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문제 정의
- MEJG 처리에 의한 HT29 세포의 사멸효과의 기전을 확인하기 위하여 MEJG가 HT29 세포의 apoptosis를 유도하는지 분석하였다. Apoptosis가 유발된 세포에서는 세포막의 점도 감소, 유동성 증가 및 막 인지질의 비대칭성 소실로 인하여 정상적으로는 지질 이중막의 내부에 존재하는 포스파티딜세린(PS)이 세포 표면으로 노출된다[8, 21].
- globiflora의 항산화능과 항암 활성 등 다양한 생리활성에 관한 연구는 알려진 바가 없다. 따라서 본 연구에서는 J. globiflora의 메탄올 추출물을 사용하여 항산화능 및 인체 대장암세포주인 HT29에 대한 항암활성과 그 분자적 기전에 관하여 분석하였다.
- 현재 암에 대한 많은 연구가 진행되고 있음에도 불구하고 암 자체의 다양성 및 발병기전의 다양화로 인해 부작용이 적고 내성을 극복할 수 있는 새로운 항암제의 개발은 여전히 필요하며, 그에 맞추어 새로운 천연물 의약품 연구가 활발히 진행되고 있다[2, 36]. 본 연구에서는 부작용이 적은 천연물 의약품 개발에 있어 후보 물질을 선별하기 위해, 자생식물 중 J. globiflora 메탄올 추출물의 항산화 효과 및 대장암 세포에 대한 항암기전을 분석하였으며, 그 결과 MEJG가 강력한 항산화능을 가지며, 인체 대장암 세포주 HT29의 apoptosis 유도에 의한 항암 효과를 보이는 것을 확인하였다. 이러한 연구결과는 J.
제안 방법
- 48시간 배양 후 세포를 회수하고 Muse™ Annexin V ＆ Dead Cell Reagent 100 μl를 첨가하여 실온에서 20분간 반응한 다음, Muse™ Cell Analyzer(Merck Millipore, Germany)로 분석하였다.
- MEJG 처리에 따른 HT29 세포의 apoptosis 유도를 관찰하기 위하여, HT29 세포에 농도 별로 추출물을 처리한 다음 Muse™ Annexin V ＆ Dead Cell Kit (Merck Millipore, Germany)를 사용하여 염색하였다.
- MEJG 처리에 의한 HT29 세포의 형태학적 분석을 위하여 6-well plate에 1-2×105 cells/well을 각각 분주하고 24시간 뒤 MEJG를 적정 농도로 처리 후 48시간 동안 배양하였다.
- MEJG가 암세포 생존에 미치는 영향을 확인하기 위하여 수용성의 water soluble tetrazolium salt (WST) assay를 수행하였다. 먼저 암세포주인 HT29, A549, HepG2 세포 및 정상세포주인 IMR90, HEK293 세포를 3-5×104 cells/well의 농도로 24-well plate에 분주하여 24시간 배양한 다음, 추출물을 농도별로 처리하고 37℃에서 48시간동안 배양하였다.
- MEJG에 의한 apoptosis 유발의 분자기전을 확인하기 위하여 HT29 세포에 MEJG를 농도별로 처리한 다음, apoptosis 관련 단백질의 발현변화를 Western blot analysis로 관찰하였다. 그 결과 Fig.
- MEJG의 항산화능 보유 유무를 확인하기 위하여 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radical 소거법을 이용한 전자공여능을 측정하였다. MEJG를 농도별(2.
- MEJG의 항암활성을 확인하기 위하여 먼저 WST assay를 사용하여 다양한 암세포에 대한 MEJG의 사멸효과를 관찰하였다. 이때 암세포는 인체 대장암 세포 HT29, 폐암세포 A549 및 간암세포 HepG2를 사용하였으며, 정상세포로는 인체 폐섬유아세포 IMR90과 인체 배아신장세포 HEK293을 사용하였다.
- Membrane washing 후 Horse radish peroxidase (HRP)가 tagging된 이차항체로 한 시간 동안 반응시킨 후 Western blotting luminol reagent (Santa Cruz Biotechnology, USA)를 적용시킨 다음 chemiluminescence detection system (FluoChem®FC2; AlphaInnotech, USA)을 사용하여 분석하였다.
- cells/well을 각각 분주하고 24시간 뒤 MEJG를 적정 농도로 처리 후 48시간 동안 배양하였다. 그 후 도립현미경(Axiovert 40C; Carl ZEISS, Germany)을 사용하여 100배의 배율로 관찰하였으며, Axio Vision program을 사용하여 촬영하였다.
- 따라서 HT29 세포에 MEJG를 농도별로 처리한 다음 Muse Annexin V & Dead Cell Kit를 사용하여 Annexin V positive 세포의 빈도를 측정하였다.
- 먼저 암세포주인 HT29, A549, HepG2 세포 및 정상세포주인 IMR90, HEK293 세포를 3-5×104 cells/well의 농도로 24-well plate에 분주하여 24시간 배양한 다음, 추출물을 농도별로 처리하고 37℃에서 48시간동안 배양하였다.
- 따라서 다양한 생리활성 특히 항암활성을 보유하는 후보 소재의 개발을 위하여 항산화능 보유 유무의 확인은 매우 중요하다[4]. 본 연구에서는 DPPH radical scavenging activity 측정을 통해 MEJG의항산화능을 분석하였다. 그 결과 Table 1에 제시한 바와 같이MEJG의 농도가 증가함에 따라 DPPH radical 억제능이 0.
- 5×10-4 M DPPH 40 μl와 각 시료 160 μl를 분주한 혼합액을 실온에서 30분간 반응시킨 후, microplate reader (Molecular Devices, USA)를 이용하여 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료를 첨가하지 않은 음성 대조군과 비교하여 free radical 소거활성을 백분율로 나타내고, 50% 저해 농도(IC50)를 계산하였다. 양성 대조군으로는 대표적인 항산화제인 ascorbic acid를 사용하였으며 측정값은 3회 반복 실험의 평균값으로 나타내었다.
- Apoptosis가 일어난 세포의 주요한 형태적 특징 중 하나인 apoptotic body (사멸체)는 apoptosis에 의해 세포막이 파괴되고 핵 내 nucleosome의 linker DNA 부분이 절단되어 단편화가 일어나고 이에 따른 염색질이 응축되어 생성된다[28]. 앞서 MEJG에 의해 HT29 세포의 apoptosis가 유도되는 것을 확인하였으므로, 다음으로 세포 핵 내의 변화를 관찰하기 위하여 HT29 세포에 추출물을 농도별로 처리한 다음 DAPI 염색을 실시하여 형광현미경을 이용하여 관찰하였다. 그 결과, Fig.
- 먼저 암세포주인 HT29, A549, HepG2 세포 및 정상세포주인 IMR90, HEK293 세포를 3-5×104 cells/well의 농도로 24-well plate에 분주하여 24시간 배양한 다음, 추출물을 농도별로 처리하고 37℃에서 48시간동안 배양하였다. 이때 대조군으로는 0.1% DMSO를 처리하였다. 48시간 배양 후 WST assay reagent (Daeillab, Korea)를 well당 500 μl 첨가하여 37℃에서 30분 동안 반응시킨 후, microplate reader로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 1B에서와 같이 50 μg/ml의 MEJG를 처리하였을 때부터 점차적으로 세포 형태가 불규칙적으로 변하고, 무리를 이루어 자라는 형태가 단일세포형태로 변하여 세포의 밀도가 점차 감소함을 확인하였다. 이러한 결과로부터 MEJG 처리에 의해 암세포, 특히 HT29 세포의 사멸이 유도되며, 세포 형태가 변화되는 것을 확인하였으며, 따라서 이후 실험은 HT29 세포를 사용하여 수행하였다.
- PBS로 3회 세척한 다음 1 μg/ml의 4’, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; Sigma, USA) 용액을 이용하여 염색하였다. 차광한 상태로 상온에서 20분간 염색한 다음,PBS로 세척 후 Anti-fade mounting 용액을 사용하여 mounting하고, 형광현미경(Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 핵의 형태변화를 관찰하고 Axio Vision Program을 이용하여 촬영하였다.
- 추출한 단백질의 농도를 Bradford assay로 결정한 후 30 µg의 단백질을 10% SDS-PAGE로 전기영동하고 nitrocellulose membrane에 blotting한 후 대상 단백질의 항체와 hybridization하였다.
- 48시간 배양 후 WST assay reagent (Daeillab, Korea)를 well당 500 μl 첨가하여 37℃에서 30분 동안 반응시킨 후, microplate reader로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정값은 3회 반복실험을 하여 그에 대한 평균값으로 나타내었으며, 본 실험결과를 바탕으로 이후 적정 처리 농도를 결정하였다.
대상 데이터
- Membrane washing 후 Horse radish peroxidase (HRP)가 tagging된 이차항체로 한 시간 동안 반응시킨 후 Western blotting luminol reagent (Santa Cruz Biotechnology, USA)를 적용시킨 다음 chemiluminescence detection system (FluoChem®FC2; AlphaInnotech, USA)을 사용하여 분석하였다. Fas, Fas-associated death domain (FADD), Bcl-2, cytochromec, Capase-3, -8, -9, 및 actin의 일차항체와 HRP-conjugated anti-rabbit, anti-goat, anti-mouse 등 이차항체는 Santa Cruz Biotechnology에서 구입하였으며, PARP와 Bax의 일차항체는 Cell Signaling Technology (USA)에서 구입하여 사용하였다.
- J. globiflora 메탄올 추출물(Methanol extracts of Julbernardia globiflora, MEJG)은 한국생명공학연구원, 해외생물소재 허브센터에서 구입(분양번호; FBM117-063)하여 사용하였으며, methyl alcohol 95.0% GR급을 사용하여 45℃에서 sonicator를 이용하여 3일동안 반복하여 추출하고 농축 후 동결건조시킨 시료로서 적정 농도로 dimethyl sulfoxide (DMSO; Sigma, USA)에 용해하였으며 -20℃에서 보관하여 사용하였다.
- 모든 세포주는 American Type Culture Collection (ATCC, USA)으로부터 구입하여 사용하였으며, 10% fetal bovine serum (FBS) 및 1% penicillin/streptomycin이 포함된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)을 사용하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다.
- 본 연구에서는 암세포주는 인체 대장암 세포 HT29, 폐암 세포 A549, 및 간암 세포 HepG2를 사용하였으며, 정상세포주로는 인체 폐섬유아세포 IMR90 및 인체 배아신장세포HEK293을 사용하였다. 모든 세포주는 American Type Culture Collection (ATCC, USA)으로부터 구입하여 사용하였으며, 10% fetal bovine serum (FBS) 및 1% penicillin/streptomycin이 포함된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)을 사용하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다.
- 시료를 첨가하지 않은 음성 대조군과 비교하여 free radical 소거활성을 백분율로 나타내고, 50% 저해 농도(IC50)를 계산하였다. 양성 대조군으로는 대표적인 항산화제인 ascorbic acid를 사용하였으며 측정값은 3회 반복 실험의 평균값으로 나타내었다. 억제능의 백분율 공식은 다음과 같다.
- MEJG의 항암활성을 확인하기 위하여 먼저 WST assay를 사용하여 다양한 암세포에 대한 MEJG의 사멸효과를 관찰하였다. 이때 암세포는 인체 대장암 세포 HT29, 폐암세포 A549 및 간암세포 HepG2를 사용하였으며, 정상세포로는 인체 폐섬유아세포 IMR90과 인체 배아신장세포 HEK293을 사용하였다. 그 결과 Fig.
데이터처리
- 모든 결과는 mean ± SD (Standard deviation)로 나타내었으며, 분석된 실험 데이터의 통계적 유의성은 대조군과 각 시료처리군의 실험데이터로부터 Student’s t test를 통하여 검증하였다.
이론/모형
- MEJG의 항암 활성 기전을 밝히기 위해 apoptosis 조절에 관여하는 단백질 발현을 Western blot hybridization으로 분석하였다. 농도별로 MEJG를 처리한 HT29 세포를 회수하여 PBS로 세척한 후, lysis buffer [20 mM Tris-HCl (pH 7.
성능/효과
- 2B에 도식화하였다. Fig. 2B에서 알 수 있듯이 살아있는 세포는 MEJG 농도의존적으로 감소하고, 반면 apoptotic 세포는 점점 증가함을 볼 수 있었다. 특히 late apoptotic 세포(Annexin V+/7-AAD+)가 early apoptotic 세포(Annexin V+/7-AAD-)의 수보다 더 크게 증가함을 확인할 수 있었다.
- 이때 암세포는 인체 대장암 세포 HT29, 폐암세포 A549 및 간암세포 HepG2를 사용하였으며, 정상세포로는 인체 폐섬유아세포 IMR90과 인체 배아신장세포 HEK293을 사용하였다. 그 결과 Fig. 1A에 제시한 바와 같이 MEJG 농도가 증가할수록 암세포의 생존율이 낮아지는 것을 확인할 수 있었으며,반면 정상세포의 생존율에는 별다른 영향을 끼치지 않았다. 특히 암세포 중에서도 인체 대장암 세포주인 HT29에 대한MEJG의 사멸효과가 가장 높았으며, 최고 농도인 200 μg/ml에서는 HT29 세포의 생존율이 36.
- 그 결과 Fig. 2A에서 나타낸 바와 같이 대조군에서의 Annexin V positive 세포는 6.58%였으나, MEJG 처리에 의해 농도 의존적으로 증가하여 최고 농도인 200 μg/ml에서는 38.46%까지 증가하였다.
- MEJG에 의한 apoptosis 유발의 분자기전을 확인하기 위하여 HT29 세포에 MEJG를 농도별로 처리한 다음, apoptosis 관련 단백질의 발현변화를 Western blot analysis로 관찰하였다. 그 결과 Fig. 4A에서와 같이 MEJG의 처리에 의해 Fas와 FADD의 발현이 증가되었으며, caspase-8이 활성화되어 cleaved caspase-8이 증가됨을 확인할 수 있었다. 사멸수용체인 Fas는 apoptosis의 외인성 경로에 관여하는 단백질로 알려져 있으며, 외부 신호가 Fas에 결합하면 Fas의 세포 내 domain에 FADD 단백질이 결합하여 신호가 전달되어 개시 caspase인 caspase-8이 활성화된다[32].
- 그 결과 Table 1에 제시한 바와 같이MEJG의 농도가 증가함에 따라 DPPH radical 억제능이 0.51μg/ml에서는 32.66%, 2.56 μg/ml에서는 82.26% 그리고 12.8μg/ml에서는 96.93%까지 억제시키는 것을 확인하였다.
- 앞서 MEJG에 의해 HT29 세포의 apoptosis가 유도되는 것을 확인하였으므로, 다음으로 세포 핵 내의 변화를 관찰하기 위하여 HT29 세포에 추출물을 농도별로 처리한 다음 DAPI 염색을 실시하여 형광현미경을 이용하여 관찰하였다. 그 결과, Fig. 3에서와 같이 0.1% DMSO를 처리한 대조군의 경우와 비교하여 보았을 때 시료 처리 농도가 증가할수록 핵 내 염색질 농축이 일어나 apoptotic body가 증가하였음을 관찰하였다.
- 61 μg/ml 보다 더 낮았다. 따라서 MEJG가 양성 대조군보다 뛰어난 매우 강력한 항산화 활성을 지니는 것을 알 수 있었다.
- 사멸수용체인 Fas는 apoptosis의 외인성 경로에 관여하는 단백질로 알려져 있으며, 외부 신호가 Fas에 결합하면 Fas의 세포 내 domain에 FADD 단백질이 결합하여 신호가 전달되어 개시 caspase인 caspase-8이 활성화된다[32]. 따라서 이러한 결과는 MEJG에 의해 Fas의 발현이 유도될 뿐 아니라, Fas를 통한 apoptosis의 외인성 경로가 활성화되어 caspase cascade의 개시 caspase인 caspase-8이 활성화된다는 것을 의미한다. 또한 Fig.
- 활성화된 caspase-3은 PARP, inhibitor of caspase activated deoxyribonuclease (ICAD), gelsolin과 같은 기질을 분해함으로써 세포사멸을 유도하는 것으로 알려져 있다[26]. 따라서 이상의 결과로부터 MEJG는 미토콘드리아를 통한 내인성 경로와 사멸 수용체를 통하는 외인성 경로의 두 가지 경로를 통해 HT29 세포의 apoptosis를 유도하여 암세포의 증식을 억제시키는 것으로 사료된다.
- 따라서 이러한 결과는 MEJG에 의해 Fas의 발현이 유도될 뿐 아니라, Fas를 통한 apoptosis의 외인성 경로가 활성화되어 caspase cascade의 개시 caspase인 caspase-8이 활성화된다는 것을 의미한다. 또한 Fig. 4B에서 알 수 있듯이, MEJG 처리에 의해 Bcl-2 family 단백질 중 pro-apoptotic 분자인 Bax의 발현이 증가되었고, anti-apoptotic 분자인 Bcl-2의 발현은 감소되었으며, 세포질 내 cytochrome c가 증가되었다. 이러한 결과는 MEJG에 의해 Bcl-2family 단백질들의 발현이 변화되었으며, 그 결과 미토콘드리아의 cytochrome c가 세포질로 방출되었음을 시사한다[34].
- 4A). 또한 MEJG 처리에 의해 caspase-3이 활성화되어 cleaved caspase-3이 증가되었으며, PARP의 단편화가 유도되는 것을 관찰하였다(Fig. 4A). 이는 MEJG에 의해 caspase cas-cade가 활성화되어 실행 caspase인 caspase-3이 활성화되고, 활성화된 caspase-3의 기질 중 하나인 PARP가 절단되었음을 의미한다.
- 또한 MEJG를 농도별로 HT29 세포에 처리한 후 도립현미경을 사용하여 세포의 형태 변화를 관찰한 결과, Fig.1B에서와 같이 50 μg/ml의 MEJG를 처리하였을 때부터 점차적으로 세포 형태가 불규칙적으로 변하고, 무리를 이루어 자라는 형태가 단일세포형태로 변하여 세포의 밀도가 점차 감소함을 확인하였다.
- 2B에서 알 수 있듯이 살아있는 세포는 MEJG 농도의존적으로 감소하고, 반면 apoptotic 세포는 점점 증가함을 볼 수 있었다. 특히 late apoptotic 세포(Annexin V+/7-AAD+)가 early apoptotic 세포(Annexin V+/7-AAD-)의 수보다 더 크게 증가함을 확인할 수 있었다. 따라서 이와 같은 결과는 MEJG에 의한 HT29 세포의 사멸효과는 apoptosis 유도에 의한 것임을 시사한다.
- 특히 암세포 중에서도 인체 대장암 세포주인 HT29에 대한MEJG의 사멸효과가 가장 높았으며, 최고 농도인 200 μg/ml에서는 HT29 세포의 생존율이 36.36%까지 낮아지는 것을 알 수 있었다.
후속연구
- globiflora 메탄올 추출물의 항산화 효과 및 대장암 세포에 대한 항암기전을 분석하였으며, 그 결과 MEJG가 강력한 항산화능을 가지며, 인체 대장암 세포주 HT29의 apoptosis 유도에 의한 항암 효과를 보이는 것을 확인하였다. 이러한 연구결과는 J. globiflora의 생리활성인 항암활성의 기전을 해석한 중요한 기초자료가 될 뿐 아니라, 나아가 새로운 천연물 유래 항암제 후보물질 연구에 있어 중요한 자료로 사용될 것이라 사료된다.
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