[논문]인체 폐암 세포주 A549에서 Litsea populifolia 추출물의 항산화 및 항암활성 분석

진수정; 오유나; 정현영; 윤희정; 박정하; 권현주; 김병우

doi:10.5352/jls.2019.29.6.679

인체 폐암 세포주 A549에서 Litsea populifolia 추출물의 항산화 및 항암활성 분석
Anti-oxidative and Anti-cancer Activities of Ethanol Extract of Litsea populifolia 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.29 no.6 = no.230, 2019년, pp.679 - 687

진수정 (동의대학교 블루바이오소재개발센터) , 오유나 (동의대학교 블루바이오소재개발센터) , 정현영 (동의대학교 블루바이오소재개발센터) , 윤희정 (동의대학교 공과대학 바이오응용공학부) , 박정하 (동의대학교 공과대학 바이오응용공학부) , 권현주 (동의대학교 블루바이오소재개발센터) , 김병우 (동의대학교 블루바이오소재개발센터)

초록
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본 연구에서는 인체 폐암 세포인 A549를 사용하여 Litsea populifolia 에탄올 추출물(EELP)의 항산화 및 항암활성과 그 분자적 기전에 관하여 연구하였다. 먼저 EELP의 DPPH 라디칼 소거활성을 측정한 결과, $IC_{50}$가 $11.71{\mu}g/ml$로 유의적인 항산화활성을 보였다. 또한 EELP가 인체폐암세포주인 A549와 정상 폐세포인 IMR90의 세포증식에 미치는 영향을 알아본 결과, 정상세포의 생존율에는 거의 영향을 끼치지 않은 반면, EELP 농도의존적으로 A549 세포의 성장이 저해되었으며, 세포 주기 변화를 분석한 결과 EELP에 의해 A549 세포의 강력한 G1 arrest가 유도되는 것을 확인하였다. EELP에 의해 유도되는 G1 arrest는 세포주기 조절 인자인 Cyclin D1, Cyclin E, Cyclin-dependent kinase인 CDK2와 CDK6의 mRNA 발현 감소와 더불어 단백질 발현 감소와 연관되어 있었다. 또한 EELP 처리에 의한 CDK/Cyclin complex의 발현 저해는 DNA 손상에 의해 활성화되는 CHK2의 활성화 형태인 p-CHK2의 발현 증가에 따른 p53 인산화에 따른 활성화와 CDK 활성화 효소인 CDC25A 탈인산화효소의 인산화에 따른 저해에 의해 나타나는 결과로 사료된다. 이러한 결과들로부터 EELP는 두가지 경로인 p53-의존성과 p53-비의존성(ATM/CHK2/CDC25A/CDK2) 경로를 통해 A549의 G1 arrest를 유도하여 세포 증식을 억제하는 것으로 사료된다. 본 연구결과는 EELP가 폐암에 대한 새로운 항암활성 소재로서 사용될 수 있는 가능성을 시사하며, 또한 EELP의 세포주기 조절에 의한 항암기전을 이해하고 향후 지속적 연구를 하는 데 있어서 귀중한 기초자료로 사용될 수 있을 것이다.

Abstract ▼ AI-Helper

Litsea populifolia, a plant species of the Lauraceae family, is widely distributed in the tropical and subtropical areas of Asia. The phylogenetic relationships and botanical characteristics of L. populifolia have been reported; however, its anti-oxidative and anti-cancer activities remain unclear. In this study, we evaluated the anti-oxidative and anti-cancer effects of ethanol extracts of L. populifolia (EELP) together with the molecular mechanism of its anti-cancer activity in human lung adenocarcinoma A549 cells. EELP showed significant anti-oxidative effects with a 50% inhibitory concentration at $11.71{\mu}g/ml$, which was measured by the 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radical scavenging assay. EELP exhibited cytotoxic activity and induced cell cycle arrest at the G1 phase in A549 cells in a dose-dependent manner, whereas EELP did not have the cytotoxic effect on the normal human lung cell line IMR90. Treatment with EELP also resulted in a decreased expression of G1/S transition-related molecules-including cyclin-dependent kinase (CDK) 2, CDK6, cyclin D1, and cyclin E-both for the transcription and translation levels. EELP-induced G1 arrest was associated with the phosphorylation of checkpoint kinase 2 (CHK2), p53, cell division cycle 25 homolog A (CDC25A), and the reduction of CDC25A expression in A549 cells. Collectively, these results suggest that EELP may exert an anti-cancer effect by cell cycle arrest at the G1 phase through both p53-dependent and p53-independent (ATM/CHK2/CDC25A/CDK2) pathways in A549 cells.

주제어

표/그림 (7)

표 Table 1. Primer sets for RT-PCR analysis
표 Table 2. Total phenolic contents (TPC) and DPPH activity of ethanol extract of Litsea populifolia
그림 Fig. 1. Effects of EELP on cell growth and morphology in human lung carcinoma A549 cells.
표 Table 3. Cell cycle distribution of ethanol extract of Litsea popu-lifolia
그림 Fig. 2. G1 arrest of cell cycle in EELP-treated A549 cells.
그림 Fig. 3. Transcriptional repression of G1 checkpoint proteins by EELP in A549 cells.
그림 Fig. 4. Downregulation of G1 checkpoint proteins by EELP in A549 cells.

AI 본문요약
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문제 정의

populifolia의 생육특성 및 계통학적 연구가 진행되어 왔으나, 생리활성에 관해서는 전혀 밝혀진 바가 없다[34]. 따라서, 본 연구에서는 인간 폐암세포 A549를 사용하여 L. populifolia 에탄올 추출물(Ethanol extract of L. populifolia 이하 EELP)의 항산화 활성 및 A549 세포의 세포주기조절에 의한 항암활성과 그 분자적 기전에 관하여 연구하였다.

제안 방법

EELP 처리에 의한 A549의 세포주기에 관련된 분자의 mRNA의 발현 양상을 확인하기 위하여 RT-PCR을 수행하였다. A549에 농도별(0-400 μg/ml)로 EELP를 처리하고 48시간 배양 후 TRIzol reagent (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, USA)를 이용하여 total RNA를 분리하였다.
EELP가 A549의 세포주기에 미치는 영향을 확인하기 위하 여 EELP를 다양한 농도로 A549에 처리하여 CycleTEST™ PLUS DNA Reagent Kit (Becton Dickinson, USA)로 분석하였다. 세포는 6-well plate에 1-2×10⁵ cell로 분주하고 EELP를 0-400 μg/ml의 농도로 48시간 처리 후 회수하였다.
EELP의 항산화능을 확인하기 위하여 2,2-diphenyl-1-picryl hydrazyl (DPPH) radical 소거 활성을 측정하였다[19, 26]. EELP를 농도별(2.

대상 데이터

본 실험에서 사용한 L. populifolia 에탄올 추출물은 해외생물소재허브센터(한국생명공학연구원; 분양번호 FBM123-011)에서 구입하였다. L.
본 연구에 사용한 정상세포주는 인체에서 유래한 폐섬유모 세포인 IMR90 (CCL-186™)을 사용하였고, 암세포주는 인체 폐 암세포주인 A549 (CCL-185™)를 사용하였다. 세포주는 American Type Culture Collection (ATCC^®, USA)으로부터 구입하였으며, Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) 배지에 10% fetal bovine serum (FBS)와 penicillin/streptomycin을 첨가하여 37℃ 배양기에서 5%의 CO₂를 유지하면서 배양하였다.

데이터처리

실험의 측정결과는 평균(mean)±표준편차(SD)로 나타내었으며, 각 실험군 사이의 통계학적 유의성 검정은 student’s t test를 통해 p값이 0.05 미만(p-value<0.05)인 경우 유의성이 있는 것으로 평가하였다.

이론/모형

총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis 방법에 따라 분석하였다 [36]. 에탄올 추출물을 1 mg/ml 농도로 조제한 후, 이 시료액 100 μl에 10% Folin-Ciocalteau's phenol reagent 200 μl를 첨가한 후 혼합하였다.

성능/효과

암세포 성장에 미치는 EELP의 영향을 알아보기 위하여 적 정농도의 EELP를 처리하고 48시간 배양 후 WST assay를 실시하였다. 그 결과, Fig. 1A에 나타난 바와 같이 정상세포인 폐섬 유모세포(IMR90)의 경우 EELP에 의한 세포 독성 및 성장 억제 효과가 관찰되지 않았으나, 인체 폐암세포주인 A549의 경우 EELP 농도의존적으로 세포의 생존율이 감소하였으며, 200 μg/ml에서는 약 29.49%의 생존율 억제가 일어났고, 최고농도인 500 μg/ml에서는 71.34% 이상의 성장 억제 효과를 보였다. 또한, 도립현미경을 통하여 확인한 EELP 처리에 따른 A549 세포의 형태 변화는 EELP의 농도가 증가할수록 A549의 세포 형태가 변하고, 세포의 수 역시 감소하는 반면, IMR90의 세포 형태에는 영향을 끼치지 않는 것을 확인할 수 있었다(Fig.
본 연구를 통하여 Litsea populifolia 추출물이 뛰어난 항산화능을 가지며, 정상 폐세포주인 IMR90에서는 독성이 거의 없으며 암세포주인 A549에는 강력한 독성을 지니는 것을 확인하였다. 또한 암세포 독성의 기전이 암세포의 세포주기 조절, 즉 G1 arrest에 의한 것임을 확인하였다. 이러한 연구결과를 바탕으로 추후 EELP의 ROS 조절에 의한 항암활성에 대하여 지속적인 연구가 수행되어야 할 것이다.
특히 암세포에서 특이적으로 과발현되어 있는 세포주기조절 관련 분자 등에 관한 연구결과들이 보고되면서 세포주기조절 인자를 target으로 하는 항암제에 관한 연구가 주목받고 있다. 본 연구를 통하여 Litsea populifolia 추출물이 뛰어난 항산화능을 가지며, 정상 폐세포주인 IMR90에서는 독성이 거의 없으며 암세포주인 A549에는 강력한 독성을 지니는 것을 확인하였다. 또한 암세포 독성의 기전이 암세포의 세포주기 조절, 즉 G1 arrest에 의한 것임을 확인하였다.

후속연구

이러한 연구결과를 바탕으로 추후 EELP의 ROS 조절에 의한 항암활성에 대하여 지속적인 연구가 수행되어야 할 것이다. 아울러 본 연구결과는 Litsea populifolia 추출물의 세포주기 조절에 의한 항암기전을 해석하고 폐암세포의 세포주기 조절의 기전연구를 위한 중요한 기초자료가 될 것이라 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	세포주기는 무엇에 의해 다음 단계로 진행되는가?	세포주기는 cyclin-dependent kinase (CDK)와 cyclin 복합체(CDK/cyclin complex)의 활성화에 의해 다음 단계로 진행되며, CDK/cyclin complex의 활성제어에 의해 세포주기가 조절된다. 현재까지 보고된 바로는 CDK 저해제로 알려진 p21, p27 등에 의해 CDK 활성이 저해되어 cell cycle arrest가 야기되며, 종양억제인자인 p53에 의해 p21의 발현이 증가되는 것으로 알려져 있다[2, 35, 38].
	Litsea populifolia는 무엇인가?	Litsea populifolia는 녹나무과(Laurel) 녹나무속(Lauraceae)에 속하는 관목으로 아시아의 열대 및 아열대 지역에 위치하고 있으며, 일부 종은 북한 또는 남아메리카에서도 발견된다. 현재까지 L.
	현재까지 진행되어 온 Litsea populifolia 관련 연구 분야는 무엇인가?	현재까지 L. populifolia의 생육특성 및 계통학적 연구가 진행되어 왔으나, 생리활성에 관해서는 전혀 밝혀진 바가 없다[34]. 따라서, 본 연구에서는 인간 폐암세포 A549를 사용하여 L.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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