 ethyl acetate층은 IC50값이 26.1 μg/mL으로 나타나 대조군보다 높은 superoxide 소거 활성을 나타냈다(Fig. 2).
- 대조군의 평균 생존 시간이 14.0±0.0시간었으나 500 μg/mL 농도 처리군은 평균 생존 시간을 25.6±0.7시간으로 82.8%를 향상시켰다(***p<0.001) (Fig. 5, Table I).
- 삼백초의 ethyl acetate 분획은 DPPH radical과, superoxide 소거 활성 시험에서 강한 항산화력을 보여 주었으며, 예쁜꼬마선충 내의 항산화 효소인 SOD 및 catalase의 활성이 ethyl acetate 분획 투여에 의해 농도 의존적으로 활성이 높아졌다. 또한 선충 세포 내의 ROS의 발생량은 ethyl acetate 분획 투여군에서 농도의존적으로 감소하는 효과를 보여 주었으며, juglone을 이용하여 oxidative stress를 측정한 결과 생존율이 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다. 이와 관련하여 mutant인 GFP-fused transgenic strain CL2070을 이용하여 oxidative stress 저항성 실험을 확인한 결과 oxidative stress에 저항성이 있는 단백질의 발현이 증가되었음을 확인하였다.
- 선충 세포의 양을 정량한 후 선충 내의 항산화 효소인 SOD 및 catalase의 활성을 알아본 결과 삼백초 ethyl acetate 분획은 농도 의존적으로 SOD 및 catalase의 활성을 높이는 것으로 확인되었다. 또한 선충에 ethyl acetate 분획을 처리하고 juglone을 투여한 후 선충 세포 내 활성 산소종(ROS) 수치를 확인한 결과 상당한 활성 산소종의 축적 억제 효능을 나타냈다. Juglone을 이용하여 oxidative stress를 발생시키고 선충의 stress 저항능력을 확인한 결과 ethyl acetate 분획 처리군이 oxidative stress 조건하에서 대조군과 비교하여 생존율이 농도 의존적으로 상당히 증가하는 것이 확인되었다.
- 발현 강도를 정량, 분석하기 위해 현미경을 이용한 사진 촬영과 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 모든 실험은 3회 반복하였다.
- 삼백초의 ethyl acetate 분획은 DPPH radical과, superoxide 소거 활성 시험에서 강한 항산화력을 보여 주었으며, 예쁜꼬마선충 내의 항산화 효소인 SOD 및 catalase의 활성이 ethyl acetate 분획 투여에 의해 농도 의존적으로 활성이 높아졌다. 또한 선충 세포 내의 ROS의 발생량은 ethyl acetate 분획 투여군에서 농도의존적으로 감소하는 효과를 보여 주었으며, juglone을 이용하여 oxidative stress를 측정한 결과 생존율이 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다.
- 8) 본 실험에서는 20oC에서 약 1 mm정도까지 자라며 대략 20일 정도의 짧은 수명을 가지는 몸이 투명한 예쁜꼬마선충을 대상으로26) 삼백초 추출물이 선충 내의 항산화 체계에 미치는 영향에 대해서 살펴보았다. 삼백초의 분획 중 ethyl acetate 분획은 DPPH radical과, superoxide 소거활성시험에서 가장 강한 소거 활성을 보여 주었다. 선충 세포의 양을 정량한 후 선충 내의 항산화 효소인 SOD 및 catalase의 활성을 알아본 결과 삼백초 ethyl acetate 분획은 농도 의존적으로 SOD 및 catalase의 활성을 높이는 것으로 확인되었다.
- 삼백초의 분획 중 ethyl acetate 분획은 DPPH radical과, superoxide 소거활성시험에서 가장 강한 소거 활성을 보여 주었다. 선충 세포의 양을 정량한 후 선충 내의 항산화 효소인 SOD 및 catalase의 활성을 알아본 결과 삼백초 ethyl acetate 분획은 농도 의존적으로 SOD 및 catalase의 활성을 높이는 것으로 확인되었다. 또한 선충에 ethyl acetate 분획을 처리하고 juglone을 투여한 후 선충 세포 내 활성 산소종(ROS) 수치를 확인한 결과 상당한 활성 산소종의 축적 억제 효능을 나타냈다.
- 선충 체내의 항산화 효소 SOD 및 Catalase 활성 증가 효능 − Xanthine을 기질로 xanthine oxidase의 효소 반응 과정 중에 생성되는 superoxide anion을 활용하여 SOD의 활성을 측정한 결과 Fig. 3A에서 나타난 바와 같이 선충의 삼백초 ethyl acetate 500 μg/mL 투여군은 SOD의 활성을 농도의존적으로 증가시켰으며, ethyl acetate분획 500 μg/mL 투여군은 대조군과 비교하여 SOD 활성을 약 39.8% 정도 증가시켰다(***p<0.001).
- 또한 선충 세포 내의 ROS의 발생량은 ethyl acetate 분획 투여군에서 농도의존적으로 감소하는 효과를 보여 주었으며, juglone을 이용하여 oxidative stress를 측정한 결과 생존율이 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다. 이와 관련하여 mutant인 GFP-fused transgenic strain CL2070을 이용하여 oxidative stress 저항성 실험을 확인한 결과 oxidative stress에 저항성이 있는 단백질의 발현이 증가되었음을 확인하였다. 이러한 결과로 볼 때 삼백초 및 그 ethyl acetate 분획은 항산화 및 이와 관련된 질병의 예방 및 치료를 위한 물질 개발의 자원으로서의 가치가 충분히 있을 것으로 판단된다.
- Juglone을 이용하여 oxidative stress를 발생시키고 선충의 stress 저항능력을 확인한 결과 ethyl acetate 분획 처리군이 oxidative stress 조건하에서 대조군과 비교하여 생존율이 농도 의존적으로 상당히 증가하는 것이 확인되었다. 이와 관련하여, GFP-fused transgenic strain CL2070을 이용하여 juglone으로 처리한 oxidative stress 저항성 확인실험에서 형광 발현율이 상당히 증가함을 확인되어 oxidative stress에 저항성이 있는 단백질의 발현이 증가되었음을 확인하였다. 활성 산소종은 미토콘드리아의 세포 호흡, 세포 손상, phagocytosis 및 스트레스 등에 생성되어 체내의 항산화제의 결핍으로 인해 oxidative stress를 야기하는 것으로 보고되어 있으며, 스트레스에 저항할 수 있는 능력은 노화방지나 수명연장과 상당한 관련성이 있다고 보고되어 있다.
- 활성 산소종 형광의 감소 폭은 대조군과 비교하여 ethyl acetate층 500 μg/mL 투여군에서 평균 약 15.2%(***p<0.001) 활성 산소종을 감소시키는 것으로 확인되었다(Fig. 4).
후속연구
- 활성 산소종은 미토콘드리아의 세포 호흡, 세포 손상, phagocytosis 및 스트레스 등에 생성되어 체내의 항산화제의 결핍으로 인해 oxidative stress를 야기하는 것으로 보고되어 있으며, 스트레스에 저항할 수 있는 능력은 노화방지나 수명연장과 상당한 관련성이 있다고 보고되어 있다.27,28) 삼백초의 ethyl acetate 분획은 선충에 있어 체내의 SOD나 catalase 등의 항산화 효소의 활성을 증가시키며, 활성 산소종의 축적을 억제하고 스트레스에 대한 저항력을 높여 주므로 선충의 수명연장이나 노화 지연에 영향을 미칠 수 있을 것으로 추측된다.29,30) 이러한 결과는 기존의 삼백초에서 보고된 삼백초의 lignin, neolignan 및 flavonoid 성분의 항산화 효능과,13,31) 추출물의 항염증 효능,14) 항암효능15,17,32) 등이 이러한 선충의 스트레스 저항 능력 및 항산화 활성에 영향을 줄 것으로 생각되며, 앞으로 활성 물질에 대한 물질의 분리와 구조 확인 및 단일 물질 수준에서의 항산화 활성 확인이 필요할 것으로 사료된다.
- 27,28) 삼백초의 ethyl acetate 분획은 선충에 있어 체내의 SOD나 catalase 등의 항산화 효소의 활성을 증가시키며, 활성 산소종의 축적을 억제하고 스트레스에 대한 저항력을 높여 주므로 선충의 수명연장이나 노화 지연에 영향을 미칠 수 있을 것으로 추측된다.29,30) 이러한 결과는 기존의 삼백초에서 보고된 삼백초의 lignin, neolignan 및 flavonoid 성분의 항산화 효능과,13,31) 추출물의 항염증 효능,14) 항암효능15,17,32) 등이 이러한 선충의 스트레스 저항 능력 및 항산화 활성에 영향을 줄 것으로 생각되며, 앞으로 활성 물질에 대한 물질의 분리와 구조 확인 및 단일 물질 수준에서의 항산화 활성 확인이 필요할 것으로 사료된다.
- 1-3) 항산화제는 산화적 손상을 늦추거나 방해하며 혹은 제거할 수 있는 능력을 가진 물질로서 인체 내에 존재하는 superoxide dismutase(SOD), glutathione peroxidase 및 catalase 등과 같은 항산화 효소들만으로는 불완전하여 건강을 유지하기 위해서는 외부에서 공급되는 vitamin C, E, carotenoid 및 polyphenol 물질 등의 항산화제의 공급이 필요하다.4,5) 이러한 과도한 활성 산소종은 조직세포의 지질, 단백질과 DNA와 같은 핵산까지 손상을 입히며 oxidative stress를 주어 염증성 질환, 뇌졸중, 심장질환 등과 같은 질병을 비롯하여 노화를 촉진하는 결과로 이어질 수 있어 이를 예방하기 위해서는 외부에서 투여할 수 있는 항산화제의 개발이 필요하다. 최근 몇 종의 합성 항산화제들이 사용되어 오고 있으나 부작용이 상대적으로 적을 것을 판단되는 천연물 유래 항산화제에 대한 관심이 높아지고 있다.
- 이와 관련하여 mutant인 GFP-fused transgenic strain CL2070을 이용하여 oxidative stress 저항성 실험을 확인한 결과 oxidative stress에 저항성이 있는 단백질의 발현이 증가되었음을 확인하였다. 이러한 결과로 볼 때 삼백초 및 그 ethyl acetate 분획은 항산화 및 이와 관련된 질병의 예방 및 치료를 위한 물질 개발의 자원으로서의 가치가 충분히 있을 것으로 판단된다.
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