[논문]코돈 최적화된 유전자를 이용한 재조합 대장균으로부터 인간 인터페론 베타 발현

김종석; 장승원; 박재범; 권덕호; 장영준; 정형무; 한상인; 홍억기; 하석진

doi:10.7841/ksbbj.2017.32.1.16

코돈 최적화된 유전자를 이용한 재조합 대장균으로부터 인간 인터페론 베타 발현
Production of Human Interferon β by Recombinant E. coli Using the Codon Optimized Gene 원문보기

KSBB Journal, v.32 no.1, 2017년, pp.16 - 21

김종석 (강원대학교 생물공학과) , 장승원 (강원대학교 생물공학과) , 박재범 (강원대학교 생물공학과) , 권덕호 (강원대학교 생물공학과) , 장영준 (한국코러스) , 정형무 (한국코러스) , 한상인 (한국코러스) , 홍억기 (강원대학교 생물공학과) , 하석진 (강원대학교 생물공학과)

Abstract ▼ AI-Helper

The multiple sclerosis caused by multiple inflammatory disease or immune system disorder, is usually treated by interferon ${\beta}$ through adjusting the abnormal immune reactions. For high production of human interferon ${\beta}$ using recombinant E. coli, codon optimized and wild type genes were synthesized. When pET-15b or pET-21a vector was used as an expression vector with each gene, there was no target protein expression. When pQE30 vector was used as an expression vector, human interferon ${\beta}$ was expressed by recombinant E. coli XL1-blue and E. coli JM109. Using the codon optimized gene, the expression of human interferon ${\beta}$ was slightly increased as compared to that from wild type gene. However, most of expressed human interferon ${\beta}$ was insoluble form.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

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문제 정의

재조합 인간 인터페론 베타의 대량생산을 위한 발현벡터로는 pET-15b벡터와 pET-21a벡터 (Novagen, WI, USA) 그리고 pQE30 벡터(QIAGEN, CA, USA)가 각각 사용되었다. 대장균은 각각 E. coli Top10 (Invitrogen, CA, USA)이 cloning을 목적으로 사용되었으며 E. coli BL21 (DE3) (Novagen, WI, USA), E. coli Rosetta^TM (DE3) pLysS (Novagen, WI, USA), E.coli HMS174 (DE3) (Novagen, WI, USA), E. coli XL1-blue(Invitrogen, CA, USA), E. coli JM109 (Promega, WI, USA)가단백질 발현을 목적으로 본 연구에 사용되었다. 벡터 시스템개발을 위한 제한효소와 ligase 효소들은 모두 Enzynomics(Daejeon, Korea)의 제품을 구매하여 이용하였다.
본 연구에서는 pET-15b벡터를 이용하여 N-terminal에 His6 tag를 갖는 재조합 인간 인터페론 베타를 발현하기 위한 시도를 하였으며, 또한 pET-21a 벡터를 이용한 경우엔 벡터에 삽입하는 과정에서 reverse primer에 종결 코돈을 삽입하여 His6tag가 제거된 순수한 재조합 인간 인터페론 베타를 발현하기 위한 시도를 하였다. 따라서 같은 T7 프로모터를 갖는 발현 벡터를 이용하여 His6 tag를 갖는 퓨전 재조합 인간 인터페론 베타와 His6 tag를 갖지 않는 순수한 재조합 인간 인터페론 베타를 각각 발현하여 비교하고자 하였다.
두 가지 벡터의 차이점으로는 pET-15b벡터로 발현할 경우엔 발현된 단백질의 N-terminal에 그리고 pET-21a벡터는 C-terminal에 hexahistidine (His6) tag를 가지고 있어서 단백질의 발현 이후 NiNTA 컬럼을 이용해 정제과정이 용이하다는 장점을 가지고 있다. 본 연구에서는 pET-15b벡터를 이용하여 N-terminal에 His6 tag를 갖는 재조합 인간 인터페론 베타를 발현하기 위한 시도를 하였으며, 또한 pET-21a 벡터를 이용한 경우엔 벡터에 삽입하는 과정에서 reverse primer에 종결 코돈을 삽입하여 His6tag가 제거된 순수한 재조합 인간 인터페론 베타를 발현하기 위한 시도를 하였다. 따라서 같은 T7 프로모터를 갖는 발현 벡터를 이용하여 His6 tag를 갖는 퓨전 재조합 인간 인터페론 베타와 His6 tag를 갖지 않는 순수한 재조합 인간 인터페론 베타를 각각 발현하여 비교하고자 하였다.
이로 인해 17번째 cysteine 잔기를 serine으로 치환된 인터페론 베타 1b가 주로 생산되고 있다 [6,15]. 본 연구에서는 재조합 대장균을 이용한 인간 인터페론 베타의 대량 생산을 위해 야생형(wild type) 또는 코돈 최적화된 (codon optimized) 인간 인터페론 베타 유전자를 각각 확보한 후 다양한 발현 벡터에 따른 인간 인터페론 베타 1b의 발현을 확인하였다.

제안 방법

50 μg/mL의 엠피실린이 포함된 LB 배지에 상기 벡터가 도입된 재조합 대장균을 각각 접종하여, 37oC에서 진탕배양하였다.
Insoluble 형태이긴 하지만 발현이 확인된 pQE30-hIFNβW와 pQE30-hIFNβO 발현 벡터를 다른 발현 균주인 E. coli JM109에 도입하여 재조합 인간 인터페론 베타 발현을 시도하였다.
재조합 인간 인터페론 베타 유전자가 삽입된 총 16가지 재조합 대장균의 발현 유무를 확인하기 위하여 각각 SDS-PAGE를 수행하였다. SDS-PAGE의 stacking gel은 5% polyacrylamide를 그리고 separating gel은 12% polyacrylamide를 각각 이용하였으며 전기영동 조건은 stacking gel의 경우 60 V와 500 mA로 20분 동안 그리고 separating gel의 경우 110 V와 500 mA로 1시간 30분 가량 전기영동하였다. 그 후 Coomassie staining solution (Coomassie brilliant blue R-250 3 mM, SIGMA aldrich, Korea)를 이용하여 1시간 동안 염색 후 증류수로세척해주고, destaining solution을 첨가하여 염색약을 제거하였다.
Table 1에 기술된 primer들과 제한효소들을 이용하여 pQE30-hIFNβW와 pQE30-hIFNβO를 각각 개발하였다.
Table 1에 기술된 각각의 primer들과 제한효소들을 이용하여 각각의 재조합 인간 인터페론 베타 발현 벡터를 개발하였다. 개발된 총 4가지의 재조합 인간 인터페론 베타 발현용 벡터(pET15b-hIFNβW, pET15b-hIFNβO, pET21a-hIFNβW, pET21ahIFNβO)는 씨컨싱 (sequencing)을 통해 모든 서열이 정확하게 도입되었는지 검증한 후 각각의 발현 벡터들을 3가지의 발현 균주인 E.
pET15b-hIFNβW, pET15b-hIFNβO, pET21a-hIFNβW, pET21a-hIFNβO의 경우엔 E. coli BL21 (DE3), E. coli Rosetta TM (DE3) pLysS, E. coli HMS174 (DE3)의 3가지 발현 균주를 이용하였으며 pQE30-hIFNβW, pQE30-hIFNβO의 경우엔 E. coli XL1-blue와 E. coli JM109의 2가지 발현 균주에 각각 도입하여 재조합 인간 인터페론 베타의 발현을 확인하였다.
pQE30 발현용 벡터를 이용하여 재조합 인간 인터페론 베타를 발현하기 위한 시도를 하였다. pQE30 발현용 벡터는 T5 프로모터를 가지고 있으며 이는 pET-15b또는 pET-21a 벡터가 가지는 T7 프로모터에 비해 비교적 낮은 발현 정도를 갖는 것으로 알려져 있다 (11).
개발된 6가지 종류의 재조합 인간 인터페론 베타 생산을 위한 발현벡터는 각각 발현 벡터에 따라 서로 다른 발현 균주를 이용하였다. pET15b-hIFNβW, pET15b-hIFNβO, pET21a-hIFNβW, pET21a-hIFNβO의 경우엔 E.
Table 1에 기술된 primer들과 제한효소들을 이용하여 pQE30-hIFNβW와 pQE30-hIFNβO를 각각 개발하였다. 개발된 두 가지의 재조합 인간 인터페론 베타 발현용 벡터는 씨컨싱을 통해 모든 서열이 정확히 도입되었는지 검증하였으며 각각 E. coli XL1-blue에 도입한 후 IPTG를 이용한 발현 유도를 통해 재조합 인간 인터페론 베타 발현을 시도하였다. Fig.
개발된 총 4가지의 재조합 인간 인터페론 베타 발현용 벡터(pET15b-hIFNβW, pET15b-hIFNβO, pET21a-hIFNβW, pET21ahIFNβO)는 씨컨싱 (sequencing)을 통해 모든 서열이 정확하게 도입되었는지 검증한 후 각각의 발현 벡터들을 3가지의 발현 균주인 E. coli BL21 (DE3), E. coli Rosetta TM (DE3) pLysS, E. coli HMS174 (DE3)에 도입하여 IPTG를 이용한 발현 유도를 통해 재조합 인간 인터페론 베타 발현을 시도하였다.
50 μg/mL의 엠피실린이 포함된 LB 배지에 상기 벡터가 도입된 재조합 대장균을 각각 접종하여, 37^oC에서 진탕배양하였다. 그리고 인간 인터페론 베타 발현을 유도하기 위하여 흡광도 (OD₆₀₀) 값이 0.4~0.5이 되었을 때, 단백질 발현 유도물질인 IPTG를 최종농도가 0.2 mM 되도록 첨가하고, 20^oC에서 18시간 동안 추가로 배양하여 인간 인터페론 베타의 발현을 유도하였다. 배양된 재조합 대장균 배양액을 원심분리하여 상등액을 제거하고 세포를 회수한 후 회수된 세포의 파쇄를 위해 pH 7.
야생형 그리고 코돈 최적화된 인간 인터페론 베타 유전자를 재조합 대장균에서 효과적으로 발현하기 위하여 pET-15b와 pET-21a 발현용 벡터를 먼저 이용하였다. pET-15b와 pET-21a 발현용 벡터는 모두 강력한 프로모터 (promoter)인 T7 프로모터를 가지고 있어서 재조합 대장균에서 외부 단백질을 과 발현시킬 때 주로 이용되는 것으로 알려져 있다.
총 166개의 아미노산으로 구성된 인간 인터페론 베타 단백질을 발현하기 위하여 이미 보고되어 있는 야생형의 인간 인터페론 베타 유전자를 포함하여 대장균에서의 보다 효과적인 발현을 위해 대장균에서의 발현에 적합한 codon usage를 이용하여 코돈이 최적화된 유전자를 각각 합성하였다. 이때 코돈 최적화된 인간 인터페론 베타 유전자의 디자인은 (주)바이오니아의 자체 프로그램을 이용하였다. 또한 단백질 발현 시에 misfolding 또는 inclusion body 형성을 방지하기 위해 17번째 아미노산인 cysteine은 serine으로 치환하여 주었다 [15-17].
이러한 방법을 통해 총 6가지 (pET15b-hIFNβW, pET15b-hIFNβO, pET21a-hIFNβW, pET21a-hIFNβO,pQE30-hIFNβW, pQE30-hIFNβO)의 재조합 인간 인터페론 베타 생산을 위한 발현벡터를 개발하였다.
다발성 염증성 질환 또는 면역체계 이상으로 발생되는 질병인 다발성경화증은 주로 인터페론 베타를 이용하여 비정상적인 면역작용을 조절한다. 인간 인터페론 베타를 대장균을 이용해 대량 생산하기 위해 코돈이 최적화된 유전자와 야생형 유전자를 각각 합성하였다. 각각의 인간 인터페론 베타 유전자를 pET-15b 또는 pET-21a 발현 벡터에 삽입하여 발현을 시도한 결과 인간 인터페론 베타의 발현을 확인하지 못하였다.
재조합 인간 인터페론 베타 유전자가 삽입된 총 16가지 재조합 대장균의 발현 유무를 확인하기 위하여 각각 SDS-PAGE를 수행하였다. SDS-PAGE의 stacking gel은 5% polyacrylamide를 그리고 separating gel은 12% polyacrylamide를 각각 이용하였으며 전기영동 조건은 stacking gel의 경우 60 V와 500 mA로 20분 동안 그리고 separating gel의 경우 110 V와 500 mA로 1시간 30분 가량 전기영동하였다.
총 166개의 아미노산으로 구성된 인간 인터페론 베타 단백질을 발현하기 위하여 이미 보고되어 있는 야생형의 인간 인터페론 베타 유전자를 포함하여 대장균에서의 보다 효과적인 발현을 위해 대장균에서의 발현에 적합한 codon usage를 이용하여 코돈이 최적화된 유전자를 각각 합성하였다. 이때 코돈 최적화된 인간 인터페론 베타 유전자의 디자인은 (주)바이오니아의 자체 프로그램을 이용하였다.
4의 67 mM 인산완충식염수 (phosphate buffered saline)에 부유시킨 다음 초음파 분쇄기를 이용하여 파쇄하였다. 파쇄된 세포를 원심분리를 이용해 수용성 분액과 불용성 분액으로 나누어 각각을 SDS-PAGE를 이용하여 분석하였다.

대상 데이터

IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)는 바이오세상 (Biosesang, Korea)에서 구매하였으며, SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfate poly acrylamide gel electrophoresis)에 사용된 각종 시약들은 Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories. Inc, USA)에서 구매하였다.
야생형 인간 인터페론 베타 유전자와 대장균에서의 발현에 대해 코돈 (codon) 최적화된 인간 인터페론 베타 유전자는 바이오니아 (Daejeon, Korea)에 의해 합성되었다. 대장균에 의한 재조합 단백질의 효과적인 발현을 위해 합성된 코돈 최적화된 인간 인터페론 베타 유전자는 (주)바이오니아의 Gene Synthesis 프로그램에 의해 디자인되었다. 발현벡터 개발을 위해 사용된 각각의 primer와 제한효소에 대한 정보는 Table 1에 정리하였다.
coli JM109 (Promega, WI, USA)가단백질 발현을 목적으로 본 연구에 사용되었다. 벡터 시스템개발을 위한 제한효소와 ligase 효소들은 모두 Enzynomics(Daejeon, Korea)의 제품을 구매하여 이용하였다. IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)는 바이오세상 (Biosesang, Korea)에서 구매하였으며, SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfate poly acrylamide gel electrophoresis)에 사용된 각종 시약들은 Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories.

성능/효과

Fig. 3A의 결과와 같이 pQE30-hIFNβW와 pQE30-hIFNβO 발현 벡터를 이용한 경우, His6 tag가 포함되어 약21kda 크기의 재조합 인간 인터페론 베타 발현을 확인할 수 있었다.
그리고 코돈 최적화된 인간 인터페론 베타 유전자와 야생형 인간 인터페론 베타 유전자의 발현 차이를 크게 확인할 수 없었다. 다만 E. coli JM109를 발현 균주로 사용했을 때에는 전체적인 재조합 인간 인터페론 베타의 발현량이 E. coli XL1-blue를 발현 균주로 사용했을 때에 비해 다소 증가하였음을 확인할 수 있었다.
75%로 각각 증가하였다. 따라서 G+C 함량은 야생형이 40.32%였으나 코돈 최적화된 인간 인터페론 베타 유전자의 경우엔 46.91%로 증가하였다.
coli HMS174 (DE3)에 개발된 4가지의 발현 벡터를 각각 도입한 경우에도 발현 결과 재조합 인간 인터페론 베타의 예상 위치에 단백질의 발현을 전혀 확인 할 수 없었다. 따라서 재조합 대장균에서 효과적으로 인간 인터페론 베타를 발현하기 위한 야생형 유전자와 코돈 최적화된 유전자의 차이를 확인할 수 없었으며, 또한 벡터의 종류(pET-15b와 pET-21a)와 6 his tag의 유무에 따른 차이도 확인할 수 없었다.
Insoluble 형태로 발현되는 재조합 인간 인터페론 베타를 재접힘 (re-folding) 방법을 이용하여 soluble 형태로 생산하고자 하는 방법 또한 시도되고 있다 [1]. 본 연구를 통해 강력한 프로모터를 가지고 있는pET-15b와 pET21a 벡터에서는 재조합 인간 인터페론 베타의 발현을 확인하지 못하였고 오히려 상대적으로 약한 프로모터를 가지고 있는 pQE30 벡터에서 재조합 인간 인터페론 베타의 발현을 확인하였다. 발현 조건 최적화를 통해 soluble 형태의 재조합 인간 인터페론 베타의 발현을 증가시키기 위한 연구 또는 재접힘 방법을 통한 insoluble 형태의 재조합 인간 인터페론 베타를 soluble 형태로 전환하기 위한 연구가 추가로 진행되어야 할 것으로 예상된다.
실험 결과 Fig. 2의 SDS-PAGE 결과와 같이 pET-15b 발현용 벡터를 이용하여 개발된 발현 벡터 (pET15b-hIFNβW, pET15b-hIFNβO)와 pET-21a 발현용 벡터를 이용하여 개발된 발현 벡터 (pET21a-hIFNβW, pET21a-hIFNβO)를 E. coli BL21(DE3)에 도입하여 IPTG를 이용하여 발현한 결과 재조합 인간 인터페론 베타의 발현이 전혀 확인되지 않았다.
코돈 최적화된 인간 인터페론 베타 유전자를 이용한 pQE30-hIFNβO 발현 벡터의 경우 야생형 인간 인터페론 베타 유전자를 이용한pQE30-hIFNβW 발현 벡터의 경우에 비해 발현 정도가 약간 증가하였음을 확인할 수 있었다.
1). 코돈 최적화로 인해 아데닌 (adenine)의 함량이 28.14%에서 29.54%로 증가하였고 티민 (thymine)의 함량이 31.54%에서 23.55%로 크게 감소하였으며 구아닌 (guanine)과 시토신 (cytosine)의 함량이 20.16%과 20.16%에서 24.15%과 22.75%로 각각 증가하였다. 따라서 G+C 함량은 야생형이 40.
코돈 최적화된 인간 인터페론 베타 유전자를 이용한 pQE30-hIFNβO 발현 벡터의 경우 야생형 인간 인터페론 베타 유전자를 이용한pQE30-hIFNβW 발현 벡터의 경우에 비해 발현 정도가 약간 증가하였음을 확인할 수 있었다. 하지만 야생형 유전자와 코돈 최적화된 인간 인터페론 베타 유전자를 이용한 경우 모두에서 soluble 형태의 인간 인터페론 베타의 발현은 거의 확인할 수 없었으며 대부분이 insoluble 형태로 발현이 되었음을 확인할 수 있었다.
또한 단백질 발현 시에 misfolding 또는 inclusion body 형성을 방지하기 위해 17번째 아미노산인 cysteine은 serine으로 치환하여 주었다 [15-17]. 합성된 야생형의 인간 인터페론 베타 유전자와 코돈 최적화된 인간 인터페론 베타 유전자의 염기서열을 비교한 결과, 코돈 최적화된 인간 인터페론 베타 유전자는 야생형 인간 인터페론 베타 유전자와 비교했을 때 55개의 염기서열이 변화하여 결과적으로 89%의 상동성을 나타내었다 (Fig. 1). 코돈 최적화로 인해 아데닌 (adenine)의 함량이 28.

후속연구

본 연구를 통해 강력한 프로모터를 가지고 있는pET-15b와 pET21a 벡터에서는 재조합 인간 인터페론 베타의 발현을 확인하지 못하였고 오히려 상대적으로 약한 프로모터를 가지고 있는 pQE30 벡터에서 재조합 인간 인터페론 베타의 발현을 확인하였다. 발현 조건 최적화를 통해 soluble 형태의 재조합 인간 인터페론 베타의 발현을 증가시키기 위한 연구 또는 재접힘 방법을 통한 insoluble 형태의 재조합 인간 인터페론 베타를 soluble 형태로 전환하기 위한 연구가 추가로 진행되어야 할 것으로 예상된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	다발성 경화증의 증상은 무엇인가?	다발성경화증의 발생 원인은 아직까지 정확한 이론으로 설명할 수는 없으나 일반적으로 유전적인 소인이 있는 사람에게서 환경적 요인이 복합적으로 작용함으로써 발생한다고 생각된다 [2]. 다발성 경화증의 증상은 주로 감각장애, 통증, 운동마비, 시각장애가 있다. 다발성경화증의 치료제로는 스테로이드와 면역억제제가 주로 사용되고 있으며, 이는 신체의 면역 기능을 약화시킴으로써 다발성경화증을 조절하는 방법이다 [3-5].
	다발성경화증이란 무엇인가?	다발성경화증 (multiple sclerosis)은 중추신경계가 다발성으로 침윤되는 염증성 질환 또는 면역체계 이상으로 발생되는 질병을 말한다 [1]. 다발성경화증은 보통 20~40대에 발생하며 여자가 남자보다 2배 정도 높은 발병률을 보이며 미국에서는 다발성경화증으로 인해 많은 사회경제적인 손실이 초래되고 있다고 한다.
	가장 많이 사용되는 다발성경화증의 치료제의 특징은 무엇인가?	현재 많이 사용되는 다발성경화증의 치료제로는 인터페론 베타 (interferon β)가 있다 [6, 7]. 인터페론 베타는 항염증 작용으로 인해 염증작용을 감소시켜 다발성경화증에서 보이는 비정상적인 면역작용을 조절하고, 바이러스 감염에 대항하여 혈액뇌장벽 (BBB; blood brain barrier)의 손상을 부분적으로 예방한다 [8,9]. 인터페론 베타는 거의 모든 종류의 세포에서 생산되며. 그 중 CHO(Chinese hamster ovary) 세포를 이용하여 생산되는 인터페론 베타 1a와 Escherichia coli에서 생산되는 인터페론 베타 1b가 있다 [2,10-12]. 1993년 최초로 Interferon β-1b (Betaferon®)가다발성경화증 치료제로 미국 FDA 인증을 받은 이후, 두 가지 다른 Interferon β-1a (Rebif®와 Avonex®)가 연이어 개발되어 치료에 이용되기 시작했으며, 이들 인터페론 베타 제품은 좋은 관용성 (tolerability)과 장기적인 안정성을 보여 다발성경화증의 주요 치료제로 사용되고 있다 [6,7,13,14]. 인터페론 베타를 구성하는 166개의 아미노산 중 17번째, 31번째 그리고 141번째 위치에 cysteine 잔기가 존재한다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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