Objectives : The various grape extracts derived from grape pulp, seed and skin, containing various types of polyphenols and flavonoids, have been known to have anti-inflammatory, antioxidant and improve cardiovascular condition as well as sun's damaging effects. However, there have been rare reports...
Objectives : The various grape extracts derived from grape pulp, seed and skin, containing various types of polyphenols and flavonoids, have been known to have anti-inflammatory, antioxidant and improve cardiovascular condition as well as sun's damaging effects. However, there have been rare reports of various beneficial effects of grape fruit stem extract (GFSE), one of the waste products of grapes. We investigated anti-inflammatory and melanogenesis inhibitory effects of GFSE. Methods : One-hundred gram of grape fruit stem was extracted with 80% ethanol at room temperature for 3 days. After filtration, the ethanol was removed using vacuum evaporator, then lyophilized to obtain the dry extract which was stored at $-20^{\circ}C$ until used. NO levels were measured by using Greiss reagent. Prostaglandin $E_2$ ($PGE_2$) production was measured by ELISA assay. The expression levels of iNOS, COX-2, TRP-1 and TRP-2 were evaluated by western blot analysis. Results : GFSE reduced the level of nitric oxide and prostaglandin $E_2$ ($PGE_2$) production in a dose-dependent manner, compared to control. Expressions of cyclooxygenase-2 (COX-2) and inducible nitric oxide synthase (iNOS) protein were also effectively inhibited by the GFSE. In a tyrosinase inhibitory activity, GFSE significantly reduced the tyrosinase activity and melanin content in a dose dependent manner, compared to control. GFSE also decreased the expression of tyrosinase related protein-1 (TRP-1) and tyrosinase related protein-2 (TRP-2), known as a melanocyte-specific gene product involved in melanin synthesis. Conclusions : Therefore, these results indicated that GFSE had powerful anti-inflammatory and anti-melanogenic effects.
Objectives : The various grape extracts derived from grape pulp, seed and skin, containing various types of polyphenols and flavonoids, have been known to have anti-inflammatory, antioxidant and improve cardiovascular condition as well as sun's damaging effects. However, there have been rare reports of various beneficial effects of grape fruit stem extract (GFSE), one of the waste products of grapes. We investigated anti-inflammatory and melanogenesis inhibitory effects of GFSE. Methods : One-hundred gram of grape fruit stem was extracted with 80% ethanol at room temperature for 3 days. After filtration, the ethanol was removed using vacuum evaporator, then lyophilized to obtain the dry extract which was stored at $-20^{\circ}C$ until used. NO levels were measured by using Greiss reagent. Prostaglandin $E_2$ ($PGE_2$) production was measured by ELISA assay. The expression levels of iNOS, COX-2, TRP-1 and TRP-2 were evaluated by western blot analysis. Results : GFSE reduced the level of nitric oxide and prostaglandin $E_2$ ($PGE_2$) production in a dose-dependent manner, compared to control. Expressions of cyclooxygenase-2 (COX-2) and inducible nitric oxide synthase (iNOS) protein were also effectively inhibited by the GFSE. In a tyrosinase inhibitory activity, GFSE significantly reduced the tyrosinase activity and melanin content in a dose dependent manner, compared to control. GFSE also decreased the expression of tyrosinase related protein-1 (TRP-1) and tyrosinase related protein-2 (TRP-2), known as a melanocyte-specific gene product involved in melanin synthesis. Conclusions : Therefore, these results indicated that GFSE had powerful anti-inflammatory and anti-melanogenic effects.
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문제 정의
생식과 포도 가공 도중 발생하는 포도껍질이나 포도송이가지는 비료나 사료용으로 소량 사용되거나 거의 대부분 음식물 쓰레기로 폐기되고 있어 처리비용을 고려할 때 경제적 손실이 큰 편이다28). 따라서 본 연구에서는 포도 소비 과정에서 버려지는 부산물 중 하나인 포도송이가지 추출물(GFSE : grape fruit stem)을 이용하여 항산화 및 항염 효과를 다양한 방법으로 탐색하고, 티로시나아제 저해 활성과 멜라닌 저해효과 등을 통하여 현대 산업 분야에서 큰 관심을 받고 있는 항염, 미백효능을 조사함 으로써 천연유래 기능성 원료의 바이오 소재로서의 가능성을 확인하고자 한다.
프로스타글란딘계통의 신호분자로써 발열 및 동통 등을 유발하는 염증반응에 중요하게 작용하는 프로스타글란딘 PGE2는 혈관 확장, 부종, 발열, 동통 등을 매개한다35). 따라서 본 연구에서는 포도송이가지 추출물이 PGE2 생성에 미치는 영향을 조사하였다(Fig. 1). 그 결과 포도송이가지 추출물의 농도가 증가 할수록 염증매개인자인 PGE2 생성은 유의적으로 감소되었다.
본 연구에서는 포도송이가지 추출물의 iNOs, COX-2 유전자 발현 억제 효과를 알아보고자 western blot을 수행하였다. 마우스 대식세포주인 RAW 264.
제안 방법
B16/F10세포의 tyrosinase 활성은 Yagi등의33) 방법을 응용하여 측정하였다. B16세포는 well 당 4×104 cell/㎖로 계수하여 6 well plate에 접종하였다.
Louis, MO, USA) 를 100 ㎕ 주입하고 4℃에서 30분간 방치한 후 12,000 rpm으로 20분 동안 원심 분리하여 상층액을 얻었다. Bradford method로 단백질 정량하였고, 각각의 세포용해액은 well 당 100 ㎕씩 96 well plate에 주입한 후 여기에 인산완충액(pH 6.8)에 0.1% L-dihydroxy phenylalanine (L-DOPA) 용액을 100 ㎕을 다시 주입하여 혼합하고 37℃에서 60분간 방치한 후 405 ㎚ ELISA reader를 사용하여 흡광도를 측정하였다.
각각의 추출물과 표준 물질인 gallic acid (reference)를 0 ~ 1000 ㎍/㎖의 농도로 희석하여 100 ㎕를 갈색 에펜도르프튜브에 주입하고 Folin & Ciocalteu’s phenol을 100㎕ 넣어 5분 동안 실온에서 반응시키고 sodium cabonate (NaCO3)를 1 ㎖씩 주입시켜 다시 30분간 실온에서 반응시킨 후 분광광도계 (ELISA reader) 750 ㎚에서 흡광도 측정을 하였다.
실험에 사용한 포도송이가지(Muscat Bailey A grape fruit stem) 부위 소재는 전라북도 정읍시 신태인읍 농업회사법인 주식회사 한스올가닉에서 구입한 후 우석대학교 한의과대학 본초방제학교실 김홍준 교수에게 동정하여 확인하였고, 그 표본(#GF2016-06-14)은 전주대학교 보건관리학과 연구실에 보관하였다. 건조된 포도송이가지는 분쇄하여 100g으로 정량하여 80% EtOH 2000mL를 용매로 실온에서 72시간 방치 후 얻어진 추출물을 ADVANTEC 5A(Tokyo, Japan) 필터로 1회, ADVANTEC 2 필터로 2회 여과 한 후 회전진공농축기(Eyela A-1000S, Tokyo Rikakikai Co., Tokyo, Japan)로 감압농축하여 에탄올을 제거하고 동결건조기(EYELA FDU-2100, Tokyo Rikakikai Co., Tokyo, Japan)에서 건조하여 분말형태로 23g을 회수하였다. 회수한 추출물은 –20°C에서 보관하면서 실험에 사용하였다.
Membrane은 5% skim milk가 함유된 Tris buffered saline에 실온에서 blocking하였으며, primary antibody로 anti - COX-2 polyclonal antibody와 anti – iNOS polyclonal antibody 그리고 anti - TRP-1 polyclonal antibody, anti - TRP-2 polyclonal antibody를 각각 1 : 200 으로 희석하여 처리한 후 4℃에서 반응시켰다. 반응된 TBS-T(Trisbuffered saline and 0.1% tween 20)로 10분씩 3회 washing하고, secondary antibody (goat anti-rabbit IgG HRP)를 5% skim milk에 각각 1 : 5000으로 희석하여 실온에서 1시간동안 반응시킨 뒤 다시 10분씩 3회 washing하였다. 크기별로 분류된 단백질은 발광할 수 있는 물질과 반응시켜 확인하였다.
위에서 언급한 바와 같이 tyrosinase와 마찬가지로 TRP-1과 TRP-2는 멜라닌 합성에 중요한 역할을 하는 효소이다. 본 연구에서는 Western blot 분석을 통해 TRP-1과 TRP-2 단백질 발현 변화를 조사하였다(Fig. 4). 그 결과 포도송이가지 추출물은 α-MSH에 의해 증가된 TRP-1과 TRP-2 단백질 발현을 농도 의존적으로 감소시켰다.
방법으로 측정하였다. 시료를 EtOH로 녹여 최종 농도가 25, 50, 75, 100 ㎍/㎖이 되도록 정량하여 96 well plate에 각 시료를 100 ㎕을 주입하고, 동시에 0.3 mM DPPH 100 ㎕를 넣어 총량이 200 ㎕가 되도록 하였다. 실온에서 10분간 반응시킨 후 ELISA reader (Tecan Group Ltd.
3 mM DPPH 100 ㎕를 넣어 총량이 200 ㎕가 되도록 하였다. 실온에서 10분간 반응시킨 후 ELISA reader (Tecan Group Ltd., Mannedorf, Swizerland)로 540 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디칼 소거 활성은 시료 용액의 첨가군과 무첨가군 사이의 흡광도의 차이를 백분율로 나타내었다.
의 측정은 R&D systems사가 제공하는 방법에 따라 실험하였다. 실험방법은 RAW 264.7 세포에 포도송이가지 추출물을 1시간 전처리하고 LPS (lipopolysaccharide)를 처리하여 16시간 배양 후 상층액을 PGE2 측정에 사용하였다. goat anti-mouse로 코팅된 96 well plate에 각각의 배양액을 100 ㎍씩 주입하였고, primary antibody solution 50 ㎍과 PGE2 conjugate 50 ㎍씩 첨가하여 실온에서 반응시킨다.
04 (± 표준오차)이 되도록 EtOH로 희석하여 사용하였다. 추출물의 최종 농도가 100 ㎍/㎖ 되도록 정량하여 50 ㎕에 준비된 ABTS 용액 950 ㎕를 첨가하여 암소에서 30분간 반응시킨 후 732 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. ABTS의 소거활성은 시료 용액의 첨가군과 무첨가군 사이의 흡광도의 차이를 백분율로 나타내었다.
1% tween 20)로 10분씩 3회 washing하고, secondary antibody (goat anti-rabbit IgG HRP)를 5% skim milk에 각각 1 : 5000으로 희석하여 실온에서 1시간동안 반응시킨 뒤 다시 10분씩 3회 washing하였다. 크기별로 분류된 단백질은 발광할 수 있는 물질과 반응시켜 확인하였다. Band density는 ImageJ gel analysis software (National Institutes of Health, Maryland, USA) 프로그램을 사용하여 분석하였다.
방법을 약간 변형하여 측정하였다. 포도송이가지 부위별 추출물을 25 ~ 100 ㎍/㎖으로 정량하여 증류수에 녹인 후 0.2 M sodium phosphate buffer (pH 6.6) 500 ㎕를 각각 혼합하여 50℃에서 반응시킨 후 실온에서 냉각하고 10% trichloroacetic acid 2.5 ㎖을 가하였다. 위 반응액을 1900 rpm 에서10분간 원심 분리하여 상층액과 증류수, 1% ferric chloride를 가하여 혼합한 반응액의 흡광도 값을 700 ㎚에서 측정하였다.
포도송이가지 추출물이 멜라닌 합성에 관계된 효소인 tyrosinase에 미치는 영향을 알아보기 위하여 α-MSH로 자극한 B16/F10 멜라닌세포에 포도송이가지 추출물을 처리하여 tyrosinase의 효소 저해 효과와 멜라닌 생성 억제 효과를 측정하였다.
따라서 본 연구에서 DPPH와 ABTS를 이용하여 포도송이가지 추출물의 항산화 활성을 평가한 결과, DPPH와 ABTS free radical 소거능은 포도송이가지 추출물이 농도(25, 50, 75, 100 ㎍/㎖) 의존적으로 현저하게 증가하였다. 환원력은 Ascorbic acid와 비교하여 연구하였다. 결과는 Table 4와 같이 25 ㎍/㎖농도에서 0.
대상 데이터
Dulbecoos modified Eagle's medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS)는 Invitrogen사 (Carlsbad, CA, USA) 에서 구입 하였다.
potassium persulfate, sodium bicarbonate, Ascorbic acid, 2-mercaptoethanol, lipopolysaccharide (LPS), prostagladin E2 (PGE2)는 R&D systems (Minneapolis, MN, USA)에서 구입하였다. Penicillin-streptomysin, cyclooxygenase-2 (COX-2)와 inducible nitric oxide synthase (i-NOS)항체는 Cayman chemical사 (Ann Arbor, MI, USA), Cell Signaling (Danvers, MA, USA), tyrosinase related protein-1 (TRP-1), tyrosinase related protein-2 (TRP-2) 항체는 Santa Cruz Biotechnology사(Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였다. 이차 항체와 β-actin은 Santa Cruz Biotechnology사 (Santa Cruz, CA, USA), 기타 시약은 Sigma-Aldrich사 (St.
마우스 배아에서 유래한 RAW264.7 세포주는 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)사로부터 구입하여 사용하였다. 설치류 유래 B16/F10 melanoma 세포주는 한국세포주은행 (Seoul, Korea)로부터 분양받았다.
7 세포주는 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)사로부터 구입하여 사용하였다. 설치류 유래 B16/F10 melanoma 세포주는 한국세포주은행 (Seoul, Korea)로부터 분양받았다. B16/F10 세포와 RAW264.
실험에 사용한 포도송이가지(Muscat Bailey A grape fruit stem) 부위 소재는 전라북도 정읍시 신태인읍 농업회사법인 주식회사 한스올가닉에서 구입한 후 우석대학교 한의과대학 본초방제학교실 김홍준 교수에게 동정하여 확인하였고, 그 표본(#GF2016-06-14)은 전주대학교 보건관리학과 연구실에 보관하였다. 건조된 포도송이가지는 분쇄하여 100g으로 정량하여 80% EtOH 2000mL를 용매로 실온에서 72시간 방치 후 얻어진 추출물을 ADVANTEC 5A(Tokyo, Japan) 필터로 1회, ADVANTEC 2 필터로 2회 여과 한 후 회전진공농축기(Eyela A-1000S, Tokyo Rikakikai Co.
이차 항체와 β-actin은 Santa Cruz Biotechnology사 (Santa Cruz, CA, USA), 기타 시약은 Sigma-Aldrich사 (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다.
데이터처리
크기별로 분류된 단백질은 발광할 수 있는 물질과 반응시켜 확인하였다. Band density는 ImageJ gel analysis software (National Institutes of Health, Maryland, USA) 프로그램을 사용하여 분석하였다.
모든 실험값은 평균±표준편차(mean ± SD)로 표시하였고, 통계학적 비교분석은 IBM SPSS statistics 22 (IBM, New York, NY, USA)를 이용하였고 각 실험군간의 비교는 one- way analysis of variance (ANOVA)로 처리하였으며, 실험군들과의 유의차를 알아보기 위한 다중비교방법으로 Duncan's multiple range test 검정을 실시하였다.
이론/모형
ABTS 라디칼 소거능은 Dudonne등의31) 방법에 의하여 측정하였다. ABTS 7.
DPPH 라디칼 소거 활성은 Blois의30) 방법으로 측정하였다. 시료를 EtOH로 녹여 최종 농도가 25, 50, 75, 100 ㎍/㎖이 되도록 정량하여 96 well plate에 각 시료를 100 ㎕을 주입하고, 동시에 0.
7 Cells (2 × 105 cell/㎖) were pretreated with or without extract at indicated concentrations for 2 hour, and then incubated with or without 1㎍/㎖ LPS for 16 hours. NO released by cells was measured by the method of Griess.
PGE2의 측정은 R&D systems사가 제공하는 방법에 따라 실험하였다.
농축 및 동결건조 된 포도송이가지 EtOH 추출물의 총 폴리페놀 함량은 Folin–Denis reagent에17) 준하여 측정하였다.
세포배양액 내의 NO는 NO의 분해산물인 nitrite (NO2−)를 측정함으로써 NO의 양을 간접적으로 측정하는 Griess reagent 방법32)으로 측정하였다.
총 플라보노이드 함량 측정은 Moreno등의29) 방법에 따라 포도송이가지 추출물과 Quercetin을 각 농도별로 준비한 후 10% aluminum nitrate 0.1 ㎖, 1 M potassium acetate 0.1 ㎖ 및 EtOH 4.3 ㎖을 차례로 혼합하여 실온에서 40분동안 방치시켜 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
성능/효과
1. 총 폴리페놀 함량과 총 플라보노이드함량, DPPH, ABTS 라디칼 소거 활성 및 환원력이 우수하였다.
2. 포도송이가지 추출물이 염증과 관련된 COX-2, iNOS단백질 발현에 미치는 영향을 조사한 결과 COX-2와 iNOS 단백질 발현이 농도 의존적으로 줄어들었고, NO와 PGE2 생성 억제 여부를 관찰한 결과 포도송이가지추출물 농도 의존적으로 현저히 감소하였다.
3) IC50 : Sample concentration (㎍/㎖) was 50% activity loss.
3. 또한 B16/F10 세포에서 포도송이가지 추출물이 tyrosinase활성을 억제하고 TRP-1, TRP-2 발현을 억제하는 효과가 있음을 확인하였다.
그 결과 포도송이가지 추출물은 α-MSH에 의해 증가된 TRP-1과 TRP-2 단백질 발현을 농도 의존적으로 감소시켰다. 결과적으로 포도송이가지 추출물은 tyrosinase 활성을 억제하고 TRP-1과 TRP-2 발현을 감소시킴으로서 멜라닌 합성을 억제하였음을 알 수 있다.
그 결과 포도송이가지 추출물은 α-MSH에 의해 증가된 TRP-1과 TRP-2 단백질 발현을 농도 의존적으로 감소시켰다.
1). 그 결과 포도송이가지 추출물의 농도가 증가 할수록 염증매개인자인 PGE2 생성은 유의적으로 감소되었다.
또한 DPPH와 ABTS free radical 소거 활성이 좋은 것으로 알려진 합성 항산화제는 세포의 대사 및 미토콘드리아 전자전달계의 작용을 방해하며 발암성 및 독성이 강하다는 문제점이 보고되고 있다32). 따라서 본 연구에서 DPPH와 ABTS를 이용하여 포도송이가지 추출물의 항산화 활성을 평가한 결과, DPPH와 ABTS free radical 소거능은 포도송이가지 추출물이 농도(25, 50, 75, 100 ㎍/㎖) 의존적으로 현저하게 증가하였다. 환원력은 Ascorbic acid와 비교하여 연구하였다.
본 연구에서는 포도송이가지 추출물의 iNOs, COX-2 유전자 발현 억제 효과를 알아보고자 western blot을 수행하였다. 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포주에 LPS를 처리하여 염증을 유도 한 후 포도송이가지 추출물를 처리 한 결과, iNOs와 COX-2 유전자 발현은 농도 의존적으로 유의하게 감소되었다(Fig. 2). 이러한 결과는 NO 생성 저해와 유사한 경향을 보였다.
본 실험 결과 B16/F10 멜라닌세포에 멜라닌 합성 호르몬인 α-MSH을 처리한 후 포도송이가지 추출물을 처리한 군은 α-MSH 단독 처리 군에 비해서 농도 의존적으로 멜라닌 합성양이 감소되었으며, tyrosinase 활성 측정 결과 역시 포도송이가지 추출물을 처리한 군은 α-MSH 단독 처리 군에 비해서 티로시나아제 활성을 유의하게 억제하였다(Fig. 3).
이러한 결과를 바탕으로 포도송이가지 추출물의 우수한 항염효과와 노화 방지에 중요한 역할을 하는 탁월한 항산화 활성뿐 만 아니라 피부미용 분야에 주된 관심사인 미백효능을 통해 안전성을 확보하고 고부가가치를 창출할 수 있는 천연 유래소재 기능성 화장품이나 식품 등의 첨가물로서의 사용 가능성을 확인하였다.
포도송이가지 추출물의 항산화 성분을 측정하기 위해 총 폴리페놀과 총 플라보노이드 함량을 분석 한 결과 각각 약 7990 ± 32㎎/100g과 9110 ± 11㎎/100g 의 함량을 나타냈다(Table. 1).
후속연구
또한 Jeong 등34)은 Muscat Bailey A (MBA) 포도송이줄기를 첨가하여 제조한 포도주에 레스베라트롤 함량이 높을 뿐만 아니라, 항산화 효능 또한 우수한 것으로 나타났다. 따라서 본 연구결과에서 나타난 효능은 높은 폴리페놀 및 플라보노이드 성분에 의한 것으로 사료되며, 본 연구실에서 추가 연구를 통한 성분 분석을 진행 중에 있다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
멜라닌의 과잉 생산 및 축적이 피부에 미치는 영향은 무엇인가?
멜라닌은 피부의 멜라닌소체에서 만들어지고 피부 손상으로부터 피부를 보호하는데 있어 중요한 역할을 한다. 하지만 과도한 자외선에 노출 되거나, 환경오염을 포함한 외부 자극요인과 호르몬, 염증유발인자 등의 내부 자극요인이 동시에 작용하는 경우, 멜라닌은 과잉으로 생성 및 축적되어 기미, 주근깨, 검버섯, 과다색소침착증후군과 같은 피부장애를 일으키며, 피부노화를 촉진하고 피부암을 유발하게 된다14,15). 지금까지 알려져 있는 미백제는 멜라닌 합성에 중요한 효소인 티로시나아제 저해 활성에 집중하여 개발되었다.
폴리페놀물질이 항산화 작용을 하는 원리는 무엇인가?
대기오염과 기후변화로 인한 과도한 자외선 노출 등으로 인하여 기미나 주근깨와 같은 피부질환과 성인 여드름과 같은 각종 피부 트러블로부터 피부보호와 미백 등 건강한 피부에 관심은 더욱 증가하고 있는 추세이다8-10). 폴리페놀물질은 2개 이상의 폴리페놀릭 수산기를 가지고 있어 단백질 및 거대 분자들과 쉽게 결합하여 항염증과 항산화 등의다양한 생리활성 기능을 가진다고 알려져 있다. 페놀성 화합물은 유리기를 환원시키는 능력이 강하고 인체 내에서 천연 항산화제와 노화를 억제하는 척도로도 이용할 수 있다.
체내의 면역반응은 어떻게 일어나는가?
또한 염증은 병원균의 침입과 조직손상 뿐 만 아니라 외부의 물리적, 화학적인 자극에 의해 일어나는 생체조직 면역반응중 하나이며, 손상된 조직을 재생하려는 현상과 다양한 면역 세포에 의해 진행되는 복합적인 과정이다22-24). 이 과정에는 신체 내 대식세포가 다양한 항상성 유지에 관여하며 병원균 침입에 반응하여 여러 사이토카인과 같은 염증성 인자들을 유도하여 병원균을 제거한다25). 이러한 반응이 조절 되지 못하여 과도한 염증반응이 나타날 때 iNOS에 의해 생성되는 nitric oxide (NO)와 COX-2에 의해서 과량 만들어지는 PGE2 등과 같은 염증 촉진 인자들이 만들어지며, 이들 염증성인자들로 인해 다양한 아토피 등과 같은 질병이 걸릴 수 도 있고 사망에 이를 수 있다.
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