어성초(魚腥草)의 항산화 효능 확인 및 모유두 세포의 5α-reductase 유전자 발현에 미치는 영향 Investigation of Antioxidant Activity of Houttuyniae Herba and its Effect on 5α-reductase Gene Expression in Dermal Papilla Cells원문보기
Houttuyniae Herba is widely used as a cosmetic for enhancing hair growth, and study on promoting mouse hair growth has also been reported. However, studies on the effects of the Houttuyniae Herba on dermal papilla (DP) cells, which play an important role in hair growth, are not well known. For this ...
Houttuyniae Herba is widely used as a cosmetic for enhancing hair growth, and study on promoting mouse hair growth has also been reported. However, studies on the effects of the Houttuyniae Herba on dermal papilla (DP) cells, which play an important role in hair growth, are not well known. For this reason, we studied the effect of Houttuyniae Herba on DP cells. The strong antioxidant activity of Houttuyniae Herba was confirmed by ABTS assay. In the MTS assay, cell viability was reduced to 94.5% in DP cells by treatment of 2 mg/ml concentration of Houttuyniae Herb and cytotoxicity was not observed at 1 mg/ml concentration. The mRNA expression levels of Bone morphogenetic pretein (BMP6), fibroblast growth factor 7 (FGF7), FGF10, and ${\beta}$-galactosidase genes, which are involved in hair growth cycle and hair loss induction, were measured by quantitative RT-PCR after Houttuyniae Herbtreatment. Houttuyniae Herb did not significantly affect mRNA expression of BMP6, FGF7, FGF10, and ${\beta}$-catenin, which are important factors for regulating the hair cycle, including type 1 $5{\alpha}$-reductase. However, mRNA expression of type 2 $5{\alpha}$-reductase, the major cause of male hair loss, was significantly reduced to 56.1% by treatment of Houttuyniae Herbtreatment. Taken together, these results suggest that the Houttuyniae Herbtreatment can help to treat lair loss through removing free radicals and suppression of the expression level of type 2 $5{\alpha}$-reductase in DP cells.
Houttuyniae Herba is widely used as a cosmetic for enhancing hair growth, and study on promoting mouse hair growth has also been reported. However, studies on the effects of the Houttuyniae Herba on dermal papilla (DP) cells, which play an important role in hair growth, are not well known. For this reason, we studied the effect of Houttuyniae Herba on DP cells. The strong antioxidant activity of Houttuyniae Herba was confirmed by ABTS assay. In the MTS assay, cell viability was reduced to 94.5% in DP cells by treatment of 2 mg/ml concentration of Houttuyniae Herb and cytotoxicity was not observed at 1 mg/ml concentration. The mRNA expression levels of Bone morphogenetic pretein (BMP6), fibroblast growth factor 7 (FGF7), FGF10, and ${\beta}$-galactosidase genes, which are involved in hair growth cycle and hair loss induction, were measured by quantitative RT-PCR after Houttuyniae Herbtreatment. Houttuyniae Herb did not significantly affect mRNA expression of BMP6, FGF7, FGF10, and ${\beta}$-catenin, which are important factors for regulating the hair cycle, including type 1 $5{\alpha}$-reductase. However, mRNA expression of type 2 $5{\alpha}$-reductase, the major cause of male hair loss, was significantly reduced to 56.1% by treatment of Houttuyniae Herbtreatment. Taken together, these results suggest that the Houttuyniae Herbtreatment can help to treat lair loss through removing free radicals and suppression of the expression level of type 2 $5{\alpha}$-reductase in DP cells.
* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.
문제 정의
본 연구에서 魚腥草를 열수추출하여 얻은 시료를 대상으로 항산화 효능, 모유두 세포에 미치는 세포독성 그리고 모발의 성장 및 탈모의 유발과 관련된 유전자의 mRNA 발현량에 미치는 영향을 확인하여 다음과 같은 결론을 얻었다
이에 저자는 魚腥草를 열수추출하여 얻은 시료로 항산화 효능, 모유두 세포에 가지는 세포독성 그리고 BMP6, FGF7, FGF10, β-catenin, 제1형, 제2형 5α-reductase의 mRNA 발현량에 미치는 영향을 조사하여 유의한 결과를 얻었기에 이에 보고하는 바이다.
제안 방법
cells/well로 96 well plate에 분주 후 24 시간 배양하였다. 0.13, 0.25, 0.5, 1, 2 mg/ml 농도로 魚腥草를 처리한 뒤 36 시간동안 반응시켜주었다. 이후 MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2- (4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) 용액 20 μl를 첨가한 뒤 1 시간 후 490 nm 흡광도를 microplate reader로 측정하였다.
ABTS assay를 이용하여 魚腥草와 resveratrol의 항산화 효능을 확인하였다. ABTS 7 mM 용액과 potassium persulfate 2.
ABTS assay를 통해 魚腥草의 항산화 효능을 확인하였다. 魚腥草를 다양한 농도로 모유두 세포에 36 시간 처리한 후 MTS assay를 실시한 결과 1 mg/ml 에서 큰 세포독성이 확인되지 않았다.
eCube Tissue RNA Mini Kit를 이용하여 모유두 세포의 RNA를 추출한 뒤, The Qubit 2.0 Fluorometer을 이용하여 농도를 정량해 주고, RAW 1 μg에 DEPC-treated water를 이용하여 총 부피를 8 μl로 조정하였다.
魚腥草가 모유두 세포에 미치는 세포독성을 확인하기 위하여 다양한 농도의 魚腥草를 모유두 세포에 36 시간 반응시킨 뒤 MTS assay를 진행하였다. 그 결과 魚腥草 0.
5%로 감소시키는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 세포 독성 실험 결과를 참조하여 이후 실험은 세포 독성이 보이지 않는 농도 범위 내에서 수행하였다.
이후 RNaseinhibitor 1 μl, M-MLV RT reaction buffer 4 μl, M-MLV reverse transcriptase 1 μl, DEPC-treated water 4 μl를 추가로 첨가해준 뒤, 다시 50℃에서 1 시간 동안 반응시켜 cDNA를 합성하고, 80 μl의 D.W를 첨가하였다.
모유두 세포에 존재하는 5α-reductase는 testosterone과 작용하여 남성형 탈모의 주요 원인인 dihydrotestosterone (DHT)를 생성한다. 큰 독성이 보이지 않은 0.5 mg/ml 농도의 魚腥草를 모유두 세포에 36 시간 처리한 뒤, 魚腥草를 처리하지 않은 대조군의 mRNA 발현량에 (100%) 대한 상대적인 mRNA 발현량을 qRT-PCR을 통해 확인하였다. BMP6, FGF7, FGF10 그리고 β -catenin의 유전자인 CTNNB1의 mRNA 발현을 78.
희석시킨 cDNA 5 μl를 forward, reverse primer (10 pmol/μl) 각각 1.5 μl, 2X Prime Q-mater Mix 10 μl, D.W 2 μl를 섞고 AriaMx를 통해 qRT-PCR을 수행하여 BMP6, FGF7, FGF10, CTNNB1, SRD5A1, SRD5A2의 mRNA 발현 변화 확인하였으며, β-actin으로 결과 값을 보정하였다.
대상 데이터
2, Japan), DMEM media (WELGENE, Korea), FBS (WELGENE, Korea), 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin (WELGENE, Korea), Trypsin-EDTA (WELGENE, Korea), DPBS (Corning, USA), MTS solution (Promega, USA), eCube Tissue RNA Mini Kit (PhileKorea, Korea), Qubit RNA Assay Kit (Molecular probes, USA), M-MLV reverse transcriptase (Promega, USA), 5X M-MLV RT reaction buffer (Promega, USA), RNase inhibitor (Enzynomics, Korea), 2X Prime Q-mater Mix (GENETBIO, Korea) 등이 사용되었다. 본 실험에 사용된 기기는 rotary vacuum evaporator (Eyela, Japan), ultrasonic cleaner (Branson, USA), CO2 incubator (Thermo, USA), microplate reader (Molecular Devices EMax Plus, USA), The Qubit 2.0 Fluorometer (Invitrogen, USA), AriaMx (Agilent, USA) 등이다.
본 실험을 위해서 filter paper (Advantec No.2, Japan), DMEM media (WELGENE, Korea), FBS (WELGENE, Korea), 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin (WELGENE, Korea), Trypsin-EDTA (WELGENE, Korea), DPBS (Corning, USA), MTS solution (Promega, USA), eCube Tissue RNA Mini Kit (PhileKorea, Korea), Qubit RNA Assay Kit (Molecular probes, USA), M-MLV reverse transcriptase (Promega, USA), 5X M-MLV RT reaction buffer (Promega, USA), RNase inhibitor (Enzynomics, Korea), 2X Prime Q-mater Mix (GENETBIO, Korea) 등이 사용되었다.
실험에 사용된 魚腥草는 한국 서울의 동양허브 주식회사로부터 2017년 1월에 구매 (NO; 2017-0104)하여 기원의 진위와 품질의 우열을 가천대학교 한의과 대학 본초학교실에서 감정하였고, 약재는 ultrasonic cleaner를 이용하여 불순물을 제거하고 실험에 사용하였다.
실험에 사용된 세포는 모유두 세포이며 충남대학교 의과대학 피부과로부터 세포주를 분양받아 연구를 진행하였다15) . 실험에 사용한 모유두 세포는 10% FBS와 1% antibiotic이 첨가되어있는 DMEM 배양액을 이용하였으며, 세포표준배양법인 5% CO2, 37℃ 조건을 유지해주었다.
. 실험에 사용한 모유두 세포는 10% FBS와 1% antibiotic이 첨가되어있는 DMEM 배양액을 이용하였으며, 세포표준배양법인 5% CO2, 37℃ 조건을 유지해주었다.
이론/모형
Houttuyniae Herba was treated with indicated concentration on dermal papilla cells for 36 h. Cell viability was measured by MTS assay. *p < 0.
. 魚腥草의 농도에 따 른 모유두 세포의 세포독성을 확인하기 위하여 MTS assay를 진행 하였다. 그 결과 2 mg/ml 농도의 魚腥草는 모유두 세포의 세포활 성도를 94.
즉 활성산소의 활성을 억제할 수 있는 항산화 효능은 모발의 성장 유도 및 탈모 예방에 매우 중요하게 작용할 수 있다. 이러한 이유로 본 연구에서 魚腥草가 활성산소에 미치는 작용을 ABTS assay를 이용하여 확인하였다. 그 결과 魚腥草의 농도 증가에 따른 항산화 효능 증가가 확인되었으며, 특히 1 mg/ml 농도 魚腥草의 ABTS radical 소거 효능은 95.
또한 모낭의 혈류를 감소시키고, 세포 사멸을 유도하여 탈모를 야기하게 된다16) . 이러한 활성산소에 魚腥 草가 미치는 작용을 확인하기 위하여 ABTS assay를 진행하였다. 항산화 효능이 잘 알려진 resveratrol을 이용하여 ABTS assay를 진행한 결과 10 μM에서 10.
성능/효과
3%로 큰 영향을 미치지 못하였다. 2 mg/ml 농도의 魚腥草는 DP 세포의 세포활성도를 94.5%로 감소시키는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 세포 독성 실험 결과를 참조하여 이후 실험은 세포 독성이 보이지 않는 농도 범위 내에서 수행하였다.
BMP6, FGF7, FGF10 그리고 β -catenin의 유전자인 CTNNB1의 mRNA 발현을 78.1%, 90.4%, 79.0%, 93.6%로 약간 감소시켰으나 큰 변화를 확인할 수는 없었고, 제1형 5α-reductase의 유전자인 SRD5A1의 mRNA 발현 또한 89.5%로 큰 변화를 미치지 못하였다.
7%로 농도 증가에 따른 항산화 효능의 증가가 확인되었으며, 이를 통해 ABTS assay에 대한 신뢰성을 확보할 수 있었다. 魚腥草 또한 농도 증가에 따른 항산화 효능이 확인되었으며, 1 mg/ml 농도 魚腥草의 ABTS radical 소거 효능은 95.4%로 뛰어난 항산화 효능을 나타내었다.
ABTS assay를 통해 魚腥草의 항산화 효능을 확인하였다. 魚腥草를 다양한 농도로 모유두 세포에 36 시간 처리한 후 MTS assay를 실시한 결과 1 mg/ml 에서 큰 세포독성이 확인되지 않았다. 0.
魚腥草의 농도에 따 른 모유두 세포의 세포독성을 확인하기 위하여 MTS assay를 진행 하였다. 그 결과 2 mg/ml 농도의 魚腥草는 모유두 세포의 세포활 성도를 94.5%로 감소시켰지만 1 mg/ml 보다 낮은 농도의 魚腥草 는 큰 세포독성이 확인되지 않았다
魚腥草가 모유두 세포에 미치는 세포독성을 확인하기 위하여 다양한 농도의 魚腥草를 모유두 세포에 36 시간 반응시킨 뒤 MTS assay를 진행하였다. 그 결과 魚腥草 0.125, 0.25, 0.5 mg/ml 농도를 처리한 경우 세포활성도에 큰 영향이 없었으며, 1 mg/ml을 처리한 경우 또한 세포활성도가 98.3%로 큰 영향을 미치지 못하였다. 2 mg/ml 농도의 魚腥草는 DP 세포의 세포활성도를 94.
이러한 이유로 본 연구에서 魚腥草가 활성산소에 미치는 작용을 ABTS assay를 이용하여 확인하였다. 그 결과 魚腥草의 농도 증가에 따른 항산화 효능 증가가 확인되었으며, 특히 1 mg/ml 농도 魚腥草의 ABTS radical 소거 효능은 95.4%로 매우 뛰어난 항산화 효능이 확인되었다. 魚腥草가 가지고 있는 항산화 효능이 세포 및 사람 모발에 적용되었을 때 발모의 촉진 및 탈모의 예방에 미치는 다양한 효과는 추가적인 연구를 통해 확인해야 할 것으로 생각된다.
탕액이 끓는 시점으로부터 2 시간 동안 가열한 뒤, 추출액을 filter paper에서 감압하여 여과액을 제작한 후, rotary vacuum evaporator를 이용하여 농축액을 얻었으며, 이 농축액을 동결건조기를 이용하여 건조한 분말을 제작하였다. 동결건조 추출물은 19.4 g으로 측정되었으며, 수율은 38.8%였다.
반면 제2형 5α-reductase mRNA 발현은 56.1%까지 감소시키는 효과가 있음을 확인하였다.
이 결과를 통해 魚腥草는 모유두 세포의 제 2형 5α-reductase 발현을 감소시킴으로써, DHT 생성을 감소시킬 것으로 생각되며, 이러한 작용을 통해 남성형 탈모 치료에 뛰어난 효과를 보일 것으로 생각된다.
이상의 실험결과를 통해 魚腥草는 활성산소를 효과적으로 제거할 수 있는 항산화 효과 및 남성형 탈모의 주요한 원인인 제2형 5α-reductase의 mRNA 발현 억제를 통하여 남성형 탈모 치료 효과를 보일 것으로 사료된다.
추가적으로 제2형 5α-reductase의 mRNA 발현 감소가 높은 농도의 魚腥草 처리에 의한 위양성 결과가 나타났을 가능성을 확인하기 위하여, 더 낮은 농도인 0.25 mg/ml로 魚腥草를 모유두 세포에 36 시간 처리 한 결과 86.3 %로 제2형 5α-reductase의 mRNA 발현을 감소시켰으며, 魚腥草 처리 농도 증가에 따라 제2형 5α-reductase의 mRNA 발현의 감소가 더욱 촉진되는 것을 확인하였다.
항산화 효능이 잘 알려진 resveratrol을 이용하여 ABTS assay를 진행한 결과 10 μM에서 10.8%, 100 μM 57.7%로 농도 증가에 따른 항산화 효능의 증가가 확인되었으며, 이를 통해 ABTS assay에 대한 신뢰성을 확보할 수 있었다.
후속연구
4%로 매우 뛰어난 항산화 효능이 확인되었다. 魚腥草가 가지고 있는 항산화 효능이 세포 및 사람 모발에 적용되었을 때 발모의 촉진 및 탈모의 예방에 미치는 다양한 효과는 추가적인 연구를 통해 확인해야 할 것으로 생각된다.
향후 in vivo상에서 魚 腥草가 활성산소 및 제2형 5α-reductase의 활성에 미치는 영향과 최종적으로 모발 성장에 미치는 영향을 확인하는 연구가 필요할 것으로 생각되며, 이는 finasteride 및 minoxidil 같은 남성형 탈모 치료제를 대체할 수 있는 천연 치료제 개발에 매우 중요할 것이다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
한의학에서는 탈모는 무엇이라 불리는가?
한의학에서는 탈모는 髮墮, 髮去, 髮落, 毛拔, 油風, 禿瘡, 鬼舐頭라 불리며, 그 원인은 內因과 外因으로 나누어 內因으로는 腎虛, 肺氣虛, 血熱,氣血虛, 血虛, 瘀血, 七情 등을, 外因으로는 風 邪, 風熱, 濕熱, 五味傷, 風, 火 등을 원인으로 보고 있으며12) , 치료는 辨證施治를 통한 한약 치료와 體鍼療法, 藥鍼療法, 光學療法 등 外治法을 다양하게 적용하고 있다13) .
한의학적 탈모의 원인은 무엇인가?
한의학에서는 탈모는 髮墮, 髮去, 髮落, 毛拔, 油風, 禿瘡, 鬼舐頭라 불리며, 그 원인은 內因과 外因으로 나누어 內因으로는 腎虛, 肺氣虛, 血熱,氣血虛, 血虛, 瘀血, 七情 등을, 外因으로는 風 邪, 風熱, 濕熱, 五味傷, 風, 火 등을 원인으로 보고 있으며12) , 치료는 辨證施治를 통한 한약 치료와 體鍼療法, 藥鍼療法, 光學療法 등 外治法을 다양하게 적용하고 있다13) .
魚腥草 잎의 특징은 어떠한가?
밑의 마디에는 가는 뿌리가 남아 있고 질은 무르며 꺾어지기 쉽다. 잎은 말려 있거나 쭈그러져 있으나, 펴면 심장형으로 되어 있다. 잎은 길이 3～5 cm, 너 비 3～4 cm이고 끝은 뾰족하다. 윗면은 어두운 황록색～황갈색이고 아랫면은 회록색～회갈색이다. 이 약은 잎을 비벼서 부수면 생선비린내가 있고 맛은 약간 떫다2) .
참고문헌 (32)
Tao HJ. Mingyibielu. Beijing:Renminweishengchubanshe. 1986:321.
Korea Food and Drug Administration. The Korean Herbal Pharmacopoeia. Seoul:Korea Food and Drug Administration. 2017:275-7.
Kim IR, Kim HC, Kuk YB, Park SJ, Park YK, Park JH, Seo BI, Seo YB, Shin MK, Lee YJ, LeeYC, Lee JH, Leem KH, Cho SI, Chung JK, Joo YS, Choi HY,. Boncho-Hak. Seoul:Young-Lim Press. 2007:270-1.
Miao MS, Li ZG. Modern practical chinese traditional medicine quality control technology. Beijing:People's Hygiene Press. 2000:43.
Huh EG, Kim HG, Park HB, Kang MS, Lee BY, Oh MS. Houttuynia cordata improves cognitive deficits in cholinergic dysfunction Alzheimer's disease-like models. Biomol Ther 2014;22(3):176-83.
Jeong HR, Kwak JH, Kim JH, Choi GN, Jeong CH , Heo HJ. Antioxidant and neuronal cell protective effects of an extract of Houttuynia cordata Thunb (a Culinary Herb). Korean J Food Preserv. 2010;17(5):720-6.
Kim DH, Lim JJ, Lee JJ, Jung WC, Shin HJ, Lee HJ, Kim GS, Kim S. Antibacterial and therapeutic effects of Houttuynia cordata ethanol extract for murine salmonellosis. Korean J Environmental Agriculture. 2008;27(2):156-62.
Kwak IS, Kim YB, Ri SH, Shim SN, Lee JH, Cho JH, Joo ER. NEW Dupimobal gwanli-Hak. Gun-Ja Press. 2011:21-2.
OOh JW, Kloepper J, Langan EA, Kim Y, Yeo J, Kim MJ, Hsi TC, Rose C, Yoon GS, Lee SJ, Seykora J, Kim JC, Sung YK, Kim M, Paus R, Plikus MV. A guide to studying human hair follicle cycling in vivo. J Invest Dermatol. 2016;136(1):34-44.
Yim SBN, Choi GD, Kim SK. A literature study about the comparison of Oriental-Occidental medicine on the alopecia. The Journal of Jehan oriental medical academy. 1999;4(1):699-710.
Hong YH, Bae SH, Suh HJ. Effect of Herbal Complex Extract Including Houttuynia cordata Thunb on Hair Growth Promotion in C57BL/6 Mice. Korean J Aesthet Cosmetol. 2015;13(3):321-9.
Kim CD, Lee MH, Roh SS. Identification of androgenregulated genes in SV40-transformed human hair dermal papilla cells. J Dermatol Sci. 2003;32(2):143-9.
Solanas G, Benitah SA. Regenerating the skin: a task for the heterogeneous stem cell pool and surrounding niche. Nat Rev Mol Cell Biol. 2013;14(11):737-48.
Enshell-Seijffers D, Lindon C, Kashiwagi M, Morgan BA. Beta-catenin activity in the dermal papilla regulates morphogenesis and regeneration of hair. Dev Cell. 2010;18(4):633-42.
Kim HC. Hanbangyagli-Hak. Seoul:Jibmundang. 2001:165-6.
Meng J, Dong XP, Jiang ZH, Leung SY, Zhao ZZ. Study on chemical constituents of flavonoids in fresh herb of Houttuynia cordata. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2006;31(16):1335-7.
Lu HM, Wu XJ, Liang YZ, Zhang J. Variation in chemical composition and antibacterial activities of essential oils from two species of Houttuynia Thunb. Chem. Pharm. Bull. 2006;54(7):936-40.
Peters EM, Arck PC, Paus R. Hair growth inhibition by psychoemotional stress: a mouse model for neural mechanisms in hair growth control. Exp. Dermatol. 2006;15(1):1-13.
Naito A, Midorikawa T, Yoshino T, Ohdera M. Lipid peroxides induce early onset of catagen phase in murine hair cycles. Int J Mol Med. 2008;22(6):725-9.
Liu N, Wang LH, Guo LL, Wang GQ, Zhou XP, Jiang Y, Shang J, Murao K, Chen JW, Fu WQ, Zhang GX. Chronic Restraint Stress Inhibits Hair Growth via Substance P Mediated by Reactive Oxygen Species in Mice. PLoS One. 2013;8(4):e61574.
Rahmani W, Abbasi S, Hagner A, Raharjo E, Kumar R, Hotta A, Magness S, Metzger D, Biernaskie J. Hair Follicle Dermal Stem Cells Regenerate the Dermal Sheath, Repopulate the Dermal Papilla, and Modulate Hair Type. Dev Cell. 2014;31(5):543-58.
Liu S, Yamauchi H. Different patterns of 5alpha-reductase expression, cellular distribution, and testosterone metabolism in human follicular dermal papilla cells. Biochem Biophys Res Commun. 2008;368(4):858-64.
Asada Y, Sonoda T, Ojiro M, Kurata S, Sato T, Ezaki T, Takayasu S. 5 alpha-reductase type 2 is constitutively expressed in the dermal papilla and connective tissue sheath of the hair follicle in vivo but not during culture in vitro. J Clin Endocrinol Metab. 2001;86(6):2875-80.
Kaufman KD, Olsen EA, Whiting D, Savin R, DeVillez R, Bergfeld W, Price VH, Van Neste D, Roberts JL, Hordinsky M, Shapiro J, Binkowitz B, Gormley GJ.Finasteride in the treatment of men with androgenetic alopecia. Finasteride Male Pattern Hair Loss Study Group. J Am Acad Dermatol. 1998;39(4Pt1):578-89.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.