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문제 정의
- 마늘껍질의 생리활성에 대한 연구보고에 따르면, 마늘껍질에는 마늘 육질보다 식이섬유의 함량이 4배, 총 페놀 함량이 7배가량 높다고 보고하였다(11). 이에 본 연구에서는 마늘껍질의 70% 에탄올 추출물의 인간 암 세포에 대한 증식 억제 활성을 연구하여 버려지는 마늘껍질의 가치를 확인함으로써 마늘껍질을 기능성식품이나 의약품 재료로의 재활용방안을 모색하고자 하였다.
제안 방법
- 70% 에탄올이 추출용매로 이용되었다. 70% 에탄올 추출물은 시료 무게의 10배용매를 가하여 실온에서 교반하면서 24시간 동안 추출하였고, 같은 작업을 3번 반복하였다. 얻어진 추출액은 Whatman1번을 이용하여 여과하였고 회전감압농축기(N-1000, Eyela,Tokyo, Japan)를 이용해 농축한 후, 20℃ 냉동고에서 보관하여 시료로 사용하였다.
- 각각의 세포는 10%fetal bovine serum(FBS)와 100 U/mL penicillin G, 100 μg/mLstreptomycin을 첨가한 RPMI 1640과 DMEM, EMEM medium을 사용하여 5% CO2, 37℃ 조건 배양기에서 배양하였다.
- 마늘껍질 70% 에탄올 추출물(GPE)의 정상세포에 대한 독성을 측정하기 위해 인체 신장유래 정상세포(HEK 293)를 사용하였고, 시료는 농도 100-2,000 μg/mL 범위에서 독성 여부를 측정하였다.
- 버려지는 마늘껍질의 자원으로써의 활용 가치를 확인하기 위해 마늘껍질 70% 에탄올 추출물(GPE)을 이용하여 인체에서 유래된 폐암 세포(A549), 위암 세포(AGS), 유방암 세포(MCF-7), 간암 세포(Hep3B) 및 대장암 세포(HT-29)의 생존율에 미치는 영향을 확인하였다.
- 인체에서 유래된 폐암 세포(A549), 위암 세포(AGS), 유세포생존율(%)=(방암 세포(MCF-7), 간암 세포(Hep3B) 및 대장암 세포(HT-29)를 이용하여 GPE가 각각의 암세포생존율에 미치는 영향을 확인하기 위해 MTT assay를 이용하여 암세포에 대한 성장 억제 활성을 측정하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 마늘껍질은 경남 창녕군 마늘공장에서 수거하였으며, 수거된 마늘껍질은 불순물과 분리 후 세척, 자연 건조하여 추출에 사용하였다. 70% 에탄올이 추출용매로 이용되었다.
- 본 실험에서 사용한 암 세포주는 인체유래 폐암 세포 A549, 위암 세포 AGS, 유방암 세포 MCF-7, 간세포 Hep3B 및 대장암 세포 HT-29를 사용하였고, 정상 세포주는 인체유래 신장 세포인 HEK293을 사용하였다. 각각의 세포는 10%fetal bovine serum(FBS)와 100 U/mL penicillin G, 100 μg/mLstreptomycin을 첨가한 RPMI 1640과 DMEM, EMEM medium을 사용하여 5% CO2, 37℃ 조건 배양기에서 배양하였다.
데이터처리
- 모든 데이터는 3회 반복 측정하였으며, 평균(mean)±표준편차(SD)로 표시하였다.
- 실험 군 간의 통계학적 분석은 SPSS(Ver. 18.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 ANOVA 분석을 시행하였고, 유의차가 있는 항목에 대해서는 신뢰구간 p<0.05에서 Duncan's multiple range test를 실시하였다.
이론/모형
- Cells were treated with GPE (100-2,000 μg/mL) for 24 hr. Cell viability was determined by MTT assay. Mean±standard deviation from three independent experiments are shown.
- 추출물의 정상세포 및 암세포에 대한 독성은 Young 등(12)의 방법에 따라 MTT assay로 확인하였다. 각 세포주를 96 well plate에 1×104 cells/well 분주하고 24시간 동안 배양(37℃, 5% CO2)한 후, 전 배양에 사용된 배지를 제거하고 배지에 각각의 시료 농도로 처리하여 48시간 배양하였다.
성능/효과
- 100 μg/mL 농도 처리에서는 HT-29 세포에 대한 증식 억제 효과가 확인되지 않았으며, 200 μg/mL의 저 농도 처리에 15%, 500 μg/mL 농도 처리에서 85%,1,000 μg/mL의 고농도 처리에서 93%의 대장암 세포 증식억제율을 확인하였으며, 조사된 1,000 μg/mL 농도까지 농도 의존적으로 대장암 세포에 대한 생장 억제 효과가 있는것으로 확인되었고, 1,000 μg/mL 이상의 농도 처리에서는 농도에 따른 유의적 차이가 없는 것으로 확인되었다.
- 500 μg/mL 이상의 농도 처리 결과에서는 모두 90% 전후의 유방암 세포 억제율을 확인하였으며 농도에 따른 유의적 차이는 없는 것으로 확인되었다.
- Lim(18)이 보고한 흑태, 서목태 및 서리태 메탄올 추출물이 1,000 μg/mL의 상대적으로 높은 농도에서 51%, 59% 및 52%의 증식 억제 효과를 확인한 반면, 본 연구에서 조사된 GPE는 100 μg/mL의 저 농도에서 57%의 높은 생존 억제 효과가 확인되어 GPE가 다른 암세포보다 특히 간암 세포에 대한 증식 억제 효과가 탁월함을 확인하였다.
- 간암 세포의 경우 100 μg/mL의 저 농도에서도 57%의 억제 활성이 확인되어, GPE의 매우 우수한 간암 세포 증식억제 활성이 확인되었고, 처리되는 GPE의 농도가 증가함에 따라 500 μg/mL 농도까지 농도 의존적으로 간암 세포에 대한 증식 억제 활성은 증가되어 간암 세포의 생존율이 13%까지 저하되었다.
- 그 결과, GPE는 조사된 모든 농도에서 100% 이상의 높은 세포 생존율이 확인되어 조사된 시료농도 100-2,000 μg/mL 범위에서 마늘껍질 70% 에탄올 추출물은 정상세포에 독성이 없음을 확인하였다(Fig. 1).
- 대장암 세포(HT-29)의 경우 200 μg/mL의 저 농도 처리에서 15%, 500 μg/mL 농도 처리에서 85%, 1,000 μg/mL의 고농도 처리에서 93%의 간암세포 증식 억제율이 확인되었으며, 농도 의존적으로 간암 세포에 대한 생장 억제 효과가있는 것으로 확인되었다.
- 마늘껍질 70% 에탄올 추출물이 100 μg/mL의 저 농도에서 다른 암세포의 증식을 억제하지 못한 반면, 간암 세포의 경우 100 μg/mL의 저 농도 처리에서도 57%의 억제율이 확인되어, GPE의 매우 우수한 간암 세포 증식 억제 활성이 확인되었다.
- 본 연구의 결과를 통해 마늘 가공 과정에서 쓰레기로 버려지고 있는 마늘껍질은 70% 에탄올 추출을 통해 유방암(MCF-7), 폐암(A549), 위암(AGS), 유방암(MCF-7) 및 간암(Hep3B) 세포의 성장을 억제하는 활성 물질로서의 재활용가치가 높은 것으로 확인되었다.
- 위암 세포에 대한 조사에서는 1,000 μg/mL의 농도에서 55%의 생존율을 확인할 수 있었고, 최고 2,000 μg/mL의 농도에서 71%의 위암 세포 증식 억제활성이 확인되었다.
- 위암세포에 대한 GPE의 성장 억제 활성은 500 μg/mL 농도까지100% 세포 생존율이 확인되어 증식 억제 효과가 없는 것으로 확인되었으며, 1,000 μg/mL의 농도에서 45%의 증식 억제율을 확인할 수 있었고, 최고 처리 농도 2,000 μg/mL에서 71%의 억제율을 확인하였다.
- 3%의 높은 증식억제 활성을 보고하였다. 유방암 세포 MCF-7에 대한 GPE의 증식 억제 활성은 폐암세포(A549)나 위암세포(AGS)에대한 억제 활성보다 훨씬 우수한 것으로 확인되었다(Fig.2C). 조사된 제일 낮은 농도인 100 μg/mL 농도에서는 GPE가 유방암 세포의 증식을 억제하는 효과를 확인할 수 없었으나 200 μg/mL의 저 농도에서 78%의 유방암 세포 억제율이 확인되어 매우 우수한 유방암 세포 증식 억제 효과가 있는 것이 확인되었다.
- 유방암 세포(MCF-7)의 경우 200 μg/mL의 저 농도에서 78%, 500 μg/mL 이상의 농도 처리 결과에서는 모두 90% 전후의 유방암 세포 증식 억제활성이 확인되었다.
- 이들 결과와 비교할 때 500 μg/mL 농도에서 10% 이하의 폐암세포 생존율을 확인한 마늘껍질 에탄올 추출물은 폐암 세포에 대한 성장 억제 활성이 매우 우수한 것으로 확인되었다.
- 또한 콩 종류별로 암세포 증식 억제 효과를 비교한 Lim(18)은 콩 메탄올 추출물이 1,000 μg/mL 농도에서 50% 이상의 암세포 증식 억제 효과가 있다고 보고하였다. 이들 결과와 비교할 때 마늘껍질 70% 에탄올 추출물은 상대적으로 높은 위암세포 증식 억제 활성이 있는 것으로 확인되었다.
- 이상의 결과를 종합해 볼 때 마늘껍질 70% 에탄올 추출물 GPE는 조사된 제일 낮은 농도(100 μg/mL)에서도 간암세포의 증식을 57% 억제하는 우수한 활성이 확인되었고, 200 μg/mL의 저 농도 범위에서는 유방암과 간암 세포의 증식을 72-78% 억제하는 높은 활성이 확인되었으며, 500μg/mL 이상의 농도에서는 위암 세포를 제외한 조사된 4종류의 암세포(폐암, 유방암, 간암 및 대장암 세포)의 증식을 85-90% 억제하는 우수한 활성이 확인되었다.
- 조사된 제일 낮은 농도인 100 μg/mL 농도에서는 GPE가 유방암 세포의 증식을 억제하는 효과를 확인할 수 없었으나 200 μg/mL의 저 농도에서 78%의 유방암 세포 억제율이 확인되어 매우 우수한 유방암 세포 증식 억제 효과가 있는 것이 확인되었다.
- 처리되는 GPE의 농도가 증가함에 따라 500 μg/mL 농도까지 농도의존적으로 간암 세포에 대한 증식 억제 활성은 증가되어간암 세포의 생존율이 13%까지 저하되었으며, 500 μg/mL이상의 농도에서는 처리 농도에 따른 유의적 차이는 없는 것으로 확인되었다.
- 폐암 세포(A549)에 대한 성장 억제 활성 측정 결과, 200μg/mL까지의 저 농도 처리에서는 A549 세포의 생존율이 100%로 증식 억제 효과가 나타나지 않았다(Fig. 2A).
- 폐암 세포(A549)의 경우 200 μg/mL의 저 농도에서는 A549 세포의 생존율이 100%로 증식 억제 효과가 나타나지 않았으나 500 μg/mL 이상의 농도에서는 A549 세포의 생존율이 10% 이하로 떨어지면서 우수한 폐암 세포 증식 억제활성이 확인되었다.
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