바이오 고분자인 알긴산 나트륨(Sodium Alginate)을 이용하여 기존의 방법에 비해 생산성이 우수한 캡슐화의 상업화 공정을 개발하고자 하였다. 또한, 동일 공정으로 키토산을 알긴산과 함께 캡슐화하여 알긴산 나트륨으로 캡슐화 된 유산균과 비교하였다. 유산균 캡슐화의 상업화 공정의 주요 공정은 캡슐화 후 기존의 동결건조 대신에 본 연구진이 개발한 생산성이 우수한 유동화 건조 방법에 의하여 건조시간을 15~24이상 단축할 수 있었지만, 생균수는 동결건조와 유동층 건조의 비율이 1:0.75로 동결건조 방법이 좋았다. 하지만 건조에 드는 비용과 시간을 고려 해 볼 때 유동층 건조 방법으로 상업화 공정이 가능함을 확인할 수 있었다. Chitosan-alginate 캡슐은 알긴산 칼슘캡슐과 생균수를 비교하였을 때, 알긴산을 이용한 캡슐은 희석배수 $10^{-9}$, 즉 약 $1{\times}10^9$ 마리 이상의 균이 존재하고, 키토산을 이용한 캡슐은 희석배수 $10^{-3}$, 즉 약 $1{\times}10^3$ 마리의 균이 존재함을 확인 할 수 있었다. 본 연구의 기술로 제조된 유산균 캡슐은 pH 4.65, 6.01에서 96시간 이상 동안 안정하였지만, pH 7.07, 8.35에서는 1시간 이내에 모두 붕해되었다. 이는 유산균 캡슐이 위산에서 안정성을 보이고 pH 7이상을 띠는 소화기관인 소장과 대장에서는 쉽게 붕해가 일어날 수 있음을 알 수 있었다.
바이오 고분자인 알긴산 나트륨(Sodium Alginate)을 이용하여 기존의 방법에 비해 생산성이 우수한 캡슐화의 상업화 공정을 개발하고자 하였다. 또한, 동일 공정으로 키토산을 알긴산과 함께 캡슐화하여 알긴산 나트륨으로 캡슐화 된 유산균과 비교하였다. 유산균 캡슐화의 상업화 공정의 주요 공정은 캡슐화 후 기존의 동결건조 대신에 본 연구진이 개발한 생산성이 우수한 유동화 건조 방법에 의하여 건조시간을 15~24이상 단축할 수 있었지만, 생균수는 동결건조와 유동층 건조의 비율이 1:0.75로 동결건조 방법이 좋았다. 하지만 건조에 드는 비용과 시간을 고려 해 볼 때 유동층 건조 방법으로 상업화 공정이 가능함을 확인할 수 있었다. Chitosan-alginate 캡슐은 알긴산 칼슘캡슐과 생균수를 비교하였을 때, 알긴산을 이용한 캡슐은 희석배수 $10^{-9}$, 즉 약 $1{\times}10^9$ 마리 이상의 균이 존재하고, 키토산을 이용한 캡슐은 희석배수 $10^{-3}$, 즉 약 $1{\times}10^3$ 마리의 균이 존재함을 확인 할 수 있었다. 본 연구의 기술로 제조된 유산균 캡슐은 pH 4.65, 6.01에서 96시간 이상 동안 안정하였지만, pH 7.07, 8.35에서는 1시간 이내에 모두 붕해되었다. 이는 유산균 캡슐이 위산에서 안정성을 보이고 pH 7이상을 띠는 소화기관인 소장과 대장에서는 쉽게 붕해가 일어날 수 있음을 알 수 있었다.
We aimed to develop commercialization process of encapsulation which is superior in productivity compared to existing methods by using sodium alginate. Also, in the same process, sodium alginate with chitosan was used to encapsulate lactic acid bacteria with the same process and then the viable cell...
We aimed to develop commercialization process of encapsulation which is superior in productivity compared to existing methods by using sodium alginate. Also, in the same process, sodium alginate with chitosan was used to encapsulate lactic acid bacteria with the same process and then the viable cell counts of the two encapsulated lactic acid bacteria were compared. As a test result of the fluidized drying process developed by the present researchers, it was found that the drying time was shortened by 15 to 20 hours compared to the freeze drying method, but the number of viable lactic acid bacteria was about 75% as compared with freeze drying. However, considering the cost and time of drying, it can be confirmed that the commercialization process is possible by the fluidized bed drying method. When the number of viable cells of Ca-alginate capsule and Chitosan-alginate capsule were compared, it was confirmed that there were about $1{\times}10^9$ or more bacteria in the former and about $1{\times}10^3$ in the latter. The lactic acid bacterium capsules prepared by the present technique were stable for 96 hours or more at pH 4.65 and 6.01, but disappeared within 1 hour at pH 7.07 and 8.35. This suggests that the disintegration of lactic acid bacteria can be easily occurred in small and large intestine.
We aimed to develop commercialization process of encapsulation which is superior in productivity compared to existing methods by using sodium alginate. Also, in the same process, sodium alginate with chitosan was used to encapsulate lactic acid bacteria with the same process and then the viable cell counts of the two encapsulated lactic acid bacteria were compared. As a test result of the fluidized drying process developed by the present researchers, it was found that the drying time was shortened by 15 to 20 hours compared to the freeze drying method, but the number of viable lactic acid bacteria was about 75% as compared with freeze drying. However, considering the cost and time of drying, it can be confirmed that the commercialization process is possible by the fluidized bed drying method. When the number of viable cells of Ca-alginate capsule and Chitosan-alginate capsule were compared, it was confirmed that there were about $1{\times}10^9$ or more bacteria in the former and about $1{\times}10^3$ in the latter. The lactic acid bacterium capsules prepared by the present technique were stable for 96 hours or more at pH 4.65 and 6.01, but disappeared within 1 hour at pH 7.07 and 8.35. This suggests that the disintegration of lactic acid bacteria can be easily occurred in small and large intestine.
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문제 정의
또한, 키토산과 알긴산을 이용한 코팅 방법은 현재 많은 연구 중에 있다. 그래서 키토산의 항균능력이 유산균에도 영향을 미치는지 알아보기 위해 다음 실험을 하였다.
따라서 본 연구에서는 상업적으로 경쟁력 있는 코팅 물질인 알기네이트를 이용하고, 보다 공정이 단순한 사출방식을 이용하여 생존율 및 장기보존성이 기존 기술과 동등 이상의 품질을 가지는 사출비드제조 공정의 대량생산 기술 및 고 효율 건조 기술을 개발하고자 하였다. 특히, 본 연구에서는 가장 널리 이용되는 동결건조방법 대신에 젖은 비드 건조에 맞도록 자체적으로 고안한 저온 유동층 건조 방법을 이용하여 비드 건조 후 각 샘플의 생균수 등을 측정하여 저온 유동화 건조장치의 적용 여부를 검토하고자 하였다.
특히, 본 연구에서는 가장 널리 이용되는 동결건조방법 대신에 젖은 비드 건조에 맞도록 자체적으로 고안한 저온 유동층 건조 방법을 이용하여 비드 건조 후 각 샘플의 생균수 등을 측정하여 저온 유동화 건조장치의 적용 여부를 검토하고자 하였다. 또한 이미 식품과 섬유 산업 등 다양한 분야에서 추가 코팅제로 사용되고 있는 키토산을 병용하여 본 기술로 유산균을 캡슐화 한 후 키토산이 유산균에 미치는 영향에 대해 연구하였다.
키토산과 알긴산을 동시에 사용하여 캡슐화 하는 경우 키토산과 알긴산의 정전기적 작용으로 캡슐의 세기가 증가하고 다공성으로 표면적이 넓어지기 때문에 캡슐의 활용에 이점으로 작용될 수 있으나 항균능력을 가지고 있기 때문에 이 특성이 유산균에 어떤 영향이 있는지를 확인하기 위해 다음 실험을 하였다.
따라서 본 연구에서는 상업적으로 경쟁력 있는 코팅 물질인 알기네이트를 이용하고, 보다 공정이 단순한 사출방식을 이용하여 생존율 및 장기보존성이 기존 기술과 동등 이상의 품질을 가지는 사출비드제조 공정의 대량생산 기술 및 고 효율 건조 기술을 개발하고자 하였다. 특히, 본 연구에서는 가장 널리 이용되는 동결건조방법 대신에 젖은 비드 건조에 맞도록 자체적으로 고안한 저온 유동층 건조 방법을 이용하여 비드 건조 후 각 샘플의 생균수 등을 측정하여 저온 유동화 건조장치의 적용 여부를 검토하고자 하였다. 또한 이미 식품과 섬유 산업 등 다양한 분야에서 추가 코팅제로 사용되고 있는 키토산을 병용하여 본 기술로 유산균을 캡슐화 한 후 키토산이 유산균에 미치는 영향에 대해 연구하였다.
제안 방법
0.5% (v/v) 아세트산 수용액에 1.0~2.0% (w/v) 키토산과 4% (w/v) CaCl2를 첨가한 후 0.5 M NaOH로 적정하여 pH 5에 고정한 키토산 수용액에 유산균을 첨가한 알긴산을 인젝터로 용액에 떨어뜨려 캡슐을 제조 하였다. 이 캡슐을 유동층 건조법으로 건조한 후 분쇄기에서 분쇄하여 80 µm 채에 쳐서 샘플을 채취하였다.
5% 알긴산 나트륨으로 제조된 캡슐을 사용하였다. 그의 대조군으로 캡슐화 하지 않은 유산균을 직접 사용하였다. 캡슐 샘플 1g을 PBS 10 ml에 넣고 실온에서 교반하며 정해진 시간마다 샘플을 채취하여 희석법에 의해 희석하여 MRS 배지를 이용하여 생균수를 측정하였다.
기존의 건조 방법에는 실온건조, 동결건조, 진공 건조, 질소 건조 등이 있는데 이중 가장 널리 이용되는 동결건조 기술과 본 연구의 유동층 건조와 비교 실험 하였다.
먼저 전자 현미경을 이용하여 팽윤 전의 캡슐의 지름을 측정하고 0.1 M 인산염 완충용액에 넣어 각각 실온(22±2 oC)에서 교반한 후 정해진 시간마다 샘플을 채취하여 지름을 측정하였으며 팽창율은 퍼센트로 아래와 같이 계산하였다.
캡슐의 제조 방법은 알긴산 칼슘의 제조와 흡사하지만 경화액에서 차이가 있다. 배양한 유산균 25 g, 1.5% 알긴산 나트륨수용액 435 g, CS 40 g을 균질기를 이용하여 3~5분간 혼합시켜 슬러지 형태로 만든 후, 인젝터를 이용하여 캡슐을 제조하였다. 알긴산 칼슘과 마찬가지로 키토산-알기네이트 캡슐 제조는 Fig.
본 실험에서는 연동펌프를 사용하여 약간 가압하여 슬러지를 유입하여 다중주입기 말단에 있는 피펫 팁(1~200 µl)을 통해 비드를 제조하였다.
유산균은 생성되는 때부터 죽기 시작하기 때문에 시간의 소요가 굉장히 중요한 요소로 작용한다. 유동층 건조는 특별 제작한 유동층 건조기에서 시행 하였으며, 건조 시간은 30~40분이 소요되었다. 수분을 적당히 제거한 샘플을 유동층 건조기에 넣은 후 공기를 유입하여 샘플이 공기에 의해 유동하며 건조가 보다 쉽게 이루어진다.
유산균 캡슐의 건조 후 생균수를 비교 측정하기 위하여 1.5% 알긴산 나트륨으로 만든 캡슐을 유동층 건조과 동결건조의 두 가지 방법으로 건조하였다. 유산균의 보관에서 가장 중요한 점은 유산균의 보관 환경과 시간이다.
이 캡슐을 유동층 건조법으로 건조한 후 분쇄기에서 분쇄하여 80 µm 채에 쳐서 샘플을 채취하였다. 이를 희석법으로 희석한 후BCP 배지를 이용하여 생균수를 측정하였다. 대조군으로는 pH 5에 고정시킨 4% CaCl2 수용액을 사용하였으며 이 결과를 Fig.
그의 대조군으로 캡슐화 하지 않은 유산균을 직접 사용하였다. 캡슐 샘플 1g을 PBS 10 ml에 넣고 실온에서 교반하며 정해진 시간마다 샘플을 채취하여 희석법에 의해 희석하여 MRS 배지를 이용하여 생균수를 측정하였다. 이때 배양 조건은 37 oC, 18~20 hr 이다.
캡슐을 제조한 후 기존의 건조 방법인 동결 건조방법과 본 연구에서 고안한 유동화 건조장치를 이용하여 건조한 캡슐을 비교 평가하였다. 유동층 건조 방법의 건조시간은 시료에 따라 조금의 차이는 있지만 보통 30~40분이 소요되었으며 동결 건조방법은 16~24시간이 소요되었다.
대상 데이터
본 연구에 사용한 균주인 Lac. acidophilus MG501은 ㈜메디오젠에서 균주를 제공받았다. 또한, Sodium alginate (Yakuri pure chemicals co.
이를 희석법으로 희석한 후BCP 배지를 이용하여 생균수를 측정하였다. 대조군으로는 pH 5에 고정시킨 4% CaCl2 수용액을 사용하였으며 이 결과를 Fig. 6에 나타내었다.
또한, Sodium alginate (Yakuri pure chemicals co.ltd,. kyoto, Japan), Chitosan (srustacean chitin, 9012-76-4,ICN Biomedical Inc.), Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O, 70~80% CaCl2, Aldrich), Sodium chloride (NaCl, 99.5%, Aldrich), Sodium Phosphate monobasic (NaH2PO4·2H2O, 98%, Aldrich), Sodium Phosphate dibasic (Na2HPO4·12H2O, 98~101.0%, Aldrich) 이용하였고, MRS broth (Becton, Dickinson and Company, France)과 BCP broth (Eiken chemical co., Ltd, Tokyo, Japan)를 배지로 사용하였다.
5% CaCl2 수용액에서 20~30분 경화 시킨 후, 증류수로 세척해준다. 본 실험에서는 1.0%, 1.5%, 3.0%의 알긴산 나트륨 수용액을 사용하였다.
이 경화액을 이용하여 캡슐을 제조하여 20~30분 경화 시킨 후 증류수로 세척한다. 본 실험에서는 1.5% 알긴산 나트륨 수용액과 1.0%, 2.0%, pH 5 경화액을 사용하였다.
본 배양은 중간 배양과 마찬가지로 중간 배양한 배양액을 MRS 배지에 접종하는데, 이때 MRS 배지는 미리 37℃으로 냉각해 둔다. 본 실험에서는 20 ml 균주 당 400 ml의 MRS 배지를 사용하였다. 중간 배양액 접종 후 37℃ 인큐베이터 안에서 18~20시간 동안 배양한다.
11에 나타내었다. 실험에 사용된 용액은 0.1 M phosphate buffer solution (PBS) (pH=7.07)이고 샘플은 1.5% 알긴산 나트륨으로 제조된 캡슐을 사용하였다. 그의 대조군으로 캡슐화 하지 않은 유산균을 직접 사용하였다.
캡슐은 알긴산 칼슘과 키토산-알기네이트로 제조 하였으며 제조 조건에 따라 여러 샘플을 제조하였으며, 제조 조건에 따른 샘플의 분류는 Table 1에 정리하였다.
이론/모형
각 물질의 가교 여부를 확인하기 위해 건조된 샘플을 분쇄하여 KBr 펠릿 법으로 FT-IR (excaliber series, BioRad)로 측정하였다. FT-IR 측정결과는 Fig.
성능/효과
FT-IR 측정 결과는 에서 -COOH와 -COO의 특성 피크의 세기가 감소함을 관찰할 수 있었으며 이것으로 칼슘 이온과 알긴산의 가교 반응을 확인할 수 있었고, 또한, 키토산과 알긴산이 결합함을 알 수 있었다.
건조전알긴산 칼슘과 키토산-알기네이트 캡슐의 표면과 단면을 SEM으로 비교 측정한 결과 키토산을 첨가 한 경우 키토산과 알긴산의 정전기적 반응에 의해 가교 밀도가 높고, 기공도 균일한 것을 알 수 있었다. 또한, 동결 건조한 경우는 유동화 건조한 경우에 비해 표면의 에그박스 형태가 상대적으로 많이 훼손 된 것을 알 수 있었지만 이 부분에 대해서는 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
일반적인 유동층 건조기를 이용하는 경우 장치 하부로 에어 펌프를 이용하여 공기를 유입시켜 건조 대상 물질의 유동화를 시키는 방법이지만, 젖은 비드가 장치 벽면에 달라붙거나 장치 아래쪽에 뭉치는 현상을 나타내는 등의 여러 문제점들이 나타났다. 따라서, 장치의 하부뿐만 아니라 벽면에도 공기를 유입할 수 있도록 추가로 공기 유입로를 만들어서, 유동층 건조시 초기에 유입된 젖은 유산균 캡슐이 유동층 건조기 벽면에 부착되어 유동화가 잘 되지 못하는 현상이나 하부로 뭉치는 현상 등을 방지하였다. 이 유동층 건조기는 Fig.
또한 보조 캡슐재료로 키토산을 이용한 경우 알긴산 칼슘보다 키토산-알기네이트가 산성뿐만 아니라 염기성에서도 강한 면을 보여주었다. 이는 키토산이 염기성 고분자이며, 알긴산과 키토산은 상호 정전기적 작용에 의해 보다 강한 네트워크를 형성할 수 있기 때문이다.
이는 알긴산의 농도가 높을수록 가교 결합이 많이 일어나고 캡슐의 세기가 단단하기 때문이라고 할 수 있다. 또한 키토산이 함유된 캡슐은 그렇지 않은 캡슐보다 캡슐의 세기가 단단한 것을 확인할 수 있는데 이것은 알긴산과 키토산의 정전기적 작용에 의한 것으로 추측된다. 또한 키토산은 염기성 바이오 고분자이므로 산성보다는 염기성에서 강함을 알 수 있다.
알긴산 캡슐의 경우 1400~1000 cm-1에서 -COOH와 -COO의 특성 피크의 세기가 감소함을 관찰할 수 있었으며, 이는 칼슘 이온과 알긴산의 반응 즉, 가교 반응에 기인한 것으로 생각된다. 또한, 키토산-알기네이트 캡슐은 키토산의 고유 피크인 1645cm-1와 그의 영향을받은 1569 cm-1에서 -NH2피크가생성되고, 1400~1000 cm-1에서 -COOH와 -COO의특성 피크의 세기가 감소함을 확인할 수 있다. 이는 키토산과 알기네이트가 결합하였고, 칼슘 이온에 의해 가교 결합이 일어났음 확인할 수 있었다.
알긴산을 이용한 캡슐은 희석배수 10-9, 즉 약 1×109 마리 이상의 균이 존재하고, 키토산을 이용한 캡슐은 희석배수 10-3, 즉 약 1×103 마리의 균이 존재함을 확인 할 수 있었다.
이로 미루어 볼 때 비록 유동층 건조 방법이 동결 건조 방법보다 ‘0.75:1’의 비로 생균수가 작지만, 짧을 건조 시간을 고려할 때 산업용으로 적용이 가능함을 알 수 있었다.
정해진 시간마다 생균수를 측정한 결과 알긴산나트륨은 pH 7 이상에서 서서히 붕해가 일어나며 내부 물질이 방출되었으며 약 40분 후 완전히 방출된 것을 확인할 수 있었다. 이는 소화기관에 투입 되었을 때 pH 7이상인 소장, 대장 기관에서 내부 물질인 유산균이 완전히 방출될 수 있음을 알 수 있다.
3에 나타내었다. 캡슐의 표면에서는 두 샘플 모두 에그박스(egg-box)형 결합을 하기 때문에 특이하게 다른 점을 찾을 수는 없었지만, 현미경사진에 의하면키토산을 첨가 한 경우 가교 밀도가 높고, 기공도 균일한 것을 알 수 있었다. 이것은 키토산과 알긴산의 정전기적 반응에 의한 것으로 생각된다.
캡슐이 소화기관에 투입 되었을 때 안정성을 알아보기 위해 pH 안정도, 팽윤 그리고 방출 실험을 한 결과 알긴산 나트륨을 이용하여 만든 캡슐은 산성에서는 단순 팽창만 일어나고 안정하지만 pH 7이상의 상태에서는 팽창과 붕해가 동시에 일어나 내부 물질을 완전히 방출함을 알 수 있었다. 이는 유산균을 함유한 캡슐이 인체 내에 투입되었을 때 위산에 잘 견뎌내고, 소장과 대장에서 붕해가 잘 일어날 수 있음을 보여준다.
키토산-알기네이트 와 키토산이 첨가되지 않은 캡슐의 생균수를 비교 측정한 결과 같은 조건에서 키토산이 첨가되지 않은 캡슐은 1 ml당 1×109 마리의 균이 존재하지만 키토산이 첨가된 캡슐은 1 ml당 1×103 마리의 균이 존재함을 알 수 있었다.
후속연구
건조전알긴산 칼슘과 키토산-알기네이트 캡슐의 표면과 단면을 SEM으로 비교 측정한 결과 키토산을 첨가 한 경우 키토산과 알긴산의 정전기적 반응에 의해 가교 밀도가 높고, 기공도 균일한 것을 알 수 있었다. 또한, 동결 건조한 경우는 유동화 건조한 경우에 비해 표면의 에그박스 형태가 상대적으로 많이 훼손 된 것을 알 수 있었지만 이 부분에 대해서는 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
그림에서 알 수 있듯이 동결 건조한 경우는 유동화 건조한 경우에 비해 표면의 에그박스 형태가 상대적으로 많이 훼손 된 것을 알 수 있다. 이 부분에 대해서는 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
상업적으로 유통되는 유산균의 종류에는 어떤 것들이 있는가?
현재 상업적으로 유통되고 있는 유산균은 무처리 유산균, 단백질 또는 전분으로 표면 코팅한 유산균, 과립화 유산균 및 캡슐화 유산균 등이 있다. 이 중 캡슐화 유산균이 다른 방법에 비해 위산 조건 및 담즙조건에서 보다 생존율이 우수한 것으로 알려져 있다.
알기네이트로 캡슐화할 때 킬레이트 물질, 인산염 등에 의해 떨어지는 안정성을 어떻게 보완하는가?
하지만 알기네이트로 캡슐화하는 경우 킬레이트 물질, 인산염, 젓산염, 시트르산염의 존재하는 경우 안정성이 떨어진다. 따라서, 추가 코팅[2,3] 하거나 양이온 고분자로 크로스링킹[4,5] 또는 전분을 혼합[6]하여 안정성을 높인다. 하지만 이런 추가적인 처리는 공정을 복잡하게 만들고, 긴 제조시간 및/또는 생산 단가의 상승 등의 문제점이 발생된다.
캡슐화 제조 공정은 어떤 단계들로 이루어지는가?
캡슐화 제조 공정은 크게 비드(bead) 제조 단계와 건조(분말화)단계로 나눌 수 있다. 사출 방식은 비드 제조 시 겔화 하는 데 장시간이 소요되므로 유화 방식에 비해 상대적으로 스케일업에 어려움이 있다.
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