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문제 정의
- 이에 저자는 加味腎氣丸이 남성에게 노화로 인해 나타날 수 있는 남성갱년기의 생식기능 감소 증상 에 대한 개선효과를 알아보기 위해 조직화학 및 면역조직화학적 연구방법을 이용하여 연구를 진행하였다.
- 이에 저자는 加味腎氣丸이 수컷 노화 생쥐의 생식기능에 미치는 영향을 알아보기 위해 조직화학 및 면역조직화학적 방법을 이용하여 정자생성효과, 남성호르몬 생성효과, 산화스트레스 조절효과로 나누어 연구를 진행하였다.
제안 방법
- 0.05% 3,3'-diaminobenzidine과 0.01% HCl이 포함된 0.05Mtris-HCl 완충용액 (pH 7.4)에서 발색시킨 후, hematoxylin으로 대조염색하였다.
- Anti-digoxigenin-peroxidase에 1시간 동안 반응시킨 후 DAB를 처리하였다. Methyl green으로 대조염색한 후 광학현미경으로 관찰하였다.
- 우선 50-60℃ Bouin 용액에서 1시간동안 매염 처리한 다음 70% 에탄올에서 picric acid를 제거하였다. Weigert iron hematoxylin에서 10분 동안 반응시켜 핵 염색하고, biebrich scalet-acid fuchsin와 phosphomolybdic-phosphotungstic acid에서 각각 15분간, aniline blue에 5분간 처리한 후 광학현미경 (BX50. Olympus, Japan)으로 관찰하였다.
- 加味腎氣丸(Gami-Shinkiwhan, GS) 470 g을 증류수 2000 ㎖과 함께 round flask에 넣고 2시간 동안 가열 추출하였으며, 추출액은 rotary evaporator(Eyela, Japan)로 감압 농축한 후 동결건조기로 건조하여 분말 28.9 g을 제조하였다.
- 加味腎氣丸의 산화스트레스 조절을 통한 정자 형성변화를 조사하기 위해 항 DJ-1를 이용한 면역조직화학을 실시하였다. 노화군의 정세관 내강에서 DJ-1 양성반응을 보이는 정자세포는 정상군에 비해 75% 감소하였다.
- 면역조직화학과 TUNEL assay의 결과는 image Pro Plus(Media cybernetics, USA)를 이용한 영상분석을 통해 수치화(means ± standard error) 했다. 각 군의 표본에서 임의로 선정된 피부를 x200배율에서 촬영한 다음 positive pixels/20,000,000pixels로 영상분석 하였다. 면역조직화학 결과의 통계는 SPSS software (SPSS 20, SPSS Inc.
- 흰쥐를 ether로 마취하여 하복부를 절개하고 고환을 적출하였다. 고환 주위의 지방을 제거한 고환조직을 실온에서 24시간동안 10% NBF에 고정하였고, 고정된 조직은 통상적인 방법으로 paraffin에 포매한 후 5 ㎛ 두께의 연속절편으로 제작되었다.
- 고환에 분포하는 정세관 변화를 관찰하기 위해 Masson trich rome 염색을 실시하였다. 우선 50-60℃ Bouin 용액에서 1시간동안 매염 처리한 다음 70% 에탄올에서 picric acid를 제거하였다.
- 그리고 1차 항체인 mouse anti-BrdU(1:100, Santa Cruz Biotec), mouse anti-AR (1:100, Santa Cruz Biotec, USA)와 mouse anti-17β-HSD (1:100, Santa Cruz Biotec), mouse anti-DJ-1 (1:100, Santa Cruz Biotec), 그리고 mouse anti-HDAC3 (1:100, Santa Cruz Biotec)에 4℃ humidified chamber에서 72시간 동안 반응시켰다.
- 정상군은 아무런 처치를 하지 않은 8주령의 ICR계 생쥐로 구성하였고, 노화군과 加味腎氣丸군은 12개월의 ICR계 생쥐로 구성하였다. 노화군은 6개월 동안 아무런 처치 없이 식이와 음수에 제약을 두지 않았고, 加味腎氣丸군은 加味腎氣丸(0.56g/kg)을 D.W에 녹여 하루 1회씩 6개월 동안 투여하였다.
- 대표적인 補腎 처방인 腎氣丸에 6종의 한약재를 가미한 加味腎氣丸이 노화로 인해 발생하는 남성갱년기의 생식기능 감소증상에 미치는 영향을 검증하고자 정자생성효과, 남성호르몬 생성효과, 산화스트레스 조절효과에 대하여 실험하였다.
- 사이질 내 Leydig 세포의 testosterone 생성 변화를 측정하기 위해 항 17β-HSD를 이용한 면역조직화학을 실시하였다.
- 산화스트레스 조절에 따른 정세관내 sertoli 세포 활성을 조사하기 위해 항 HDAC3를 이용한 면역조직화학을 실시하였다. 노화군 정세관의 sertoli 세포에서 HDAC3 양성반응은 정상군에 비해 159% 증가하였다.
- 실험군은 정상군(control group), 노화군(aging-elicited group, AE group), 加味腎氣丸군(Gami-Shinkiwhan treatment group, GS group) 총 3군으로 분류하였다.
- 정세관내 정자와 sertoli 세포의 분포 변화를 관찰하기 위해 Masson trichrome 염색을 실시하였다. 노화군의 정세관에서 sertoli 세포의 소실과 정세관 내강 내 생성정자 분포의 감소가 관찰되었으나, 加味腎氣丸은 노화군에 비해 유의하게 많은 수의 sertoli 세포와 생성정자의 분포를 보였다.
- 정자생성을 위한 정조세포의 세포분열 변화를 측정하기 위해 항 BrdU를 이용한 면역조직화학을 실시하였다. 노화군의 정세관기저부에서 BrdU양성반응을 보이는 정조세포는 정상군에 비해 72% 감소하였다.
- 정자형성에 관여하는 sertoli 세포의 활성 변화를 측정하기 위해 항 androgen receptor(AR)를 이용한 면역조직화학을 실시하였다. 노화군 정세관의 sertoli 세포에서 AR 양성반응은 정상군에 비해 78% 감소하였다.
- 흰쥐를 ether로 마취하여 하복부를 절개하고 고환을 적출하였다. 고환 주위의 지방을 제거한 고환조직을 실온에서 24시간동안 10% NBF에 고정하였고, 고정된 조직은 통상적인 방법으로 paraffin에 포매한 후 5 ㎛ 두께의 연속절편으로 제작되었다.
대상 데이터
- 8주령의 수컷 ICR계 생쥐(샘타코, 한국)를 구입한 후 온도 23±℃, 습도 55±5%의 항온항습실에 적응시킨 후 사용하였고, 실험기간동안 사료와 음수는 자유 섭취케 하였다.
- 정상군은 아무런 처치를 하지 않은 8주령의 ICR계 생쥐로 구성하였고, 노화군과 加味腎氣丸군은 12개월의 ICR계 생쥐로 구성하였다. 노화군은 6개월 동안 아무런 처치 없이 식이와 음수에 제약을 두지 않았고, 加味腎氣丸군은 加味腎氣丸(0.
데이터처리
- 면역조직화학 결과의 통계는 SPSS software (SPSS 20, SPSS Inc., USA)를 이루어졌으며, one-wayANOVA 시행을 통해 유의성 (p<0.05)을 검증하고 Duncan’smultiple range test로 사후 검증하였다.
- 면역조직화학과 TUNEL assay의 결과는 image Pro Plus(Media cybernetics, USA)를 이용한 영상분석을 통해 수치화(means ± standard error) 했다.
이론/모형
- sertoli 세포의 세포자기살해(apoptosis) 변화를 측정하기 위해 TUNEL assay를 실시하였다. 노화군의 정세관에서 apoptosis된 sertoli 세포는 정상군에 비해 710% 증가하였다.
- 고환 내 apotosis 변화를 관찰하기 위해 in situ apoptosis d etection kit (Apoptag, Intergen, USA)를 이용한 TUNEL (terminal deoxynucleotid transferase-mediated dUTP-biotin nick-end labelling) 방법을 실시하였다. 먼저 조직 절편을 proteinase K에 5분간 proteolysis 시킨 다음 equilibration buffer에서 20초간 처리하였다.
성능/효과
- AR 양성반응과 17β-HSD 양성반응은 노화군에 비해 加味腎氣丸군에서 유의하게 증가되었다.
- AR 양성반응과 17β-HSD 양성반응이 加味腎氣丸군에서 노화 군에 비해 증가되었다는 결과는 곧 加味腎氣丸으로 인해 testosterone 생성이 증가되었다는 의미로, 이를 통해 加味腎氣丸이 노화로 인한 남성갱년기의 testosterone 감소를 개선하는 효과를 가진다는 것을 알 수 있다.
- 정자형성에 관여하는 sertoli 세포의 활성 변화를 측정하기 위해 항 androgen receptor(AR)를 이용한 면역조직화학을 실시하였다. 노화군 정세관의 sertoli 세포에서 AR 양성반응은 정상군에 비해 78% 감소하였다. 이에 반해 加味腎氣丸군은 노화군에 비해 197%의 유의한 양성반응 증가를 보였다.
- 산화스트레스 조절에 따른 정세관내 sertoli 세포 활성을 조사하기 위해 항 HDAC3를 이용한 면역조직화학을 실시하였다. 노화군 정세관의 sertoli 세포에서 HDAC3 양성반응은 정상군에 비해 159% 증가하였다. 이에 반해 加味腎氣丸군은 노화군에 비해 38%의 유의한 양성반응 감소를 보였다.
- 노화군사이질의 Leydig 세포에서 17β-HSD 양성반응은 정상군에 비해 79% 감소하였다.
- 노화군에 비해 加味腎氣丸군에서 sertoli 세포와 생성정자, 정조세포의 세포분열은 증가하였고, sertoli 세포의 apoptosis는 감소되었다.
- 加味腎氣丸의 산화스트레스 조절을 통한 정자 형성변화를 조사하기 위해 항 DJ-1를 이용한 면역조직화학을 실시하였다. 노화군의 정세관 내강에서 DJ-1 양성반응을 보이는 정자세포는 정상군에 비해 75% 감소하였다. 이에 반해 加味腎氣丸군은 노화군에 비해 206%의 유의한 분포 증가를 보였다.
- sertoli 세포의 세포자기살해(apoptosis) 변화를 측정하기 위해 TUNEL assay를 실시하였다. 노화군의 정세관에서 apoptosis된 sertoli 세포는 정상군에 비해 710% 증가하였다. 이에 반해 加味腎氣丸군은 노화군에 비해 56%의 유의성 있는 분포 감소를 보였다.
- 정세관내 정자와 sertoli 세포의 분포 변화를 관찰하기 위해 Masson trichrome 염색을 실시하였다. 노화군의 정세관에서 sertoli 세포의 소실과 정세관 내강 내 생성정자 분포의 감소가 관찰되었으나, 加味腎氣丸은 노화군에 비해 유의하게 많은 수의 sertoli 세포와 생성정자의 분포를 보였다.
- 다음으로 산화스트레스의 조절을 통한 정자 형성변화 및sertoli 세포의 활성 조사실험에서 加味腎氣丸군은 노화군에 비해 DJ-1 양성반응은 유의하게 증가하였고, HDAC3 양성반응은 감소하였다.
- 또한 腎精은 生殖, 氣血生成, 臟腑, 經絡의 滋養, 精神活動의 基礎, 外邪의 防禦 기능을 가지고 있다16). 따라서 加味腎氣丸이 노화로 인한 생식기능 감소를 강화된 補腎의 작용을 통하여 개선시킬 수 있다고 판단하였고, 加味腎氣丸이 남성 갱년기의 증상 중 성기능 감소증상과 노화 증상에 효과가 있다는 기존 연구를 바탕으로 남성갱년기의 생식기능 감소증상에도 효과가 있을 것이라 생각하였다.
- . 따라서 정세관에서의 DJ-1양성반응 증가는 정세관 내의 세포가 항산화성 샤페론의 기능을 통해 사멸로부터 보호받았다는 것으로, 加味腎氣丸이 산화스트레스를 조절함으로써 정세관내 세포의 사멸을 방지하여 생식기능을 개선시킨다는 사실을 알 수 있다.
- 또한 DJ-1 양성반응은 노화군에 비해 加味腎氣丸군에서 유의하게 증가되었으며, HDAC3 양성반응은 유의하게 감소되었다.
- 먼저, 정세관내 정자와 sertoli 세포의 분포 변화를 관찰하기 위해 Masson trichrome 염색을 실시한 결과, 加味腎氣丸군이 노화군에 비해 많은 sertoli 세포와 생성정자의 분포를 보였다. 정자생성을 위한 정조세포의 세포분열 변화를 측정하기 위해 실시한 항BrdU를 이용한 면역조직화학 결과, BrdU양성반응이 노화군에 비해 加味腎氣丸군에서 증가되어 나타났다.
- 위의 결과를 종합해 보면, 加味腎氣丸은 정세관에서 정세관내 세포와 sertoli 세포의 사멸을 방지하고, sertoli 세포와 생성정자를 증가시키며, testosterone의 생성을 증가시킴으로써 노화로 인해 발생하는 남성갱년기의 생식기능 장애를 개선시키는 것으로 생각된다.
- 이상의 결과를 토대로 할 때, 加味腎氣丸은 정세관에서 정세관 내 세포와 sertoli 세포의 apoptosis를 방지하고, sertoli 세포와 생성정자, testosterone의 생성을 증가시킴으로써 노화로 인해 발생하는 남성갱년기의 생식기능 장애를 개선하는 것으로 생각된다.
- 먼저, 정세관내 정자와 sertoli 세포의 분포 변화를 관찰하기 위해 Masson trichrome 염색을 실시한 결과, 加味腎氣丸군이 노화군에 비해 많은 sertoli 세포와 생성정자의 분포를 보였다. 정자생성을 위한 정조세포의 세포분열 변화를 측정하기 위해 실시한 항BrdU를 이용한 면역조직화학 결과, BrdU양성반응이 노화군에 비해 加味腎氣丸군에서 증가되어 나타났다. 이는 加味腎氣丸이 고환에서 sertoli 세포와 생성정자를 증가시킨다는 의미이며 이를 통해 노화로 인해 발생한 남성갱년기의 정자생성의 감소를 개선하는 효과가 있다는 것을 알 수 있다.
- HDAC이 sertoli 세포에서 어떻게 작용하는지에 대한 구체적인 기전은 아직 밝혀진 바가 없지만, sertoli 세포에서 HDAC3 양성반응이 감소되었다는 사실로써 HDAC이 sertoli cell의 유전자 전사에 관여한다는 사실을 알 수 있으며, 이는 HDAC3의 작용 억제로 인해 정자형성과정에 관여하는 sertoli 세포의 유전자 전사가 영향을 받아 sertoli 세포의 생성이 증가된 것으로 생각할 수 있다. 즉, 加味腎氣丸이 sertoli 세포의 생성에 관여함으로써 노화로 인한 생식기능을 개선시킨다는 사실을 알 수 있다.
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