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문제 정의
- 본 연구에서는 fusion tag system을 정제에 도입하여 봉지체의 용해도를 높이고 친화성 크로마토그래피를 사용하기 위해 Histidine tag를 도입하였다. 융합 단백질로 Maltose-binding protein (MBP), glutathione S-transferase (GST), thioredoxin (TRX), NUS A, ubiquitin (UB), small ubiqutin-related modifier (SUMO)이 있는데, 본연구에 사용된 Ubiquitin은 76개의 아미노산으로 구성된 작은 단백질이다.
가설 설정
- lane 1, size marker; lane 2, 1-fold; lane 3, 2-fold dilution; lane 4, 4-fold; lane 5, 8-fold; lane 6, 16-fold; lane 7, 32-fold. (B) non-reduced form. lane 1, blank; lane 2, 1-fold; lane 3, 2-fold dilution; lane 4, 4-fold; lane 5, 8-fold; lane 6, 16-fold; lane 7, 32-fold.
제안 방법
- 12). 15%의 젤 농도 상에서 목적하는 단백질을 1~32배까지 순차적 희석을 하여 최초 원액의 존재하는 총 불순물 밴드의 합이 마지막 32배에 존재하는 VEGF165 목적 단백질과 대비하여 간접적으로 순도확인을 해 보았다. 이때 최초 원액의 VEGF165 band를 100%라 보았을 때 32배 dilution band는 약 3.
- 이합체화을 위하여 2 단계로 나누어 투석을 진행했다. 1번째 투석은 20 mM tris, 200 mM NaCl, 0.2 M L-arginine, pH 9.0의 완충용액으로 2번씩 10회 완충용액 교환을 했다. 2번째는 20 mM sodium phosphate, 20 mM NaCl pH 7.
- 1차 his-tag 친화성 크로마토그래피를 위해서 BPG100/500 (Amersham Phamasia Biotech)컬럼에 Ni Sephaose 6 fast flow (GE Healthcare)resin 0.5 L을 충진 하였다. 유속 100 ml/min으로 정제수를 흘려서 보존액 20% ethanol을 제거하고, 평형 완충용액(2 M urea, 20 mM tris, 5 mM 2-mercaptoethanol, 500 mM NaCl, 20 mM imidazole, pH 8.
- 세척 후 100 mM NiSO4 용액으로 2 CV 흘린 후 30 min 동안 재순환하며 칼럼을 재생시켰다. 2차 친화성 컬럼의 평형완충용액(0.5 M urea, 20 mM tris, 1 mM mercaptoethanol, 500 mM NaCl, 40 mM imidazole, pH 8.5)을 유속 100 ml/min로 흘려 안정화시킨 후, 바로 샘플을 평형완충용액 조건에 맞추어 재조성하여 투입하고, 친화성 칼럼에 his-ub fusion tag와 기타 불순물은 결합시키고, VEGF가 함유된 flowthrough (FT) 분획을수집했다. 친화성칼럼에결합된 fusion tag과 불순물들은용리완충용액(0.
- 또한 가용화와 재접힘을 하나의 공정으로 진행하였다. 3 L 반응기 안에서 1 M urea, 10 mM CHES, 100 mM L-arginine, 5 mM EDTA, 15 mM L-cysteine, 2 mM dithiotreitol (DTT), pH 9.8의 조건과 교반속도 314 rpm, 기체공급량 5 mL/min로 상업적 생산을 위한 실험을 하였다. 순도는 RP-HPLC기준 84%, SEC (Size Exclusion Chromatogarhy) - HPLC 기준 99%였다.
- 6. 20분동안 0% 이동상 B 유지(50 to 70 min))을 프로그램하였고, 주입량은 20 µl로 설정하였다.
- FT, 세척 샘플을 모아 젤 여과 크로마토그래피 충진제 부피의 1%가 되도록 농축을 실시하였다. 젤 여과 크로마토그래피를 하기 위한 Sephacryl S-200를 XK16/100 컬럼에 충진하고, FPLC에 연결한 후 평형완충용액(10 mM sodium phosphate, 137 mM NaCl, pH 7.
- 6)로 안정화를 시키고, 샘플을 투입하였다. FT를 수집하고, 평형완충용액으로 기준선으로 떨어질 때까지 세척하여 이를 FT와 같이 수집 했다. 용리는 NaCl 농도를 50/100/150/200 mM 계단식으로 농도를 높여가며 수행하였다.
- 최종 정제 된 VEGF165의 순도를 측정하기 위한 RP-HPLC를 진행하였다. Fig. 13에서 VEGF165의 체류시간을 확인하기 위해 표준품 샘플을 0.5 mg/ml, 0.25 mg/ml, 0.125 mg/ml의 농도로 만들어 각각 주입하여, 표준품의 체류 시간을 조사하였다. 약 18분 대에서 3개의 표준품이 동일하게 나오는 것을 확인하였다.
- Insert gene (Ub-VEGF165)와 클로닝 Vector (pET28a)를 SacII/ ShoI 제한효소(Takara)을 이용하여 각각 37oC 2시간 반응시켰으며, agarose gel 전기영동을 통해 그 결과를 확인하였다. 확인된 젤을 추출하여 동일한 SacII/XhoI 처리된 조각과 vector를 T4 Ligase Enyme (Takara)을 이용하여 접합을 수행하였다.
- 순도와 분자량비교및 순도확인을위해 환원, 비환원조건에서의 전기영동을 진행하였다. Laemmli SDS-PAGE 전기영동 방법에 따라 15% 젤 농도의 SDS-PAGE를 조제하여 200 V, 60 mA, 55분동안 전기영동하였다. 이후 Coomasie blue 염색법으로 젤염색하였다.
- 3 mg/ml이 나왔다. TFF lab scale system (Millipore)을 이용하여 최종 0.5 mg/ml 농도로 농축하고, SDS-PAGE를 통해서 젤 여과 크로마토그래피 정제 후 샘플 순도를 조사하였다.
- lane 2~4번과 비교해 보았을 때 lane 7번의 최종 3차 봉지체 세척 후 침전물에서 순도가 개선된 봉지체를 확인할 수 있었다. Triton X-100이 cell debris에 부착된 불순 단백질을 잘 제거하기 위해 150 mM NaCl을 첨가하여 봉지체의 순도를 증진 시켰다.
- 융합 단백질로 Maltose-binding protein (MBP), glutathione S-transferase (GST), thioredoxin (TRX), NUS A, ubiquitin (UB), small ubiqutin-related modifier (SUMO)이 있는데, 본연구에 사용된 Ubiquitin은 76개의 아미노산으로 구성된 작은 단백질이다. Ubiquitin 융합단백질의 도입으로 인한 용해도 개선을 시도하였다. 이는 낮은 농도의 denaturants 및 detergents가 포함된 가용화 완충 용액 사용이 가능하다.
- VEGF165의 순도분석 목적으로 SDS-PAGE전기영동을 실시하였다(Fig. 12). 15%의 젤 농도 상에서 목적하는 단백질을 1~32배까지 순차적 희석을 하여 최초 원액의 존재하는 총 불순물 밴드의 합이 마지막 32배에 존재하는 VEGF165 목적 단백질과 대비하여 간접적으로 순도확인을 해 보았다.
- VEGF165의 역상 HPLC 상에서 순도 확인을 위한 실험을 진행하였다. 이동상 A (증류수 1L와 TFA 1 mL), 이동상 B (Acetonitrile 1 L와 TFA 1 mL.
- 9에서 보듯이 분리하였다. loading에서 보이는 밴드는 uncut-VEGF monomer, uncut-VEGF dimer, cutVEGF monomer, cut-VEGF dimer 그리고 his-ub tag 밴드가 있는데, 이 중 VEGF monomer와 목적하는 VEGF dimer가 FT, washing fraction으로 빠져나왔고, 용리 분획에서 histidine-ubiquitine fusion tag을 확인하였다.
- pET-28a 발현벡터를 이용한 재조합대장균을 제조하여 20L-scale의 회분식 배양에 최적화된 배양배지를 이용하여 wet cell weight 14 g/L의 세포배양을 하였고, 6×histidine-ubiquitine-VEGF165 (MW: 32 kDa)형태의 융합 단백질을 약 80 g의 inclusion body 형태(세척 후 purified IB)로 회수하였다.
- 각각의 콜로니는 탁도(OD, optical density) 0.8 까지 배양하였으며, IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, LPS, 367-93-1) 1 mM로 5시간 유도하였다.
- 5 M urea 조건에서 샘플의 침전도 거의 없고, 반응 수율이 높았다. 그래서 UF/DF system을 이용하여 최적 조건인 0.5 M urea, 20 mM tris, 1 mM mercaptoehanol, 250 mM NaCl, pH 8.5로 완충용액 교환 후 ubp1 10% (v/v)처리하였다. 실험결과 Fig.
- 그후 UF/DF 한외여과장치(pellicon, PLCCC-C, 5k)를 이용하여 효소 분해용 용액(0.5 M urea, 20 mM tris, 1 mM mercaptoethanol, 250 mM NaCl, pH 8.5)를 이용하여 2번씩 10회 완충용액을 교환하여 샘플 내 urea 농도를 낮추고, imidazole을 제거하였다. 이어서 효소 반응을 위해 Ubp1 (ubiqitin specific protease-1, 차바이오앤디오스 텍)을 10% (v/v)되도록 처리 후 항온 수조에서 37oC, 2시간동안 반응시켰다.
- 단백질의 histidine 잔기들이 고정화된 금속들에 결합하는 현상을 이용하여 his-tag 친화성 크로마토그래피를 수행하였다.
- Pizarro는 [13] VEGF165의 치료용 제제로 대량 생산에 성공하였다. 또한 가용화와 재접힘을 하나의 공정으로 진행하였다. 3 L 반응기 안에서 1 M urea, 10 mM CHES, 100 mM L-arginine, 5 mM EDTA, 15 mM L-cysteine, 2 mM dithiotreitol (DTT), pH 9.
- 상기 실험을 위해서예비실험으로결합여부및용리조건을확인하였다. 먼저젤을 XK16/20 컬럼에 충진하여 테스트하였다. Urea나 2-mercaptoethanol, EDTA는 결합능을 떨어뜨리기 때문에 기준 부피(12 mg His-tag protein/ml 젤)보다 1.
- 반응이 끝나면 각각의 튜브에 폐놀시약(folin-ciocalteureagent)을 125 μL씩 넣고 잘 섞은 후, 항온수조에서 30oC, 30분간 방치했다. 반응이 끝나면 UV-Vis Spectrophotometer로 750 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 표준곡선을 작성하였고 단백질 샘플의 농도를 결정하였다.
- 이어서 효소 반응을 위해 Ubp1 (ubiqitin specific protease-1, 차바이오앤디오스 텍)을 10% (v/v)되도록 처리 후 항온 수조에서 37oC, 2시간동안 반응시켰다. 반응종료 후 분리된 His-ubiquitin fusion tag와 1차 친화성 컬럼 정제에서 결합되었던 불순물을 제거하기 위하여 2차 친 화성 컬럼정제를 진행하였다. 이미 충진된 친화성 컬럼을 세척용 액(1 M imidazole, 0.
- 배양액에서 연속원심분리기(한일사이언스, tubular separator J-1050)로 세포를 회수했다. 회수된 세포는 298 g 이었고, 세포 무게가 15% (w/v)농도가 되도록 완충용액(50 mM tris (J.
- 이 단계에서 이합체화(dimerization)와 재접힘(refolding)을 수행 하고 이온교환크로마토그래피 주입 샘플을 만들었다. 변성제와 환원제가 제거되면서 이합체외에도 응집체 및 oligomer 형태가 되는데 이를 막기 위해서 2단계로 나누어 막을 이용해 완충용액 교환을 진행하였다. 1번째는 20 mM tris, 0.
- 접종 후 37 oC, 150 rpm, 10시간 동안 진탕배양기로 배양했다. 본 배양을 위하여 30 L 배양기(코바이오텍)에 20 L working volumn, 2 vvm 통기량, 교반기 속도 180 rpm,압력 0.3 bar pH 7.0으로 맞추어 놓았다. 본배양의 배지 조성은 Table 1과 같다.
- 단백질의 histidine 잔기들이 고정화된 금속들에 결합하는 현상을 이용하여 his-tag 친화성 크로마토그래피를 수행하였다. 상기 실험을 위해서예비실험으로결합여부및용리조건을확인하였다. 먼저젤을 XK16/20 컬럼에 충진하여 테스트하였다.
- 접합된 샘플은 DH5a competent cell을 이용하여 열처리 방법을 통해 형질전환 하였으며, Kan+ 선택배지에서 콜로니를 선택하였다. 선택된 콜로니에서 DNA를 추출하여 T7 Primer를 통하여 서열분석하여 확인하였다. 확인된 pET28a-Ub-VEGF Plasmid의 고발현을 위해 BL21(DE3)에 형질전환시켰다.
- 5)를 이용하여 재부유시켰다. 세포가 완전히 풀어질 때까지 현탁시켜 homogenizer (HS-2008)를 이용하여 압력을 900~950 bar까지 조절하면서 세포를 파쇄했다. 이것을 총 3회 반복하고, 종료 후 현미경을 확인하여 파쇄 여부를 확인했다.
- 순도와 분자량비교및 순도확인을위해 환원, 비환원조건에서의 전기영동을 진행하였다. Laemmli SDS-PAGE 전기영동 방법에 따라 15% 젤 농도의 SDS-PAGE를 조제하여 200 V, 60 mA, 55분동안 전기영동하였다.
- 8)를 10 CV 부피로 흘려서 UV 기준선을 영으로 안정시켰다. 안정화 후 VEGF165 샘플을 투입하면서 비결합된 flow through를 받아 놓았다. 다시 평형 완충용액으로 UV가 기준선으로 떨어질 때 까지 세척하였다.
- 6의 완충용액으로 2번씩 10회 완충용액 교환을 했다. 완충용액 교환 후 DEAE sepharose fast flow (GE Healthcare) 50 ml을 XK50 컬럼(Amersham phamasia Biotech)에 충진하고, FPLC (GE Healthcare, Aktaprime plus)에 연결하였다. 유속 20 ml/min 로 평형완충용액(20 mM sodium phosphate, 20 mM NaCl, pH 7.
- FT를 수집하고, 평형완충용액으로 기준선으로 떨어질 때까지 세척하여 이를 FT와 같이 수집 했다. 용리는 NaCl 농도를 50/100/150/200 mM 계단식으로 농도를 높여가며 수행하였다..
- 8 까지 배양하였으며, IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, LPS, 367-93-1) 1 mM로 5시간 유도하였다. 원심분리 후 SDS-PAGE를 통하여 발현을 확인하였다.
- 완충용액 교환 후 DEAE sepharose fast flow (GE Healthcare) 50 ml을 XK50 컬럼(Amersham phamasia Biotech)에 충진하고, FPLC (GE Healthcare, Aktaprime plus)에 연결하였다. 유속 20 ml/min 로 평형완충용액(20 mM sodium phosphate, 20 mM NaCl, pH 7.6)로 안정화를 시키고, 샘플을 투입하였다. FT를 수집하고, 평형완충용액으로 기준선으로 떨어질 때까지 세척하여 이를 FT와 같이 수집 했다.
- 융합단백질의 his-tag과 Ni 친화성을 이용하여 Ni-affinity 크로마토그래피를 수행하였다. 첫번째 친화성칼럼에서 250 mM imidazole 용액으로 용리하여 고순도의 융합단백질을 monomer 형태로의 정제를 하였고 효소반응을 통하여 his-ubiquitine tag을 제거 하였다.
- 이 단계에서 이합체화(dimerization)와 재접힘(refolding)을 수행 하고 이온교환크로마토그래피 주입 샘플을 만들었다. 변성제와 환원제가 제거되면서 이합체외에도 응집체 및 oligomer 형태가 되는데 이를 막기 위해서 2단계로 나누어 막을 이용해 완충용액 교환을 진행하였다.
- 세포가 완전히 풀어질 때까지 현탁시켜 homogenizer (HS-2008)를 이용하여 압력을 900~950 bar까지 조절하면서 세포를 파쇄했다. 이것을 총 3회 반복하고, 종료 후 현미경을 확인하여 파쇄 여부를 확인했다. 파쇄액의 부피를 정확히 측정하고, 완충용액을 이용하여 2배로 희석한 후 최종농도가 1%가 되도록 triton X-100 (덕산)을 첨가했다.
- 5)를 이용하여 2번씩 10회 완충용액을 교환하여 샘플 내 urea 농도를 낮추고, imidazole을 제거하였다. 이어서 효소 반응을 위해 Ubp1 (ubiqitin specific protease-1, 차바이오앤디오스 텍)을 10% (v/v)되도록 처리 후 항온 수조에서 37oC, 2시간동안 반응시켰다. 반응종료 후 분리된 His-ubiquitin fusion tag와 1차 친화성 컬럼 정제에서 결합되었던 불순물을 제거하기 위하여 2차 친 화성 컬럼정제를 진행하였다.
- 0로 희석하여 부피를 조정했다. 이합체화을 위하여 2 단계로 나누어 투석을 진행했다. 1번째 투석은 20 mM tris, 200 mM NaCl, 0.
- 2차 종배양 전량을 배양기 안에 무균적으로 접종했다. 접종 후 UV spectrophotometer (동일시마즈, UV-1700)을 이용하여 OD 3.0~4.0까지 성장시켰다. 목적하는 OD값에 도달하면 최종 1 mM가 되도록 유도제로써 IPTG를 이용하여 유도시켰다.
- 확인된 젤을 추출하여 동일한 SacII/XhoI 처리된 조각과 vector를 T4 Ligase Enyme (Takara)을 이용하여 접합을 수행하였다. 접합된 샘플은 DH5a competent cell을 이용하여 열처리 방법을 통해 형질전환 하였으며, Kan+ 선택배지에서 콜로니를 선택하였다. 선택된 콜로니에서 DNA를 추출하여 T7 Primer를 통하여 서열분석하여 확인하였다.
- DEAE 음이온 교환 컬럼을 통하여 재접힘과 농축 이후 발생된 변형체(monomer, polymer, misfdoling) 단백질과 endotoxin까지 분리할 수 있었다. 젤 여과 크로마토그래피를 이용하여 최종 dimer와 monomer를 분리하여 고순도의 fraction pool을 원하는 제품 농도에 맞게 제조하였다. 최종 목적 단백질의 특성분석을 하였고, SDSPAGE 전기영동, RP-HPLC 을 진행하여 RP-HPLC 기준으로 97% 이상의 순도를 얻었고, VEGF165의 제조를 위한 분리공정을 개발하였다.
- 융합단백질의 his-tag과 Ni 친화성을 이용하여 Ni-affinity 크로마토그래피를 수행하였다. 첫번째 친화성칼럼에서 250 mM imidazole 용액으로 용리하여 고순도의 융합단백질을 monomer 형태로의 정제를 하였고 효소반응을 통하여 his-ubiquitine tag을 제거 하였다. 그 후 투석을 통하여 재접힘을 하였다.
- 젤 여과 크로마토그래피를 이용하여 최종 dimer와 monomer를 분리하여 고순도의 fraction pool을 원하는 제품 농도에 맞게 제조하였다. 최종 목적 단백질의 특성분석을 하였고, SDSPAGE 전기영동, RP-HPLC 을 진행하여 RP-HPLC 기준으로 97% 이상의 순도를 얻었고, VEGF165의 제조를 위한 분리공정을 개발하였다.
- 최종 정제 된 VEGF165의 순도를 측정하기 위한 RP-HPLC를 진행하였다. Fig.
- 5)을 유속 100 ml/min로 흘려 안정화시킨 후, 바로 샘플을 평형완충용액 조건에 맞추어 재조성하여 투입하고, 친화성 칼럼에 his-ub fusion tag와 기타 불순물은 결합시키고, VEGF가 함유된 flowthrough (FT) 분획을수집했다. 친화성칼럼에결합된 fusion tag과 불순물들은용리완충용액(0.5M urea, 20mM tris, 1mM mercaptoethanol, 500 mM NaCl, 0.5 M imidazole, pH 8.5)로 제거하고 FT에서 SDSPAGE 전기영동을 통해서 VEGF165를 확인하였다.
- 그 후 투석을 통하여 재접힘을 하였다. 투석 중 응집방지를 위한 알칼리 pH (9.0)상태에서 200 mM NaCl, 200 mM L-arginine을 사용하였고, 두 번째로 pH 7.6으로 내리면서 VEGF165를 활성형의 dimeric form으로 만들었다.
- 이것을 총 3회 반복하고, 종료 후 현미경을 확인하여 파쇄 여부를 확인했다. 파쇄액의 부피를 정확히 측정하고, 완충용액을 이용하여 2배로 희석한 후 최종농도가 1%가 되도록 triton X-100 (덕산)을 첨가했다. 첨가 후 냉장 상태를 유지하면서 30 min 동안 교반을 실시했다.
- C 2시간 반응시켰으며, agarose gel 전기영동을 통해 그 결과를 확인하였다. 확인된 젤을 추출하여 동일한 SacII/XhoI 처리된 조각과 vector를 T4 Ligase Enyme (Takara)을 이용하여 접합을 수행하였다. 접합된 샘플은 DH5a competent cell을 이용하여 열처리 방법을 통해 형질전환 하였으며, Kan+ 선택배지에서 콜로니를 선택하였다.
대상 데이터
- 앞선 DEAE 크로마토그래피에서 분리하지 못한 monomer를 제거하기 위한 공정으로 젤여과크로마토그래피를 채택하였다(Fig. 11). 젤 여과 크로마토그래피의 경우 투입샘플의 부피가 젤 부피의 5% 이하가 되어야 목적하는 해상도를 얻을 수 있기 때문에 DEAE 음 이온 교환 크로마토그래피 FT와 세척 분획을 모아서 젤 부피의 1% 인 40 ml까지 농축하였다.
- 본 연구에서는 fusion tag system을 정제에 도입하여 봉지체의 용해도를 높이고 친화성 크로마토그래피를 사용하기 위해 Histidine tag를 도입하였다. 융합 단백질로 Maltose-binding protein (MBP), glutathione S-transferase (GST), thioredoxin (TRX), NUS A, ubiquitin (UB), small ubiqutin-related modifier (SUMO)이 있는데, 본연구에 사용된 Ubiquitin은 76개의 아미노산으로 구성된 작은 단백질이다. Ubiquitin 융합단백질의 도입으로 인한 용해도 개선을 시도하였다.
- VEGF165의 역상 HPLC 상에서 순도 확인을 위한 실험을 진행하였다. 이동상 A (증류수 1L와 TFA 1 mL), 이동상 B (Acetonitrile 1 L와 TFA 1 mL.)을 제조하였다. Shimadzu HPLC System (.
- 전북대학교사이토카인뱅크로부터 pGEMT-easy vector에 ubquitin -VEGF165 gene이 삽입 된 균주를 분양 받았고 DNA Extraction Mini Kit (Clonetech)를 이용하여 plasmid DNA를 확보하였다. 발현 벡터인 pET-28a vector (Novagen)에 Cloning 하기위해 삽입하 였다(Fig.
- 확인된 pET28a-Ub-VEGF Plasmid의 고발현을 위해 BL21(DE3)에 형질전환시켰다. 한천배지(Kan+)에서 콜로니를 확인하였고, 독립 콜로니를 10개를 취하여 발현 테스트를 하였다. 각각의 콜로니는 탁도(OD, optical density) 0.
이론/모형
- BL21 (DE3)에 cloning 된 VEGF165 발현을 배양 및 유도를 하 였고, Novagen pET system manual의 verification protocol에 따라 진행하였다. pET28a (+)는 5,369bp, T7 promotor, Kanamycin 저항능을 가지고 있다.
- 단백질 농도 분석은 Lowry법으로 수행하였다. 0.
- Laemmli SDS-PAGE 전기영동 방법에 따라 15% 젤 농도의 SDS-PAGE를 조제하여 200 V, 60 mA, 55분동안 전기영동하였다. 이후 Coomasie blue 염색법으로 젤염색하였다.
- UV 신호가 검출되기 시작하면 fraction collector로 10 ml씩 수집하였다. 젤 여과 크로마토그래피의 용리 분획 중 전기영동 순도가 높은 분획을 모아서 Lowry법으로 단백질 농도를 측정하였고, 최종농도가 0.5 mg/ml이 되도록 농축을 실시하였다. 크로마토그래피의 조건은 Table 2에 정리하였다.
성능/효과
- 회수된 세포에서 발현 위치를 확인한 결과 lane 4번의 periplasm영역에서는 거의 존재하지 않았고, lane 5번과 6번에서 발현됨을 확 인했다. 그 중 목적 단백질이 불용성의 봉지체로 형성됨을 확인하였다. Ubiquitin 융합 단백질의 영향으로 용해성 단백질으로 발현될 것이라는 예상과는 달랐다.
- 이는 ubp-1이 샘플 안에서 urea와 mercaptoehanol에 의해 효소 활성이 저하되는 것으로 사료되었다. 그래서 urea농도를 희석하여 실험한 결과 0.5 M urea 조건에서 샘플의 침전도 거의 없고, 반응 수율이 높았다. 그래서 UF/DF system을 이용하여 최적 조건인 0.
- 기존 Ubp-1관련 논문이나 실제 활성조건을 측정한 데이터를 기반으로 실험해본 결과중요 요인은 NaCl 농도, pH, 온도, 시간이였다. 하지만 이합체화 전까지 환원되고 비활성 상태의 샘플은 효소반응이 되지 않았다.
- Ubiquitin 융합 단백질의 영향으로 용해성 단백질으로 발현될 것이라는 예상과는 달랐다. 봉지체가 protease에 대한 저항성이 있어 단백질이 유지되는 장점을 가질 수 있고, 특히 정제공정에서 온화한 조건으로 가용화 됨을 발견하였다. 따라서 저농도의 urea를 사용할 수 있었다.
- 5배 더 충진하였고, 용리는 imidazole 농도 기 준으로 50/100/150/200/250 mM 계단식 용리를 하였다. 예비 실험 결과(Fig. 6) his-tag 단백질이 Ni 젤에 대한 친화성을 가지고 손실 없이 잘 결합하였다. 하지만 100 mM와 200 mM 사이에서 나왔다는 것은 urea와 mercaptoethanol의 간섭 효과로 융합단백질이 약하게 결합됨을 의미한다.
- 8를 보면 약 70%의 반응 수율을 보였다. 완충용액 교환 과정 에서 urea와 2-mercaptoethanol의 농도가 낮아지면서 VEGF에서 유도된 이합체 및 폴리머등의 불순물들이 보였고, 효소반응 후에 그 불순물 밴드에서 잘린 밴드를 관찰할 수 있었다.
- 이합체화 후 농축과정에서 보이지 않았던 oligomer protein들의 제거가 필요한데, DEAE 음이온 교환 크로마토그래피가 그 oligomer들의 제거에 탁월한 효과를 보여 주었다. Fig.
- 약 18분 대에서 3개의 표준품이 동일하게 나오는 것을 확인하였다. 최종 정제된 VEGF165 샘플을 주입한 결과 표준품과 동일한 시간대에 나옴을 확인하였지만 약 23분 대에 약한 피크가 보였다. 이것은 SDSPAGE gel 분석 결과를 참고하면 monomer form으로 예측하였다.
- 5 kDa)으로 예상 분자량은 약 32 kDa을 띄고 있다. 회수된 세포에서 발현 위치를 확인한 결과 lane 4번의 periplasm영역에서는 거의 존재하지 않았고, lane 5번과 6번에서 발현됨을 확 인했다. 그 중 목적 단백질이 불용성의 봉지체로 형성됨을 확인하였다.
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