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문제 정의
- 白首烏의 처리에 의하여 모유두 세포의 제 2형 5α -reductase mRNA 발현량이 감소되는 효과는 白首烏가 남성형 탈모의 뛰어난 치료 효과를 나타낼 수 있는 가능성을 제시해준다.
- 본 연구 결과를 통해 白首烏는 항산화 효능 및 제2형 5α -reductase 발현 억제를 바탕으로 남성형 탈모를 효율적으로 치료 할 수 있는 새로운 치료제로 개발될 수 있는 가능성 제시하였다.
- 이에 저자는 白首烏를 열수추출하여 얻은 시료로 항산화 효능, 모유두 세포의 세포활성도에 미치는 영향, 그리고 제1형, 제2형 5α-reductase, bone morphogenetic pretein (BMP)6, fibroblast growth factor (FGF)7, FGF10, β -catenin의 mRNA 발현량에 미치는 영향을 조사하여 유의한 결과를 얻었기에 이에 보고하는 바이다.
- 추가로 白首烏가 모발 성장에 중요하게 작용하는 BMP6, FGF7, FGF10 β-catenin 유전자 발현에 미치는 영향을 확인해보았다.
제안 방법
- 0.5 mg/ml 白首烏에 의한 BMP6, FGF7, FGF10 그리고 β-catenin 유전자인 CTNNB1의 발현 변화를 qRT-PCR을 이용하여 확인하였다.
- cDNA 5 μl와 2X Prime Q-mater Mix 10 μl, D.W 2 μl, forward, reverse primer (10 pmol/μl) 각각 1.5 μl를 섞고, AriaMx를 통해 qRT-PCR을 수행하여 SRD5A1, SRD5A2, BMP6, FGF7, FGF10, CTNNB1의 mRNA 발현 변화를 확인하였다.
- 白首烏 농도 (0.125, 0.25, 0.5, 1.2 mg/ml)와 resveratrol의 항산화 효능을 ABTS (2,2'-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline6-sulphonic acid) assay를 통해 측정하였다.
- 白首烏가 남성형 탈모에 미치는 영향을 확인하기 위하여 모유두 세포에 0.5mg/ml 白首烏를 36 시간 처리한 후 제1형과 제2형 5α-reductase 유전자인 SRD5A1, SRD5A2의 mRNA 발현량을 qRT-PCR로 확인하였다.
- 白首烏가 모유두 세포의 세포활성도에 미치는 효과를 확인하기 위하여 미토콘드리아의 NADH, NADPH 생성량을 측정하는 MTS assay를 실시하였다. 모유두 세포에 白首烏를 24 시간 처리한 결과 0.
- 항산화제인 tempol은 마우스에서 지질의 산화를 막아주어 모발 생성 주기를 회복하는 작용을 가진다는 연구결과가 보고되었다31) . 항산화 효능은 모발 성장 촉진 및 탈모 억제에 중요하게 작용할 수 있으므로 白首烏의 항산화 효능을 ABTS assay를 통해 확인하였다. 그 결과 白首烏는 농도 의존적인 ABTS 라디칼 소거능을 나타내었다.
- 5 mg/ml 농도로 처리한 뒤 24 시간 동안 다시 배양하였다. 배양액을 다 제거해주고 DPBS로 세척 후 trypsin-EDTA를 처리하여 single cell을 얻은 뒤 hemocytometer로 세포 수를 측정하였다.
- 5 mg/ml를 처리한 뒤 36 시간 다시 배양하였다. 배양액을 제거해준 뒤 DPBS로 세척 후 eCube Tissue RNA Mini Kit로 RNA를 추출하였다. The Qubit 2.
- 본 연구에서 白首烏를 열수추출하여 얻은 시료의 항산화 효능을 확인하였으며, 모유두 세포에 白首烏를 처리한 뒤 나타나는 세포 활성도의 변화, 모발의 성장 및 탈모의 유발과 관련된 유전자의 mRNA 발현량에 미치는 영향을 확인하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 세포활성도를 가장 높은 수치로 증가시킨 0.5 mg/ml 농도 白首烏를 모유두 세포에 처리한 뒤 모발의 생성 및 성장과 관련된 다양한 유전자 발현에 미치는 영향을 확인해보았다. 제1형 5α -reductase는 피부의 피지 및 땀샘에 많이 분포하고 있으며 제2형 5α-reductase는 수염, 전립선 그리고 두피 모낭에 주로 분포하고 있다34) .
- . 이러한 이유로 白首烏 가 활성산소에 미치는 작용을 ABTS assay를 통해 확인하였다. 항산화 효능이 잘 알려진 resveratrol을 이용하여 ABTS assay를 진행한 결과 농도의존적으로 ABTS 라디칼 소거능을 보였으며, 이를 통해 실험 시스템을 검증할 수 있었다.
- 항산화제인 tempol은 마우스에서 지질의 산화를 막아주어 모발 생성 주기를 회복하는 작용을 가진다는 연구결과가 보고되었다31) . 항산화 효능은 모발 성장 촉진 및 탈모 억제에 중요하게 작용할 수 있으므로 白首烏의 항산화 효능을 ABTS assay를 통해 확인하였다. 그 결과 白首烏는 농도 의존적인 ABTS 라디칼 소거능을 나타내었다.
대상 데이터
- 白首烏 중량 50 g을 정확하게 측정한 뒤, 환류추출기에 1차 증류수 2,000 ml와 함께 넣은 뒤 탕액이 끓는 시점으로부터 2 시간 동안 가열하여 추출한 다음 추출액을 filter paper로 감압 여과한 여과액을 rotary vacuum evaporator를 이용하여 농축액을 얻었으며, 이 농축액을 동결건조기를 이용하여 건조한 분말을 시료로 사용하였다. 동결건조 추출물은 白首烏 16.
- 2, Japan) 등이 사용되었다. 본 실험에 사용된 기기는 CO2 incubator (Thermo, USA), microplate reader (Molecular Devices EMax Plus, USA), The Qubit 2.0 Fluorometer (Invitrogen, USA), AriaMx (Agilent, USA), rotary vacuum evaporator (Eyela, Japan), Ultrasonic cleaner (Branson, USA) 등이다.
- 본 실험을 위해서 DMEM media (WELGENE, Korea), 100U/ml Penicillin/Streptomycin (WELGENE, Korea), FBS (WELGENE, Korea), DPBS (Corning, USA), Trypsin-EDTA (WELGENE, Korea), MTS solution (Promega, USA), Qubit RNA Assay Kit (Molecular probes, USA), eCube Tissue RNA Mini Kit (PhileKorea, Korea), 2X Prime Q-mater Mix (GENETBIO, Korea), M-MLV reverse transcriptase (Promega, USA), 5X M-MLV RT reaction buffer (Promega, USA), RNase inhibitor (Enzynomics, Korea), 그리고 Filter paper (Advantec No.2, Japan) 등이 사용되었다.
- 실험에 사용된 白首烏는 한국 서울의 동양허브 주식회사로부터 2017년 1월에 구입 (NO; 2017-0105)하여 기원의 진위와 품질의 우열을 가천대학교 한의과 대학 본초학교실에서 감정하였고, 약재는 ultrasonic cleaner를 이용하여 불순물을 제거하고 실험에 사용하였다.
- 실험에 사용된 모유두 세포는 충남대학교 의과대학 피부과로부터 분양받아 연구를 진행하였다20) . 실험에 사용한 모유두 세포는 10% FBS와 1% antibiotic이 첨가되어있는 DMEM 배양액을 이용하였으며, 세포표준배양법인 5% CO2, 37℃ 조건을 유지시켜주었다.
- . 실험에 사용한 모유두 세포는 10% FBS와 1% antibiotic이 첨가되어있는 DMEM 배양액을 이용하였으며, 세포표준배양법인 5% CO2, 37℃ 조건을 유지시켜주었다.
이론/모형
- . 높은 농도 白首烏 처리에 의하여 모유두 세포에 독성을 나타낼 경우 모발 형성에 부정적인 영향을 미칠 수 있으므로, 白首烏가 유두 세포의 세포활성도에 미치는 영향 그리고 모유두 세포에 가지는 白首烏의 세포성을 확인하기 위하여 MTS assay를 실시하였다. 그 결과 0.
성능/효과
- 白首烏는 제1형 5α-reductase의 mRNA 발현에 큰 영향을 미치지 않았으나 놀랍게도 제2형 5α-reductase의 mRNA 발현을 절반 이상 감소시킨 것을 확인할 수 있었다.
- 白首烏의 항산화 효능을 ABTS assay를 통해 확인하였다. 白首烏를 다양한 농도로 모유두 세포에 24 시간 처리한 후 MTS assay를 실시한 결과 0.5 mg/ml 농도에서 세포활성도를 118.5% 까지 증가시켰다. 0.
- 항산화 효능이 잘 알려진 resveratrol을 이용하여 ABTS assay를 진행한 결과 농도의존적으로 ABTS 라디칼 소거능을 보였으며, 이를 통해 실험 시스템을 검증할 수 있었다. 白首烏의 ABTS 라디칼 소거 효능 또한 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 이 결과를 통해 白首烏의 항산화 효능을 확인할 수 있었다(Fig. 1).
- 높은 농도 白首烏 처리에 의하여 모유두 세포에 독성을 나타낼 경우 모발 형성에 부정적인 영향을 미칠 수 있으므로, 白首烏가 유두 세포의 세포활성도에 미치는 영향 그리고 모유두 세포에 가지는 白首烏의 세포성을 확인하기 위하여 MTS assay를 실시하였다. 그 결과 0.5 mg/ml 농도 白首烏는 모유두 세포의 세포활성도를 증가시켰으며, 2 mg/ml 농도에서는 세포독성이 확인되었다. MTS assay는 tetrazolim salt가 미토콘드리아에서 생성되는 NADH, NADPH에 의해 formazan으로 바뀌며, 이 formazan을 490 nm 흡광도로 측정하여 세포활성도를 확인하는 방법으로 0.
- 5 mg/ml 白首烏에 의한 BMP6, FGF7, FGF10 그리고 β-catenin 유전자인 CTNNB1의 발현 변화를 qRT-PCR을 이용하여 확인하였다. 그 결과 BMP6의 mRNA 발현이 60.7%로 감소하였으며, FGF7과 FGF10은 각각 77.9%, 52.0%로 mRNA 발현이 감소하였다. 하지만 β-catenin mRNA 발현에는 큰 영향을 미치지 않았다(Fig.
- 그 결과 제1형 5α-reductase mRNA 발현에는 큰 영향을 나타내지 않았으나, 놀랍게도 제2형 5α-reductase mRNA 발현은 48.5%로 감소하였다.
- 또한 白首烏의 처리 농도를 증가시킨 경우 모 유두 세포의 제2형 5α-reductase mRNA 발현량이 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다.
- 白首烏가 모유두 세포의 세포활성도에 미치는 효과를 확인하기 위하여 미토콘드리아의 NADH, NADPH 생성량을 측정하는 MTS assay를 실시하였다. 모유두 세포에 白首烏를 24 시간 처리한 결과 0.25 mg/ml, 1 mg/ml의 白首烏는 모유두 세포의 세포 활성도를 103.6%, 107.6%로 증가시켰으며, 0.5 mg/ml 농도의 白首烏는 특히 가장 높은 수치인 118.5%로 세포활성도를 증가시켰다. 반면 2 mg/ml 농도의 白首烏는 82.
- 5α-reductase 활성을 억제하여 남성형 탈모를 치료하는 약물인 finasteride는 치료에 장기간 적용할 경우 성욕 감퇴, 발기력 저하, 남성의 여성형 유방, 사정량 감소 등의 부작용이 나타나는 것으로 알려져 있다37) . 본 연구 결과들을 통해, 저자는 白首烏는 기존의 만성형 탈모 치료제인 finasteride처럼 적용할 수 있는 것으로 사료된다. 추후 白首烏를 in vivo에 적용하여 모발의 형성 및 탈모의 치료 효과를 검증할 필요가 있으며, 본 연구 결과에서 白首烏 처리에 의해 나타난 모유두 세포의 미토콘드리아 활성도 증가 및 BMP6, FGF7, FGF10 mRNA 발현량의 변화가 발모 및 탈모 치유 작용에 미치게 되는 영향 또한 검증할 필요가 있을 것으로 생각된다.
- 이러한 이유로 白首烏 가 활성산소에 미치는 작용을 ABTS assay를 통해 확인하였다. 항산화 효능이 잘 알려진 resveratrol을 이용하여 ABTS assay를 진행한 결과 농도의존적으로 ABTS 라디칼 소거능을 보였으며, 이를 통해 실험 시스템을 검증할 수 있었다. 白首烏의 ABTS 라디칼 소거 효능 또한 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 이 결과를 통해 白首烏의 항산화 효능을 확인할 수 있었다(Fig.
후속연구
- 그 결과 白首烏는 농도 의존적인 ABTS 라디칼 소거능을 나타내었다. 白首烏의 항산화 효능이 세포 및 실제 사람의 발모에 작용하여 미치는 영향은 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 따라서 0.5 mg/ml 白首烏에 의한 모유두 세포의 세포활성도 증가는 세포 내 미토콘드리아 활성에 의해 나타난 것으로 생각된 다. 다음과 같은 작용이 나타나게 된 메커니즘과 모발의 생성 및 성장에 미치는 영향은 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 하지만 白首烏는 모발 생성을 촉진시키는 FGF7, FGF10의 mRNA 발현 또한 억제하였다. 이러한 이유로 白首烏의 작용이 최종적으로 모발 생성 주기에 미치게 될 영향은 추가적인 연구가 필요하다.
- 본 연구 결과들을 통해, 저자는 白首烏는 기존의 만성형 탈모 치료제인 finasteride처럼 적용할 수 있는 것으로 사료된다. 추후 白首烏를 in vivo에 적용하여 모발의 형성 및 탈모의 치료 효과를 검증할 필요가 있으며, 본 연구 결과에서 白首烏 처리에 의해 나타난 모유두 세포의 미토콘드리아 활성도 증가 및 BMP6, FGF7, FGF10 mRNA 발현량의 변화가 발모 및 탈모 치유 작용에 미치게 되는 영향 또한 검증할 필요가 있을 것으로 생각된다.
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