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문제 정의
- 저자들은 좌금환과 수련환의 항균, 항산화, 미백 활성에 관한 연구를 시행하여 좌금환의 Candida albicans, Staphylococcus aureus에 대한 항균 능력, 항산화 및 미백 효과, 그리고 수련환의 상기한 두 가지 균주에 대한 항균 능력과 항산화 작용 활성에 대해 유의성 있는 결과를 얻었기에 이를 보고하는 바이다.
제안 방법
- 또한 DPPH는 가시광선 영역에서 매우 강한 흡수를 보여주기 때문에 UV-Vis 분광광도계로 측정할 수 있어 항산화 활성 측정에 일반적으로 광범위하게 이용된다9). 96-well plate에 실험 농도별로 에탄올에 녹인(6.25, 12.5, 25, 50㎎/㎖)추출물 100㎕와 0.4mM로 제조된 DPPH 용액 100㎕를 더하여 호일로 빛을 차단하여 실온에서 10분간 반응시킨 후 ELISA reader로 515㎚에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조군은 BHT(Butyl Hydrated Toluene) 용액 100㎍/㎖을 사용하였으며 양성 대조군을 실험군과 비교하여 자유기 소거활성을 다음과 같이 백분율로 나타내었다.
- 표준비교물질로 알부틴(Albutin, 250㎎/㎖)을 사용하였다. 각각의 농도에서 시료 자체의 색상에 의한 흡광도를 측정하여 이를 제외한 활성을 도출하였다.
- 미백 활성을 연구하기 위해 피부의 색을 결정하는 요소와 그 생성과정을 살펴보았다. 피부의 색을 결정하는 Melanin 합성 반응은 melanosome관련 단백질에 의해 제어된다.
- 미백효과 활성은 Tyrosinase 활성 저해 실험(tyrosinase inhibition asssay)으로 측정하였다. 이는 멜라닌 합성과정의 속도 결정 단계를 촉매하는tyrosinase의 활성 저해율을 측정하여 미백 성분의 효과를 평가하는 방법이다9).
- 고체배지에서 계대 배양된 4종의 균주는 각각의 액체배지(1㎖)에 담긴 시험관에 접종한 후 시간과 온도가 설정된 진탕배양기(VISION 8480, Korea)에서 배양하였다. 배양된 균주의 밀도는 흡광광도계(UV spectrophotometer, Biochrom, Libsra S22, England)를 사용해 515㎚에서 Optical Density(O.D.)값 0.5로 조절하여 실험을 수행하였다.
- 4mM로 제조된 DPPH 용액 100㎕를 더하여 호일로 빛을 차단하여 실온에서 10분간 반응시킨 후 ELISA reader로 515㎚에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조군은 BHT(Butyl Hydrated Toluene) 용액 100㎍/㎖을 사용하였으며 양성 대조군을 실험군과 비교하여 자유기 소거활성을 다음과 같이 백분율로 나타내었다.
- 좌금환과 수련환 열수추출물의 항산화 활성을 측정하기 위해 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)free radical scavenging activity를 측정하였다. DPPH의 자유기 소거능 측정은 추출물의 DPPH에 대한 전자공여효과를 통해 시료의 환원력을 측정하는 방법으로 고안되었다9,10).
- 본 실험에 사용한 약재는 유일제약의 황련(Coptidisrhizoma, 중국산)과 원광허브의 오수유(Evodiaefructus, 중국산)이다. 좌금환은 동의보감상의 용량을 2배로, 수련환은 방약합편상의 용량을 1.5배로 하여 약재의 총량을 비슷한 수준으로 맞추어 전자는 황련 360g,오수유 60g로 구성하였으며 후자는 황련 160g, 오수유 160g으로 처방을 구성하였다. 약재 총량의 약 10배인 4ℓ의 증류수에 100℃로 2시간 반 동안 전탕하였다.
- 증류수에 용해시킨 농도별 추출물을 항생물질검정용 Paperdisk(Adaantec, ∅6mm)에 20㎕씩 흡수시킨 후 이 Disk를 균이 고르게 도말된 Muller-Hilton agar배지에 놓고 양성대조군으로 항세균제인 ampicillin 및 항진균제인 amphotericin(Sibma Co, USA)를 각각 1㎍/disc농도로 사용하였으며 이를 균의 생육온도로 조절된 Incubator에서 24시간 배양한 후 Paper disc 주변에 생성된 생육 저해환(inhibitory zone, clear zone)의 직경을 Digital vernier caliper(Mitutoyo, Japan)로 측정하여 항균력을 비교하였다(Table 2~6).
- 평판배지법에 따른 항균실험(Paper disc diffusion method)은 James and Sherman(1999)과 Collins etal(1989)의 방법을 변형하여 실시하였다. 증류수에 용해시킨 농도별 추출물을 항생물질검정용 Paperdisk(Adaantec, ∅6mm)에 20㎕씩 흡수시킨 후 이 Disk를 균이 고르게 도말된 Muller-Hilton agar배지에 놓고 양성대조군으로 항세균제인 ampicillin 및 항진균제인 amphotericin(Sibma Co, USA)를 각각 1㎍/disc농도로 사용하였으며 이를 균의 생육온도로 조절된 Incubator에서 24시간 배양한 후 Paper disc 주변에 생성된 생육 저해환(inhibitory zone, clear zone)의 직경을 Digital vernier caliper(Mitutoyo, Japan)로 측정하여 항균력을 비교하였다(Table 2~6).
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 약재는 유일제약의 황련(Coptidisrhizoma, 중국산)과 원광허브의 오수유(Evodiaefructus, 중국산)이다. 좌금환은 동의보감상의 용량을 2배로, 수련환은 방약합편상의 용량을 1.
- 여기에 2000∪/㎖의 mushroom tyrosinase 100㎕를 첨가하고 5분 후의 흡광도를 37℃에서 490㎚로 측정하였다. 표준비교물질로 알부틴(Albutin, 250㎎/㎖)을 사용하였다. 각각의 농도에서 시료 자체의 색상에 의한 흡광도를 측정하여 이를 제외한 활성을 도출하였다.
- 항균 실험에 사용한 균주는 Candida albicans, Staphylococcus aureus, Aspergillus niger, Pseudomonas aeruginosa로 한국 미생물 보존 센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 의뢰하여 분양받은 것을 사용하였으며 각 균주에 적합한 배지에서 각각의 생육 온도에 따라 생육, 보관하였다. 균주의 생육 온도는 C.
성능/효과
- 1. 좌금환과 수련환 물 추출물의 Paper disc method를 이용한 항균 활성 실험 결과 4종의 균주(Candida albicans, Staphylococcus aureus,Aspergillus niger, Pseudomonas aeruginosa)에 대하여 모두 농도 의존적인 활성도를 보였다.
- 2. 좌금환은 C. albicans에 대해 6.25㎎/㎖에서 P.C.에 비교하여 유사한 활성을 보이며 50㎎/㎖에서 2배 이상의 활성을 보였다.
- 3. 좌금환은 S. aureus에 대해 25㎎/㎖에서 대조군 이상의 활성을 보였으며 50㎎/㎖에서는 약 40%이상의 활성을 나타내었다.
- 4. 수련환은 C. albicans에 대해 12.5㎎/㎖에서 대조군 이상의 활성을 나타냈으며 50㎎/㎖에서는 2배 이상의 활성을 보였다.
- 5. 수련환은 S. aureus에 대해 25㎎/㎖에서 대조군과 유사한 활성을 보였으며 6.25㎎/㎖에서는 활성을 나타내지 않았다.
- 6. 좌금환과 수련환은 A. niger, P. aeruginosa에 대한 항균 활성을 나타내지 않았다.
- 7. 좌금환은 DPPH 자유기 소거활성 실험 결과 50㎎/㎖에서 대조군과 유사한 정도의 활성을 보였으며 그 이하의 농도에서도 유효한 활성이 있었으나 대조군에 미치지 못했다.
- 8. 수련환은 DPPH 자유기 소거활성 실험 결과 12.5㎎/㎖ 이상의 농도에서 모두 대조군에 비해 미세하게 우세한 활성을 보였으나 농도에 따른 차이는 크지 않았다.
- 9. 좌금환의 경우 6.25㎎/㎖의 농도와 12.5㎎/㎖에서 Tyrosinase 활성 저해 작용이 없었으며 25㎎/㎖과 50㎎/㎖에서 Albutin과 대등한 정도의 활성을 보였다.
- DPPH를 이용한 자유기 소거 활성 실험 결과 좌금환은 가장 높은 농도인 50 ㎎/㎖ 에서 대조군과 유사한 정도의 활성을 보였으며 그 이하의 농도에서도 유효한 활성이 있었으나 대조군에 미치지 못했다. 시료 자체의 색소로 인해 96-well plate에서 갈색 색상이 진하게 보이는 양상을 보였다.
- 25㎎/㎖에서도 양성대조군에 비교하여 유사한 활성을 보이며 50㎎/㎖에서는 2배 이상의 활성을 보였다. S. aureus에 대해 25㎎/㎖에서 대조군 이상의 활성을 보였으며 50㎎/㎖에서는 약 40％ 이상의 활성을 나타내었다.
- 5㎎/㎖에서는 활성이 없었으며 25㎎/㎖과 50㎎/㎖에서는 미백 활성 표준물질인Albutin과 대등한 정도의 활성을 보였다. 가장 높은 농도인 50㎎/㎖에서는 미세하지만 우세한 활성을 보였다. 그러나 수련환은 6.
- 2)로 여과하여 35℃이하로 세팅된 감압농축기(RE-111, Switzerland)에서 용매를 증발시켜 추출액을 얻었으며, 동결건조기(Ilshin TFD5505, Korea)로 건조하여 분말로 만든 후 4℃에서 냉장 보관하였다. 각 처방의 동결건조 후 수득률은 좌금환은 7.61%, 수련환은 8.67%였다(Table 1).
- 5㎎/㎖의 농도에서도 대조군보다 미약하게 우세한 결과를 나타내었다. 미백실험의 경우 수련환은 미백 활성을 보이지 않았으며 오히려 Tyrosinase 활성도가 증가한 것으로 나타났다. 좌금환은 12.
- 본 연구 결과 항균 실험에서 좌금환과 수련환 물 추출물은 C. albicans와 S. aureus에 대해 항균 효과를 나타내었으며 모두 농도 의존적인 활성도를 보였다. 좌금환은 C.
- aureus에 대해 25㎎/㎖에서 대조군 이상의 활성을 보였으며 50㎎/㎖에서는 약 40%이상의 활성을 나타내었다. 수련환은 C. albicans에 대해 12.5㎎/㎖에서 대조군 이상의 활성을 나타냈으며 50㎎/㎖에서는 2배 이상의 활성을 보였다. 수련환은 S.
- 실험 결과를 종합해보면 C. albicans 에 대한 항균 효과는 좌금환과 수련환이 유사했으며 S. aureus에 대한 효과는 좌금환이 수련환에 비해 강한 효과를 나타내어 2배가량 큰 생육저해환을 형성하였다. 항산화 효과는 좌금환에 비해 수련환이 큰 것으로 나타나 좌금환은 50㎎/㎖에서 대조군의 효과와 유사하였고 수련환은 12.
- 좌금환과 수련환 물 추출물의 Paper disc method를 이용한 항균 활성 실험 결과 모두 농도 의존적인 활성도를 보였다. 좌금환은 C.
- aureus에 대해 항균 효과를 나타내었으며 모두 농도 의존적인 활성도를 보였다. 좌금환은 C. albicans에 대해 6.25㎎/㎖에서 P.C.에 비교하여 유사한 활성을 보였으며 50㎎/㎖에서 2배 이상의 활성을 보였다. 좌금환은 S.
- 좌금환과 수련환 물 추출물의 Paper disc method를 이용한 항균 활성 실험 결과 모두 농도 의존적인 활성도를 보였다. 좌금환은 C. albicans에 대해 가장 낮은 농도인 6.25㎎/㎖에서도 양성대조군에 비교하여 유사한 활성을 보이며 50㎎/㎖에서는 2배 이상의 활성을 보였다. S.
- aureus에 대한 효과는 좌금환이 수련환에 비해 강한 효과를 나타내어 2배가량 큰 생육저해환을 형성하였다. 항산화 효과는 좌금환에 비해 수련환이 큰 것으로 나타나 좌금환은 50㎎/㎖에서 대조군의 효과와 유사하였고 수련환은 12.5㎎/㎖의 농도에서도 대조군보다 미약하게 우세한 결과를 나타내었다. 미백실험의 경우 수련환은 미백 활성을 보이지 않았으며 오히려 Tyrosinase 활성도가 증가한 것으로 나타났다.
후속연구
- 본 연구의 미비점으로는 반복 실험 횟수가 비교적 적었으며 항균효과를 보다 명확히 하기 위한 세포 독성 실험이 추가적으로 필요하다는 것 등이 있다. 차후 좌금환과 수련환의 피부 외용제로서의 활용성을 높이기 위한 연구로 보다 많은 종류의 세균에 대한 활성,다각적인 항산화와 미백 기전을 통한 연구, 보다 더 효율적인 약재 농도 등의 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 항산화 실험은 황련 열수추출물의 항산화 효과를 연구한 논문41)에 따르면 Hayase등의 방법에 따라 Peroxide value를 측정하여 항산화성의 지표로 사용하였는데 linoleic acid를 기질로 하여 황련 추출물을 5, 10, 25㎎씩 각각 첨가하여 실험한 결과 합성 항산화제인 BHT 및 ascorbic acid와 거의 같으며 천연 항산화제인 α-tocopherol 보다는 아주 우수한 항산화력을 나타내었다. 실험 방법의 차이가 있으나 황련의 유효한 항산화 효능을 나타내는 논문이라 할 수 있는데, 본 실험에서 황련의 비율이 6배가 높은 좌금환의 항산화능이 수련환에 비해 작게 나타난 것은 寒熱이 상반되는 황련과 오수유 두 약재 간의 상호작용이 나타난 것으로 사료되며, 오수유 열수추출물의 항산화능에 대한 연구 또한 추가적으로 필요할 것으로 보인다. 미백 실험 또한 항균 실험과 마찬가지로 황련의 미백작용18)이 좌금환과 수련환의 미백효과 차이를 나타내는데 영향을 준 것으로 사료된다.
- . 이 중 일반적으로 광범위하게 이용되며9), 저비용으로 반복 실험이 가능한 DPPH radical-scavenging activity 측정을 이용하였으며, 차후 보다 다각적인 항산화 연구를 위하여 다른 연구방법들도 고려해 볼 수 있을 것이다.
- 본 연구의 미비점으로는 반복 실험 횟수가 비교적 적었으며 항균효과를 보다 명확히 하기 위한 세포 독성 실험이 추가적으로 필요하다는 것 등이 있다. 차후 좌금환과 수련환의 피부 외용제로서의 활용성을 높이기 위한 연구로 보다 많은 종류의 세균에 대한 활성,다각적인 항산화와 미백 기전을 통한 연구, 보다 더 효율적인 약재 농도 등의 연구가 필요할 것으로 사료된다.
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