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문제 정의
- 따라서 본 연구는 항산화제인 melatonin, silymarin, curcumin 및 vitamin E가 arsenite에 의해 손상된 돼지 정자의 운동성, 원형질막 온전성, 미토콘드리아 기능성 및 지질과산화에 미치는 영향을 검토하였다.
- 이러한 독성물질은 생명체의 대사 및 성장 등과 같은 생리활성에 영향을 미치게 되며, 특히 인체 및 동물에서의 노출은 생식세포의 기능 및 호르몬의 변화를 일으켜 난임을 포함한 번식 장애 및 내분비계의 교란을 유발할 뿐만 아니라, 각종 암을 비롯하여 체내의 여러 기관의 악영향을 미쳐, 우리의 삶의 위협을 주고 있다. 본 연구는 환경오염물질에서 발생하는 독성물질인 arsenite가 포유동물 웅성 생식세포인 정자에 미치는 영향에 대해 알아보았으며, 이러한 악영향을 해결하기 위한 방법으로 항산화제인 melatonin, silymarin, silymarin 및 vitamin E를 처리함으로써 정자의 성상을 검사함으로써 간접적으로 정자의 수정능력을 판단하기 위해 실시하였다.
제안 방법
- 30분간 배양 후, 20 μl 정자 부유액을 slide glass에 분주한 후, cover glass를 덮고 위상차 현미경(Nikon, Japan) 400배율 하에서 육안검사를 통해 정자의 원형질막 온전성을 검사하였다.
- 각 처리구의 정액 20 μl을 slide glass에 분주 후, cover glass를 덮고, 위상차 현미경(Nikon, Japan) 400배 하에서 육안검사를 통해 운동성을 검사하였다.
- 배양 된 정자는 37℃에 10분간 미리 가온 시킨 slide glass에서 운동성을 평가하였다. 각 처리구의 정액 20 μl을 slide glass에 분주 후, cover glass를 덮고, 위상차 현미경(Nikon, Japan) 400배 하에서 육안검사를 통해 운동성을 검사하였다.
- 배양 후 정자 부유액 20 μl를 slide glass에 분주한 후, Cover glass를 덮고 형광현미경(Ziess, Germany)으로 490/515 nm의 조건하에서 R123을 조사하였고, 545/590 nm 조건 하에서 PI를 조사하였으며, 정자의 중편부의 염색의 유무를 기준으로 미토콘드리아 기능을 검사하였다.
- 이후, 상층액 1 ml을 회수하여 250 μl의 1% TBA 를 첨가하고, 100℃에서 10분간 중탕하고, 상온에서 냉각시킨 뒤 MDA의 수치를 측정하였다.
- 전처리된 정액의 농도를 D-PBS를 이용하여 2×107 정자/ml 으로 희석한 후, 1 ml의 정자 부유액에 1mM ferrous sulfate와 5mM sodium ascorbate을 각각 10 μl씩 첨가하고, 37℃, 5% CO2 조건 하에 1시간 동안 배양하였다.
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정자 지질과산화(Lipid peroxidation; LPO) 측정
정자의 지질과산화는 thiobarbituric acid (TBA)의 반응을 통한 malondialdehyde (MDA)의 수치를 측정하였다[14]. 전처리된 정액의 농도를 D-PBS를 이용하여 2×107 정자/ml 으로 희석한 후, 1 ml의 정자 부유액에 1mM ferrous sulfate와 5mM sodium ascorbate을 각각 10 μl씩 첨가하고, 37℃, 5% CO2 조건 하에 1시간 동안 배양하였다.
- 정자의 처리는 Modena 희석액을 사용하여 정액의 농도를 3×106정자/ml으로 희석 후 대조구(Control), 100 μM arsenite 단독 처리구, 항산화제 단독 처리구(100 nM melatonin, 10 μM silymarin, 2 μM silymarin, 500 μM vitamin E) 및 arsenite와 항산화제 동시 처리구를 37℃, 5% CO2 조건 하에 3, 6 및 9시간 배양 후, 정자의 운동성, 원형질막의 온전성, 미토콘드리아 기능성 및 지질과산화를 검사하였다.
대상 데이터
- 강원도 원주 영서 돼지 인공수정센터의 3원교잡종(Duroc×Yorkshire×Landrace) 돼지의 음경수압법으로 채취한 정액을 사용하였으며, 정자의 운동성이 85% 이상인 정자를 Modena 희석액으로 1×107정자/ml로 희석하여, 17℃에 보관하며 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 각 처리구의 정액 20 μl을 slide glass에 분주 후, cover glass를 덮고, 위상차 현미경(Nikon, Japan) 400배 하에서 육안검사를 통해 운동성을 검사하였다. 각 처리된 정자를 정자 미부의 움직임의 유무를 기준으로 3회 반복 측정 하였으며, 운동성의 평균값을 백분율로 계산하여 나타냈다.
- 본 실험에서 얻어진 결과에 모든 값은 3회 이상의 반복실험의 측정값의 평균±표준오차로 나타내었으며, 실험 결과 값에 대한 통계적 분석은 처리구별 비교를 위하여 Statistics Analysis System (SAS) package 9.2를 이용하여 Duncan’s Multiple Range Test 방법으로 첨가구간의 유의성을 검정하였으며, p 값이 0.05 수준 이상인 것을 통계적 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
이론/모형
- 정자의 미토콘드리아 기능성을 검사하기 위해 Rhodamine 123 (R123), propidium iodide (PI) 이중 형광 염색법을 사용하였다. 각 처리구의 정자 부유액 500 μl에 30 μl의 5 mg/ml R123을 첨가 후, 37℃, 5% CO2 조건의 암실에서 15분간 배양 시킨 뒤, 10 μl의 0.
성능/효과
- Arsenite가 된 정자에 항산화를 첨가하였을 때 모든 처리구에 유의적으로 높은 결과를 나타냈다(p< 0.05).
- 결론적으로, arsenite는 돼지정자에서 산화스트레스를 유도하여, 정자 원형질막의 손상과 지질과산화를 증가시키고, 정자의 운동성 및 미토콘드리아의 기능을 포함한 정자의 특성에 유해한 영향을 미치는 것을 확인하였으며, 이는 정자의 수정능력 감소와 관련이 있을 것으로 판단된다. 반면에, 항산화제인 melatonin, silymarin, silymarin 및 vitamin E는 arsenite에 의해 손상된 정자의 기능을 향상시켜주는 것을 나타내는 것을 확인하였고, 이는 항산화제가 정자의 기능의 향상 및 수정능력에 유익한 역할을 할 것으로 판단된다.
- 또한 항산화제 동시 처리구는 arsenite 단독처리구와 비교하였을 때, 미토콘드리아의 활성이 유의적으로 증가하였다 (p<0.05).
- 또한, arsenite에 노출된 정자에 100 nM melatonin, 2 μM silymarin, 10 μM silymarin 및 500 μM vitamin E를 처리하였을 때, arsenite 단독 처리구보다 유의적으로 높은 결과를 보였다.
- 결론적으로, arsenite는 돼지정자에서 산화스트레스를 유도하여, 정자 원형질막의 손상과 지질과산화를 증가시키고, 정자의 운동성 및 미토콘드리아의 기능을 포함한 정자의 특성에 유해한 영향을 미치는 것을 확인하였으며, 이는 정자의 수정능력 감소와 관련이 있을 것으로 판단된다. 반면에, 항산화제인 melatonin, silymarin, silymarin 및 vitamin E는 arsenite에 의해 손상된 정자의 기능을 향상시켜주는 것을 나타내는 것을 확인하였고, 이는 항산화제가 정자의 기능의 향상 및 수정능력에 유익한 역할을 할 것으로 판단된다. 그러나 본 실험에 사용된 항산화제의 항산화력 및 유전자의 활성 변화에 관한 연구를 지속적으로 평가하여, 항산화력 능력에 의한 독성보호가 이루어지는가에 관한 연구를 수행할 필요성이 있다고 판단된다.
- 또한 arsenite에 노출 된 쥐의 testosterone 및 LH 호르몬의 감소와 지질과산화의 수치가 증가하였다[3]. 본 실험에서 arsenite는 돼지정자의 원형질막의 지질과산화의 수치가 가장 높게 측정 되었으며, arsenite는 돼지정자의 산화스트레스를 유도하여 지질과산화를 증가시키고, 돼지정자의 유해한 영향을 미치는 것으로 나타났다. 또한 arsenic에 의해 증가된 지질과산화는 항산화제를 이용하여 arsenic로부터 발생하는 지질과산화를 완화시켜줄 수 있을 것으로 판단된다.
- 고도 불포화지방산으로 이루어진 정자의 원형질막은 산화스트레스에 민감하게 반응하여 정자의 지질과산화를 유도하여, 정자의 수정능력에 유해한 영향을 미친다[8]. 본 실험에서 arsenite의 독성에 의한 돼지 정자의 원형질막 온전성은 유의적으로 감소하였으며, 이러한 결과는 arsenite가 산화스트레스에 민감한 돼지정자의 원형질막에 손상을 주고, 원형질 막의 손상은 정자의 활성산소와 지질과산화를 증가 시킨 것으로 판단된다.
- 실제로 미토콘드리아는 arsenic에 의해 생성되는 활성산소와 산화스트레스를 억제하는 항산화 효소가 활성이 되는 세포 소기관으로 미토콘드리아 활성 감소는 과도한 활성산소와 산화스트레스를 조절하지 못하게 되어 cytochrome C 및 caspase 3를 활성화 시켜 DNA 손상뿐 아니라 세포사멸을 유도하게 된다[9]. 본 실험에서는 arsenite가 활성산소를 유도하여 정자의 미토콘드리아의 DNA의 손상 및 미토콘드리아 ATP 생성의 감소를 통해 정자의 기능이 감소하는 것으로 판단하였으며, 정자의 수정능력에도 유해한 영향을 미치는 것으로 판단된다. Arsenic에 의해 손상된 미토콘드리아는 과도한 활성산소와 산화스트레스를 감소시키지 못하여 정자의 운동성과 생존성을 감소시켜 최종적으로는 정자의 수정율이 감소된다.
- 이전 연구에 의하면, arsenite에 의한 쥐의 정자의 운동성 및 정자 수의 감소와 정자 생존성에서 유의적인 감소를 나타냈으며, 항산화제는 arsenite의 독성을 어느 정도 감소시킨다고 보고 하였다[8, 24, 29]. 본 실험에서도 arsenite에 의한 돼지정자의 운동성이 감소하는 것이 나타났으며, arsenite는 정자에 유해한 영향을 미치는 것으로 판단된다.
- 원형질막 온전성은 대조구와 비교하여 100 μM arsenite 단독 처리구에서 유의적으로 감소하였고, 항산화제인 100 nM melatonin, 2 μM silymarin, 10 μM silymarin 및 500 μM vitamin E를 단독으로 처리하였을 때 대조구와 비교하였을 때 유의적으로 높은 결과를 나타냈다(p<0.05).
- 정자 운동성은 대조구(3시간, 77.3±2.6%; 6시간, 50.0±2.9%; 9시간, 34.3±2.9%)와 비교하여 100 μM arsenite를 단독으로 처리하였을 때(3시간, 33.3±1.5%; 6시간, 18.3±1.5%;9시간, 3.7±0.9%) 유의적으로(p<0.05) 감소하였고, 100 nM melatonin, 2 μM silymarin, 10 μM silymarin 및 500 μM vitamin E를 첨가하였을 때 대조구와 비교해 3 및 6시간에서 증가하는 경향을 나타내었지만 9시간에서는 유의적인 차이는 나타나지 않았다.
- 정자의 미토콘드리아 활성은 대조구와 비교하여 100 μM arsenite 단독 처리구에서 유의적으로 감소하였지만, 항산화제 단독 처리구와 대조구와 비교하였을 때, 유의적인 차이는 나타나지 않았다(p< 0.05).
- 배양 후 정자 부유액 20 μl를 slide glass에 분주한 후, Cover glass를 덮고 형광현미경(Ziess, Germany)으로 490/515 nm의 조건하에서 R123을 조사하였고, 545/590 nm 조건 하에서 PI를 조사하였으며, 정자의 중편부의 염색의 유무를 기준으로 미토콘드리아 기능을 검사하였다. 정자의 중편부가 녹색을 띄는 정자는 미토콘드리아의 기능이 정상적인 정자로 판정하였으며, 정자의 중편부가 적색을 띄는 정자는 미토콘드리아 기능이 약한 정자로 판정하였다.
- 정자의 지질과산화는 대조구와 비교하여 100 μM arsenite 단독 처리구에서 유의적으로 높은 결과를 나타냈고(p<0.05), 항산화제 단독 처리구는 대조구와 비교하여 유의적인 차이는 없었지만, 항산화제 동시 처리구는 100 μM arsenite 단독 처리구와 비교하였을 때 유의적으로 낮은 결과를 나타냈다(p<0.05).
- Arsenic에 의해 손상된 미토콘드리아는 과도한 활성산소와 산화스트레스를 감소시키지 못하여 정자의 운동성과 생존성을 감소시켜 최종적으로는 정자의 수정율이 감소된다. 하지만 본 연구에서는 arsenic에 의해 감소된 미토콘드리아의 활성이 항산화제에 의해서 증가한 것을 확인하였으며, 이러한 결과는 항산화제가 정자의 수정율을 향상시킬 수 있을 것이라 생각된다.
후속연구
- 반면에, 항산화제인 melatonin, silymarin, silymarin 및 vitamin E는 arsenite에 의해 손상된 정자의 기능을 향상시켜주는 것을 나타내는 것을 확인하였고, 이는 항산화제가 정자의 기능의 향상 및 수정능력에 유익한 역할을 할 것으로 판단된다. 그러나 본 실험에 사용된 항산화제의 항산화력 및 유전자의 활성 변화에 관한 연구를 지속적으로 평가하여, 항산화력 능력에 의한 독성보호가 이루어지는가에 관한 연구를 수행할 필요성이 있다고 판단된다.
- 본 실험에서 arsenite는 돼지정자의 원형질막의 지질과산화의 수치가 가장 높게 측정 되었으며, arsenite는 돼지정자의 산화스트레스를 유도하여 지질과산화를 증가시키고, 돼지정자의 유해한 영향을 미치는 것으로 나타났다. 또한 arsenic에 의해 증가된 지질과산화는 항산화제를 이용하여 arsenic로부터 발생하는 지질과산화를 완화시켜줄 수 있을 것으로 판단된다.
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