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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 염소계 살균제를 대체하기 위한 새로운 천연 비가열처리 방법으로 식품 가공 부산물의 활용 가능성을 검토하고자, 흑마늘박추출물의 주요 병원성 미생물(Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, E. coli O157:H7, Salmonella Typhimurium)에 대한 항균 효과를 확인하고, 시금치에 세척 적용함으로써 저장 중 미생물 제어 효과를 분석하였다.
- 본 연구에서는 흑마늘 진액 가공 후 발생하는 흑마늘박의 활용 가능성을 검토하고자 흑마늘박 추출물의 항균성과 시금치에 대한 세척 적용 효과를 분석하였다. 흑마늘박 추출물은 주요 병원성 미생물인 L.
제안 방법
- 25% 메탄올에 흑마늘박 추출물을 0.25%가 되도록 첨가하고, 0.2 μm WhatmanTM syringe filter(PVDF filter, GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA, USA)로 2회 여과하여 시료를 준비하였다.
- 흑마늘박 추출물의 항균 활성 분석은 disc diffusion test방법을 사용하여 측정하였다. 5~6 log CFU/mL의 균 농도로 준비된 L. monocytogenes, S. aureus, E. coli O157: H7, S. Typhimurium cocktail culture를 멸균 면봉을 이용하여 muller-hinton agar(MHA, Difco Co.)에 각각 도말하였다. 멸균된 paper disc(8 mm, Toyo Roshi Kasha Ltd.
- DPPH assay는 0.1 mM로 제조된 DPPH 용액 0.95 mL에 0.05 mL의 농도별 흑마늘박 추출물(1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 mg/mL)을 첨가한 후 암소에서 30분 동안 반응시킨 다음 UV spectrophotometer를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였고, 추출물 첨가구와 비첨가구의 흡광도 차이를 백분율(%)로 계산하여 나타내었다.
- 각 세척 처리된 시금치 시료는 lowdensity polyethylene film bag(18 cm×20 cm)에 포장한 뒤 4±1°C에서 9일 동안 저장하면서 미생물 수 및 품질 변화를 측정하였다.
- 건조된 disc를 각 병원성 미생물(cocktail culture)이 도말된 MHA 배지에 올리고 37°C에서 24시간 배양 후 형성된 inhibition zone의 크기를 측정하여 항균 활성을 측정하였으며, inhibition zone은 mm로 표시하였다.
- )를 사용하여 각각 37°C와 25°C에서 2~3일간 배양한 후 형성된 colony를 계수하였다. 검출된 각 미생물 수는 시료 g당 log colony forming unit(CFU)으로 표현하였고, 3회 반복 실험하였다.
- 5% 흑마늘박 추출물을 준비하여 5분 동안 시금치 시료를 침지 세척한 후 bio-safety clean bench에서 30분간 건조하여 표면에 남아있는 여분의 수분을 제거하였다. 또한, 흑마늘박 추출물의 세척 효과를 비교하기 위해 동일한 조건에서 단순 물 세척 처리를 한 후 미생물 수를 비교 분석하였다. 각 세척 처리된 시금치 시료는 lowdensity polyethylene film bag(18 cm×20 cm)에 포장한 뒤 4±1°C에서 9일 동안 저장하면서 미생물 수 및 품질 변화를 측정하였다.
- 멸균된 paper disc(8 mm, Toyo Roshi Kasha Ltd., Tokyo, Japan)에 흑마늘박 추출물이 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 mg/disc가 되도록 분주하고 clean bench에서 30분간 건조하였다.
- 미생물 수 측정을 위해 준비된 희석 용액을 각각의 배지에 0.1 mL씩 분주하여 실험하였으며, 총 호기성 세균의 검출은 plate count agar(PCA, Difco Co.)를 사용하였고, 효모 및 곰팡이는 potato dextrose agar(PDA, Difco Co.)를 사용하여 각각 37°C와 25°C에서 2~3일간 배양한 후 형성된 colony를 계수하였다.
- 세척 후 동일한 volume의 멸균 펩톤수를 각 strain culture에 혼합하여 각 병원성 미생물의 cocktail culture를 제조하였으며, 항균 효과 분석 실험 전 최종적인 균 농도가 105 ~106 CFU/mL가 되도록 희석하여 사용하였다.
- 시금치 시료(10 g)와 0.1% 멸균 펩톤수(90 mL)를 멸균 bag에 넣은 후 균질기(MIX 2 Stomacher, AES Laboratoire, Combourg, France)를 이용하여 3분간 균질시켰다. 균질된 각 시료는 펩톤수(0.
- 시금치에 0.5% 흑마늘박 추출물을 처리한 후 4±1°C에서 9일 동안 저장하면서 미생물 수 변화를 측정하였다.
- 시금치의 저장 중 표면 색도는 Minolta Chroma Meter CR-400 색차계(Konica Minolta Sensing Inc., Tokyo, Japan)를 사용하여 측정하였으며, 시료의 각각 다른 표면을 10회 이상 반복 측정한 뒤 Hunter L, a, b 값을 평균값으로 나타내었다.
- 예비 실험을 통해 시금치 시료에 대한 흑마늘박 추출물의 세척 농도를 0.5%로 선정하였고, 시료와 세척 용액의 비율이 1:10(w:v)이 되도록 0.5% 흑마늘박 추출물을 준비하여 5분 동안 시금치 시료를 침지 세척한 후 bio-safety clean bench에서 30분간 건조하여 표면에 남아있는 여분의 수분을 제거하였다.
- 이에 따라 본 연구에서도 HPLC 분석을 통해 흑마늘박 추출물의 항균성을 나타내는 주요 성분을 분석하였다.
- , Osaka, Japan)로 분쇄 하였다. 흑마늘박 추출물 제조를 위한 예비 실험으로 물, 에탄올, 메탄올을 이용하여 추출을 진행한 후 수율, 항산화 활성, 총 페놀 함량 등을 비교 평가한 다음 80% 메탄올을 최적 추출 용매로 선정하여(data not shown), 흑마늘박(100 g)을 2 L 메탄올에 혼합하여(1:20; w:v) 3시간 동안 상온에서 교반 추출하였다. 흑마늘박 추출물은 감압 여과 및 농축하여 10%의 농축 추출물로 준비하였으며, 각 실험에 사용하기 전 희석하여 사용하였다.
- 흑마늘박 추출물 처리 후 시금치의 색도 품질 변화를 확인하기 위하여 저장 9일 동안 Hunter 색도 값(L, a, b)과 총색차(ΔE) 변화를 측정하였다(Table 4).
- 흑마늘박 추출물의 신선 농산물에 대한 세척 적용 효과를 확인하기 위하여 시금치 시료에 0.5% 흑마늘박 추출물을 처리한 후 저장 중 총 호기성 세균과 효모 및 곰팡이 수를 측정하였다(Table 2, 3).
- 흑마늘박 추출물의 주요 성분 분석을 위해 S-allyl-cysteine 및 3종류의 phenolic compounds(gallic acid, caffeic acid, hydroxybenzoic acid)를 표준물질로 사용하여 HPLC 분석을 하였다(Fig. 2).
- 흑마늘박 추출물의 항균 효과 분석을 위해 E. coli O157: H7(ATCC 43889, NCTC 12079), S. Typhimurium(ATCC 14028, KCTC 2421), L. monocytogenes(ATCC 19111, 19115), S. aureus(ATCC 10537, KCTC 1621)를 사용하였다.
- 흑마늘박 추출물의 항산화 및 항균 활성을 나타내는 성분 분석을 위해 HPLC(Waters 2695, Waters Inc., Milford, CT, USA)를 사용하였다.
- 흑마늘박의 총 페놀 함량은 Folin-Ciocalteu’s phenol 방법으로 측정하였다(20). 흑마늘박을 1:20 비율로 80% 메탄올에 혼합하고 흑마늘박 추출물 제조와 동일하게 3시간 동안 추출한 후 30분간 정치하였다. 추출 용액 100 μL를 1.
- , Kyoto, Japan)를 사용하여 765 nm에서 흡광도를 측정하였다. 흑마늘박의 총 페놀 함량 계산을 위해 gallic acid를 표준물질로 이용하였고, mg gallic acid equivalent(GAE)/g dry weight로 표현하였다.
- 흑마늘박의 총 페놀 함량과 흑마늘박 추출물의 농도별 항산화 활성 변화를 분석하였다. 건조 흑마늘박의 총 페놀 함량은 4.
대상 데이터
- ABTS assay 수행을 위해 7 mM ABTS와 2.45 mM potassium persulfate를 혼합하여 제조된 ABTS radical cation 용액을 734 nm에서 흡광도가 0.7이 되도록 희석하여 준비하였다.
- 본 연구에서 사용된 흑마늘박(black garlic pomace)은 흑마늘 진액 추출 후 버려지는 가공 부산물(껍질 포함)로 경상북도 의성군 의성농산영농조합에서 생산, 가공된 것이었고, 흑마늘박 추출물(black garlic pomace extract, BGPE)의 세척 적용 연구에 사용한 시금치는 전라북도 장수군에서 당일 수확된 것으로 신선하고, 크기가 균일한 것을 선별하여 실험에 사용하였다.
- 용매 A(0.1% formic acid in water)와 용매 B(0.1% formic acid in acetonitrile)를 이동상으로 사용하였으며, 85% 용매 A와 15% 용매 B를 0.5 mL/min의 유속 조건에서 15분 동안 등용매 용리하여 분석하였다.
- 표준물질로 S-allyl-cysteine, gallic acid, caffeic acid, hydroxybenzoic acid(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)를 사용하였다.
- 흑마늘박 추출물은 감압 여과 및 농축하여 10%의 농축 추출물로 준비하였으며, 각 실험에 사용하기 전 희석하여 사용하였다.
데이터처리
- 2)Any means in the column (a-e) followed by different letters are significantly (P<0.05) different by Duncan’s multiple range test.
- 2)Any means in the same column (A,B) or same row (a-c) followed by different letters are significantly (P<0.05) different by Duncan’s multiple range test.
- 2)Any means in the same column (A-C) or same row (a-c) followed by different letters are not significantly (P<0.05) different by Duncan’s multiple range test.
- 2)Any means in the same column (A-C) or same row (a-d) followed by different letters are not significantly (P<0.05) different by Duncan’s multiple range test.
- 모든 실험 결과는 평균±표준편차로 나타내었으며, P<0.05 수준에서 Duncan’s multiple range test로 평균값의 검정을 실시하였다.
- 본 연구에서 수행된 모든 실험은 3회 이상 반복 수행하였고, 대조구와 처리구 간의 유의성 검증은 SAS version 9.4(Statistical Analysis System, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)를 이용하여 분산분석(analysis of variance)을 수행하였다.
이론/모형
- 또한, 저장 중 시금치 표면의 총색차(ΔE)를 확인하기 위하여 Kang 등(20)의 계산식을 이용하여 값을 계산하였다.
- 흑마늘박 추출물의 항균 활성 분석은 disc diffusion test방법을 사용하여 측정하였다. 5~6 log CFU/mL의 균 농도로 준비된 L.
- 흑마늘박 추출물의 항산화 활성은 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl(DPPH) 라디칼 소거 활성과 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)(ABTS) 라디칼 소거 활성 방법을 사용하여 측정하였다.
- 흑마늘박의 총 페놀 함량은 Folin-Ciocalteu’s phenol 방법으로 측정하였다(20).
성능/효과
- 0~20 mg 농도 범위에서는 4종류의 병원성 미생물 모두에서 항균 효과가 나타나지 않았으나, 25 mg부터 L. monocytogenes와 S. aureus 에서 inhibition zone이 측정되었고, E. coli O157:H7과 S. Typhimurium의 경우에는 30 mg부터 측정이 가능하였다.
- 1 mg/mL 흑마늘박 추출물의 DPPH, ABTS 라디칼 소거 활성은 각각 20.33, 12.85%로 흑마늘 추출물의 65.93, 49.48%에 비하여 낮은 활성을 나타내었는데, 이는 앞선 선행 연구 결과(21)에서도 확인하였듯이 흑마늘 자체의 총 페놀 함량이 흑마늘박보다 두 배 이상 높게 나타난 것과 일치하는 결과라고 생각된다.
- ABTS 라디칼 소거 활성도 DPPH 결과와 동일한 양상을 보였는데, 10 mg/mL에서 약 80%의 활성을 보였고, 20 mg/mL 이상에서 98%의 활성이 유지되었다.
- Disc diffusion test 결과, 흑마늘박 추출물은 실험에 사용된 모든 병원성 미생물에 대해 항균성을 보이는 것으로 확인되었다.
- 그러나 본 연구 결과를 통해 5 mg/mL(0.5%) 이상의 흑마늘박 추출물은 흑마늘 및 마늘 껍질 추출물과 같이 항산화 활성(DPPH: 60.88%, ABTS: 51.55%)을 나타낼 수 있기에 충분한 활용 가치가 있다고 판단된다.
- 따라서 흑마늘박 추출물의 항균 활성은 S-allyl-cysteine이 아닌 phenolic compounds에 의한 것으로 판단되는데, HPLC 분석 결과를 통해 흑마늘박 추출물에는 gallic acid를 포함한 5종류의 phenolic compounds로 예측되는 성분이 있다는 것이 확인되었다(Fig. 2).
- 12 log CFU/g 감소시켰다. 또한, 흑마늘박 추출물 처리는 저장 9일 동안 시금치의 Hunter 색도 값 및 총색차 값을 저장 초기와 유의적인 차이 없이 지속시켰기에 색도 품질 유지 측면에서 단순 물 세척 처리구보다 더 효과적이라고 판단된다. 따라서 본 연구 결과를 통해 흑마늘박 추출물은 병원성 미생물에 대해 높은 항균성을 가지면서 동시에 시금치와 같은 신선 농산물의 미생물 제어를 위한 효과적인 세척 처리 물질로써 활용될 수 있다고 판단된다.
- 반면에 흑마늘박 추출물 처리구의 Hunter 색도 값은 저장 9일 동안 초기와 동일하게 유지되어 색도 품질 유지 측면에서 단순 물 세척 처리보다 효과적임을 나타내었다.
- 이러한 결과들로부터 본 연구에서 적용된 흑마늘박추출물 처리가 단순 물 세척 처리와 비교하여 시금치의 색도 품질을 더욱 잘 유지할 수 있는 세척 처리 방법이라고 판단 된다.
- Poimenidou 등(13)은 시금치와 상추에 다양한 세척 처리(물, 유기산, 차아염소산 나트륨, 정유) 후 7일 동안 저장하였을 때 단순 물 세척 처리를 제외하고는 모두 미생물 제어 효과가 유지되었다고 보고하였고, Kang 등(32)도 치콘에 이산화염소수와 단순 물 세척 처리 후 11일 동안 저장 실험한 결과, 이산화염소수의 미생물 제어 효과가 저장 초기와 유사하게 지속된 반면에 단순물 세척 처리의 효과는 오히려 감소하는 경향을 나타냈다고 보고하였다. 이러한 결과로부터 흑마늘박 추출물 처리가 단순 물 세척 처리보다는 매우 효과적이며, 농산물의 미생물 제어를 위해 기존 연구된 다양한 비가열처리와 유사한 효과를 가진다고 판단된다.
- 이와는 대조적으로 0.5% 흑마늘박 추출물 세척 처리구의 경우 단순 물 세척 처리구보다 총 호기성 세균과 효모 및 곰팡이 수가 각각 0.77, 0.68 log CFU/g만큼 더 감소한 4.81, 3.74 log CFU/g의 미생물 수를 보였다(Table 2, 3).
- 저장 중에 L 값과 a 값도 대조구와 세척 처리구 간의 큰 유의적인 차이는 보이지 않았으나, 대조구와 단순 물 세척 처리구에서는 다소 변화를 나타내어 상대적으로 L 값은 감소하고 a 값은 증가하였다.
- 5% 흑마늘박 추출물을 처리한 후 저장 중 총 호기성 세균과 효모 및 곰팡이 수를 측정하였다(Table 2, 3). 저장 초기 대조구 시금치의 총 호기성 세균 수는 6.04 log CFU/g이었고, 효모 및 곰팡이 수는 4.72 log CFU/g이었다. 단순 물 세척 처리구의 경우에는 각각 5.
- 특히 50%와 100% 메탄올을 용매로 추출하였을 때 가장 많은 25, 22 mg GAE/g의 총 페놀이 마늘 껍질로부터 추출 되었는데, 본 연구에서도 80% 메탄올을 사용함으로써 높은 함량의 페놀이 추출된 것으로 판단된다.
- 5% 흑마늘박 추출물을 처리한 후 4±1°C에서 9일 동안 저장하면서 미생물 수 변화를 측정하였다. 흑마늘박 추출물 처리는 대조구와 비교하여 저장 9일 동안 시금치의 총 호기성 세균 수를 1.23~1.35 log CFU/g, 효모 및 곰팡이 수는 0.82~1.12 log CFU/g 감소시켰다. 또한, 흑마늘박 추출물 처리는 저장 9일 동안 시금치의 Hunter 색도 값 및 총색차 값을 저장 초기와 유의적인 차이 없이 지속시켰기에 색도 품질 유지 측면에서 단순 물 세척 처리구보다 더 효과적이라고 판단된다.
- 흑마늘박 추출물 처리의 미생물 수 감소 효과는 저장 중에도 지속되었는데, 저장 9일 후 대조구 시료의 총 호기성 세균과 효모 및 곰팡이 수가 각각 6.65, 5.36 log CFU/g이지만, 흑마늘박 추출물 처리구는 각각 5.30, 4.54 log CFU/g으로 대조구와 비교하여 1.35, 0.78 log CFU/g의 미생물 수 감소를 나타내었다. 그러나 단순 물 세척 처리구의 미생물 수는 대조구와 비교하였을 때 흑마늘박 추출물 처리보다 유의적으로 큰 차이를 보이지 않아 저장 중에 오히려 초기 제어 수준을 유지하지 못함을 보였다.
- 본 연구에서는 흑마늘 진액 가공 후 발생하는 흑마늘박의 활용 가능성을 검토하고자 흑마늘박 추출물의 항균성과 시금치에 대한 세척 적용 효과를 분석하였다. 흑마늘박 추출물은 주요 병원성 미생물인 L. monocytogenes, S. aureus, E. coli O157:H7, S. Typhimurium에 대해 모두 항균성을 나타냈으며, 특히 그람 양성균인 L. monocytogenes와 S. aureus에 더 효과적으로 작용하였다. 시금치에 0.
- 흑마늘박 추출물의 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거 활성을 분석한 결과(Fig. 1), 0~3 mg/mL 농도 범위에서 DPPH 라디칼 소거 활성은 0~38.21%였으며, 5 mg/mL부터 많이 증가하여 20 mg/mL까지 60.88~82.90%를 나타낸 후 50 mg/mL까지 유지되었다.
후속연구
- 또한, 흑마늘박 추출물 처리는 저장 9일 동안 시금치의 Hunter 색도 값 및 총색차 값을 저장 초기와 유의적인 차이 없이 지속시켰기에 색도 품질 유지 측면에서 단순 물 세척 처리구보다 더 효과적이라고 판단된다. 따라서 본 연구 결과를 통해 흑마늘박 추출물은 병원성 미생물에 대해 높은 항균성을 가지면서 동시에 시금치와 같은 신선 농산물의 미생물 제어를 위한 효과적인 세척 처리 물질로써 활용될 수 있다고 판단된다.
- 2). 본 연구 결과 흑마늘박 추출물의 항균성은 gallic acid를 포함한 다양한 phenolic compounds의 복합적 작용에 의한 것이라고 생각되며, 추후 각 성분의 동정에 관한 추가적인 연구가 필요하다고 판단된다. Phenolic compounds의 항균성은 phenolic compounds 분자에 존재하는 수산기가 미생물 세포막에 결합하여 막 구조를 붕괴하고, 이로 인해 미생물 세포 내 주요 성분들의 용출을 야기하기 때문인 것으로 알려져 있다(15).
- Typhimurium 모두에 항균성을 보인 것으로 생각된다. 이러한 결과로부터 대부분 버려지는 흑마늘박 추출물은 천연 항균제로서 농산물의 미생물학적 안전성을 확보하기 위한 세척제로 활용될 수 있다고 판단된다.
- 이러한 유기산 및 식물 추출물의 다른 농산물들에 대한 유사한 처리 효과는 흑마늘박 추출물이 시금치가 아닌 다른 농산물에 적용되어도 비슷한 미생물 수 감소 효과를 발휘할 수 있다는 것을 보여주는 결과라고 생각되며, 본 연구에서 적용된 흑마늘박추출물이 농산물의 미생물학적 안전성을 제고하는 데 활용될 수 있다고 판단된다.
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