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문제 정의
- 본 연구에서는 상동 영역 길이에 따라 체세포에 있어서 knock-in 효율을 검증하기 위하여 5’ arm과 3’ arm의 길이가 다른 knock-in 벡터를 제작하였다.
- 본 연구에서는 체세포에 있어서 knock-in 벡터의 활용과 knock-in 벡터의 상동영역 크기에 따른 knock-in 효율의 검증을 위하여 positive 선별마커가 PGK-neo인 knockin 벡터를 3가지 제작하였다.
- 3B에 제시한 바와 같이 TALEN을 도입하고 T7 endonuclease Iassay를 실시한 결과, indel에 의하여 313 bp와 135 bp의 절단된 단편을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는, 세포에서 본 실험에서 사용한 TALEN이 내인성 target을 절단하는 좋은 활성을 나타내고 있음을 제시한 것이다.
제안 방법
- β-casein exon 8 3’ arm I(0.64 kb)은 기존에 확보된 pGEM T-easy_β-casein exon 8-exon 9 3’ arm을 주형으로 사용하고, HindIII S primer(AAGCTTCTAACTGTGCTGTTTAACTTCTGATGTT)와 SalI AS primer(GTCGACAAAAGTGAGGAGGGGGCA- TTCACTT) 쌍을 이용하여 PCR 동정하였다.
- β-casein exon 8-exon 9 mutant 3’ arm II(1.8 kb)는 3’ arm의 5’ 말단에 HindIII 제한효소의 사용을 위하여 먼저 3’ arm 640 bp 위치에 있는 HindIII 제한효소 위치에 po-int mutation을 삽입하여 제한효소 부위가 작동하지 못하도록 변이를 도입한 후 PCR로 동정하였다.
- 1.06 kb의 5’ arm을 동정하기에 앞서 먼저 TALEN 결합 부위가 β-casein 유전자의 exon 7 위치에 존재하므로 아미노산 번역에는 변화가 없도록 TALEN 결합 부위에 변이를 도입하였다.
- 2차 PCR에 있어서 3’ arm PCR은 genome DNA 100 ng을 이용하여 위의 1차 PCR과 동일한 조건에서 실시하였다.
- 2차 PCR에 있어서 5’ arm PCR은 10ng의 genome DNA을 주형으로 이용하고, S primer (CA- GCTGTATAACCTTGGCTCCATGTTTCTC)와 AS primer(TGCTAAAGCGCATGCTCCAGACTGCCTTGG)을 이용하고 FX Neo DNA polymerase(Toyobo)로 실시하였다.
- 2차 PCR에서는 3’ arm PCR, 5’ arm PCR과 targeted와 non-targeted PCR을 실시하여 knock-in 여부를 확인하였다.
- 3’ arm을 연결하기 위하여 pBSK(-)m_β-casein m5’_F2A_endostatin_BGH polyA_PGKneo 플라스미드를 HindIII와 SalI으로 절단하여 벡터를 구축한 다음 pGEM T-easy_β-casein exon 8 3’ arm I 플라스미드로부터 확보한 3’ arm 단편(HindIII-SalI)을 subclo- ning하여 pBSK(-)m_β-casein m5’_F2A_endostatin_ BGHpolyA_PGK-neo_3’ I 플라스미드를 확보하였다.
- 5’ arm PCR은 1차 PCR에서 positive로 확인된 세포로부터 제조한 genome DNA (10ng)을 주형으로 이용하고, cEndo 5‘ arm S primer (GC- TGTTAGCTGAAAACATCTGGATGGCTGG)와 cEndo 5’ arm AS primer(TGCTAAAGCGCATGCTCCAGACTG- CCTTGG)를 사용하여 PCR을 수행하였다.
- 5’ arm PCR은 1차 PCR에서 positive로 확인된 세포로부터 제조한 genome DNA(10 ng)을 주형으로 이용하고, Sprimer(GTAGGAACATTTCCAGACTAGGGACTG)와 AS primer(TGCTAAAGCGCATGCTCCAGACTGCCTTGG)을 사용하여 LA Taq polymerase with GC buffer(Ta- kara)로 실시하였다.
- Targeted된 allele과 non-targeted allele을 동시에 확인할 수 있는 targeted와 non-targeted PCR은 다음과 같이 실시하였다. 50 ng의 genome DNA을 주형으로 이용하고 S primer(GTAGGAACATTTCCAGAC- TAGGGACTG)와 AS primer(TGGTACACTGATGGAA- ATTGCTACTATTGG)을 사용하고, PrimeSTAR HS DNA polymerase with GC buffer(Takara)로 실시하였다. PCR은 95℃ 10초, 58℃ 5초, 72℃ 5분 30초에서 33 cycle을 수행하였다.
- 젖소 섬유아세포에 knock-in 벡터의 도입은 전기천공법(electroporation)을 이용하여 보고된 이전 방법을 다소 변경하여 실시하였다(Jeong 등, 2015). 90% 정도 confluence하게 배양한 젖소 섬유아세포를 EDTA-PBS로 1회세척한 후 0.25% Trypsin-EDTA를 처리하였다. 세포를 배양액으로 현탁한 다음 800 rpm에서 5분간 원심분리하여세포를 회수하였고 다시 Ham’s F-10(Gibco-BRL, Waltham, USA) 배양액으로 현탁한 다음 원심분리 후 세척하였으며 회수된 세포는 1.
- BGH polyA 단편을 endostatin 뒤에 삽입하기 위하여 pBSK (-)m_β-caseinm5’_F2A_endostatin 플라스미드를 BamHI와 EcoRI으로절단하여 벡터를 제조한 후 pGEM T-easy_BGH polyA(BamHI-EcoRI) 플라스미드로부터 확보한 BGH polyA 단편(BamHI-EcoRI)을 subcloning하여 pBSK(-)m_β-caseinm5’_F2A_endostatin_BGH polyA 플라스미드를 확보하였다.
- DT-A_cEndo Knock-in 벡터가 도입된 체세포의 1차 PCR은 cEndo 3’ arm S primer(TGCTTGCCGAATATC- ATGGTGGAAAAT)와 cEndo 3’ arm AS primer(ACC- ACACTGTAGAGCTGTGATTCAGATACC)을 사용하고, 20μL의 세포 현탁액을 이용하여 Ex Taq polymerase (Ta- kara, Shiga, Japan)로 실시하였으며, PCR 조건은 94℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 3분에서 35 cycle을 수행하였다.
- DT-A_tEndo Knock-in 벡터 II가 도입된 체세포의 1차 PCR은 S primer(TGTGGCGGACCGCTATCAGGACAT- AGCGTT)와 AS primer(ACCACACTGTAGAGCTGTGA- TTCAGATACC)을 사용하고, Ex Taq DNA polymerase(Takara)로 실시하였다. PCR은 94℃ 30초, 56℃ 30초, 72℃ 3분에서 35 cycle을 수행하였다.
- DT-A_tEndo Knock-in 벡터 II을 제작하기 위하여 pBSK(-)m_β-casein m5’_F2A_endostatin_BGH polyA_PGKneo_3’ I 플라스미드를 HindIII와 SalI으로 절단하여 벡터를 제작한 다음 pGEM T-easy_β-casein exon 8-exon 93’ arm II 플라스미드로부터 확보한 3’ arm 단편(HindIII-SalI)을 subcloning하여 pBSK(-)m_β-casein m5'_F2A_endostatin_BGH polyA_PGK-neo_3’ II 플라스미드를 확보하였다.
- DT-A_tEndo Knock-in 벡터 I가 도입된 체세포의 세포 추출물을 이용한 1차 PCR은 S primer(CGATCAGGAT- GATCTGGACAAGAGCATCA)와 AS primer(TTCTATC- CCCCTTTTAAGTCCCATATCTGG)을 이용하고, Ex Taq DNA polymerase(Takara)을 사용하여 실시하였다. PCR조건은 94℃ 30초, 63℃ 30초, 72℃ 1분 30초에서 35 cy- cle를 수행하였다.
- Endostain 유전자는 knock-in 벡터 제작 시 제한효소 사용을 위해 3’말단의 제한효소를 다르게 2가지를 동정하였다.
- Kno- ck-in 벡터 제작에 사용할 1.06 kb의 5’ arm을 확보하기 위하여 양쪽 TALEN 결합 부위에 변이가 도입된 pGEMT-easy_β-casein L2-DAS 플라스미드를 주형으로 아래와 같이 PCR을 수행하였다.
- Knock-in 벡터 구축을 위한 β-casein exon 8-exon 9을 포함하는 3’ arm(1.8 kb)은 기존에 확보되어 있는 T-easy_βCE3 플라스미드를 주형으로 사용하고, SalI S primer(GTCGACCTAAATTTACTAAC- TGTGCTGTTTAACTTCTGAT)와 XhoI AS primer(CTC- GAGTATTCAATTTTAATTTTCCACAGCTCT) 쌍을 이용하여 PCR 증폭하였다.
- Knock-in 벡터 구축을 위한 4.95 kb의 5’ arm은 ge- nome DNA를 주형으로 사용하고, NotI S primer(GCGG- CCGCGAATTGAGAGCCATGAAGGTC)와 SalI AS pri- mer(GTCGACAATAATAGGGAAGGGTCCCCGGAC) 쌍을 이용하여 PCR 증폭하였다.
- Knock-in 벡터의 염기배열 결정으로 β-casein exon 7,F2A 염기서열, 그리고 endostatin 유전자의 염기서열을 연결하였을 때의 nucleotide와 아미노산 서열을 Fig. 2에 제시하였다.
- MAC-T 세포를 6 mm dish에 2×105세포로 seeding한 다음 1일 후에 각 left, right TALEN DNA 6ug을 이용하여 DharmaFECT regent(Thermo, Waltham,USA)로 transfection을 실시하였다.
- 5’ arm PCR은 1차 PCR에서 positive로 확인된 세포로부터 제조한 genome DNA(10 ng)을 주형으로 이용하고, Sprimer(GTAGGAACATTTCCAGACTAGGGACTG)와 AS primer(TGCTAAAGCGCATGCTCCAGACTGCCTTGG)을 사용하여 LA Taq polymerase with GC buffer(Ta- kara)로 실시하였다. PCR 조건은 94℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 2분 30초에서 33 cycle을 수행하였다. PCR 산물의 확인은 0.
- PCR에는 100 ng의 genome DNA을 주형으로 이용하고, S Pri- mer(GCTGTTAGCTGAAAACATCTGGATGGCTGG)와 AS primer(TGGTACACTGATGGAAATTGCTACTATTGG)을 사용하였으며, PrimeSTAR HS DNA polymerase with GC buffer(Takara)로 PCR을 실시하였다. PCR 조건은 95℃ 10초, 58℃ 5초, 72℃ 5분 30초에서 33 cycle을 수행하였다. PCR 산물의 확인은 0.
- 5’ arm PCR은 1차 PCR에서 positive로 확인된 세포로부터 제조한 genome DNA (10ng)을 주형으로 이용하고, cEndo 5‘ arm S primer (GC- TGTTAGCTGAAAACATCTGGATGGCTGG)와 cEndo 5’ arm AS primer(TGCTAAAGCGCATGCTCCAGACTG- CCTTGG)를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 98 ℃ 10초, 74℃ 3분에서 5 cycle, 98℃ 10초, 72℃ 3분에서 5 cycle, 98℃ 10초, 70℃ 3분에서 5 cycle, 98℃ 10초, 68 ℃ 3분에서 20 cycle의 조건으로 PCR을 수행하였다. PCR 산물의 확인은 0.
- Targeted된 allele과 nontargeted allele을 동시에 확인할 수 있는 targeted와 non-targeted PCR은 다음과 같이 실시하였다. PCR에는 100 ng의 genome DNA을 주형으로 이용하고, S Pri- mer(GCTGTTAGCTGAAAACATCTGGATGGCTGG)와 AS primer(TGGTACACTGATGGAAATTGCTACTATTGG)을 사용하였으며, PrimeSTAR HS DNA polymerase with GC buffer(Takara)로 PCR을 실시하였다. PCR 조건은 95℃ 10초, 58℃ 5초, 72℃ 5분 30초에서 33 cycle을 수행하였다.
- DT-A_tEndo Knock-in 벡터 II가 도입된 체세포의 1차 PCR은 S primer(TGTGGCGGACCGCTATCAGGACAT- AGCGTT)와 AS primer(ACCACACTGTAGAGCTGTGA- TTCAGATACC)을 사용하고, Ex Taq DNA polymerase(Takara)로 실시하였다. PCR은 94℃ 30초, 56℃ 30초, 72℃ 3분에서 35 cycle을 수행하였다. PCR 산물의 확인은 0.
- 50 ng의 genome DNA을 주형으로 이용하고 S primer(GTAGGAACATTTCCAGAC- TAGGGACTG)와 AS primer(TGGTACACTGATGGAA- ATTGCTACTATTGG)을 사용하고, PrimeSTAR HS DNA polymerase with GC buffer(Takara)로 실시하였다. PCR은 95℃ 10초, 58℃ 5초, 72℃ 5분 30초에서 33 cycle을 수행하였다. PCR 산물의 확인은 0.
- PCR은 HindIII S primer(AAGCTTCTAACTGTGCTGTTTAACTTCT- GATGTT)와 SalI AS primer(GTCGACTATTCAATTTTA- ATTTTCCACAGC) primer 쌍을 이용하여 변이가 도입된 전체 3’ arm을 동정하였다.
- 06 kb의 5’ arm을 확보하기 위하여 양쪽 TALEN 결합 부위에 변이가 도입된 pGEMT-easy_β-casein L2-DAS 플라스미드를 주형으로 아래와 같이 PCR을 수행하였다. PCR은 NotI S primer (GCG- GCCGCGGCACTTAGGCCAAATTCTAAATC)와 XhoI AS primer(CTCGAGACAATGATAGGAAAGGGTCCCCG)을 이용하여 실시하였다. Knock-in 벡터 구축을 위한 β-casein exon 8-exon 9을 포함하는 3’ arm(1.
- 3 kb의 5’ arm을 확보하기 위하여 위에서 확보한 1,060 bp의 단편 238 bp의 단편을 1:1로 혼합한 후 이 혼합된 DNA 용액을 주형으로 이용하여 아래와 같이 PCR을 수행하였다. PCR은 NotI 제한효소 site가 포함된 sense(GCGGCCGCGGCAC- TTAGGCCAAATTCTAAATC)와 AS2 primer(TCAGAAT- CTCCACGGGTAAGCCTA)을 사용하여 실시하였다. 왼쪽 TALEN 결합 부위의 point mutation을 도입하기 위하여다음과 같이 PCR을 수행하였다.
- PCR은 Solg™ Pfu DNA polymerase(Solgent, Daejun, Korea)을 이용하여 94℃ 30초, 62℃ 40초, 72℃ 1분의 33cycle의 조건에서 실시하였다.
- DT-A_tEndo Knock-in 벡터 I가 도입된 체세포의 세포 추출물을 이용한 1차 PCR은 S primer(CGATCAGGAT- GATCTGGACAAGAGCATCA)와 AS primer(TTCTATC- CCCCTTTTAAGTCCCATATCTGG)을 이용하고, Ex Taq DNA polymerase(Takara)을 사용하여 실시하였다. PCR조건은 94℃ 30초, 63℃ 30초, 72℃ 1분 30초에서 35 cy- cle를 수행하였다. PCR 산물의 확인은 0.
- , Wisconsin,USA)에 클로닝하여 염기서열을 결정하여 TALEN 절단 부위의 insertion과 deletion(indels) 현상을 확인하였다. T7 endonuclease I에 의한 활성 측정은 먼저 PCR prod- uct를 QIAgen quick Gel extract Kit(QIAgen, Venlo, Ne- derland)로 처리한 후 450ng의 DNA을 이용하여 실시하였다. 먼저 DNA 단편을 PCR 기계를 이용하여 95℃에서 10분 처리한 다음 85℃ 1분, 75℃ 1분, 65℃ 1분, 55℃ 1분, 45℃ 1분, 35℃ 1분, 25℃ 1분 처리하였다.
- TALEN의 활성을 검증하기 위하여 MAC-T 세포에 TALEN을 도입하고, 절단 부위를 포함하는 부분을 PCR 증폭하여 T7 endonuclease I assay를 실시하였다. Fig.
- MAC-T 세포를 6 mm dish에 2×105세포로 seeding한 다음 1일 후에 각 left, right TALEN DNA 6ug을 이용하여 DharmaFECT regent(Thermo, Waltham,USA)로 transfection을 실시하였다. TALEN의 활성을 측정하기 위하여 먼저 TALEN에 의하여 절단될 수 있는 부위를 포함하는 단편을 TALEN S(GAGTCTCCAAAGT- GAAGGAGGCTATGG)와 TALEN AS(GGTTCTCAACA- GACCAATTAAATCATAGT) primer 쌍을 이용하여 PCR을 실시하였다. PCR은 Solg™ Pfu DNA polymerase(Solgent, Daejun, Korea)을 이용하여 94℃ 30초, 62℃ 40초, 72℃ 1분의 33cycle의 조건에서 실시하였다.
- 2 kb의 밴드를 확인하였다. Targeted 된 allele과 non-targeted allele을 동시에 확인할 수 있는 targeted와 non-targeted PCR은 DT-A_tEndo Knock-in 벡터 I가 도입된 체세포의 PCR 분석 방법과 동일한 방법으로 수행하였다.
- pBSK (-)_β-casein 3'_PGK-neo 플라스미드를 NotI와 EcoRI으로 잘라서 벡터를 제작한 후 pBSK(-)_β-casein 5’_F2A_endostatin_BGH polyA 플라스미드를 NotI와 EcoRI으로 잘라서 제작한 삽입체를 삽입하여 클로닝하였다.
- pBSK(-)_β- casein 5’_F2A 플라스미드는 NotI와 KpnⅠ으로 잘라 첫 번째 삽입체를 제작하고, pBSK(-)_endostatin_BGH poly- A 플라스미드를 KpnI와 EcoRI으로 잘라서 두번째 삽입체를 제작하였다.
- pBSK(-)_β-casein exon 2-exon 7 5’ arm 플라스미드를 SalI와 Kpnl으로 절단하여 벡터를 제작하고, pGEM T-easy_Furin-2A 플라스미드를XhoI와 KpnI으로 절단하여 삽입체를 제작한 후 연결하였다.
- pBSK(-)_PGK-neo 플라스미드를 SalI와 XhoI으로 잘라서 벡터를 제작하고, pGEM T-easy_β-casein exon 8-exon 9 3’ arm 플라스미드를 SalI와 XhoI으로 잘라서 삽입체를 제작한 다음 벡터에 ligation시켰다.
- pGEM T-easy_β-casein exon 7 mutant 5’ arm 플라스미드를 NotI와 XhoI으로 절단하여 약 1.06kb의 단편을 확보하고 pBKS(-)_F2A_endostatin 플라스미드를 XhoI와 XbaI으로 절단한 F2A_endostatin 단편을pBSK(-)m를 NotI와 XbaI으로 절단한 벡터에 각 단편을 3 fragment liagtion시켜 pBSK(-)m_β-casein m5’_F2A_en- dostatin 플라스미드를 확보하였다.
- pBSK(-)_β- casein 5’_F2A 플라스미드는 NotI와 KpnⅠ으로 잘라 첫 번째 삽입체를 제작하고, pBSK(-)_endostatin_BGH poly- A 플라스미드를 KpnI와 EcoRI으로 잘라서 두번째 삽입체를 제작하였다. 그 후, NotI와 KpnI으로 잘라 제작한pBSK(-)/NotI-KpnI 벡터에 3 fragment ligation으로 클로닝하였다. pBSK(-)_PGK-neo 플라스미드를 SalI와 XhoI으로 잘라서 벡터를 제작하고, pGEM T-easy_β-casein exon 8-exon 9 3’ arm 플라스미드를 SalI와 XhoI으로 잘라서 삽입체를 제작한 다음 벡터에 ligation시켰다.
- pBSK(-)_β-casein exon 2-exon 7 5’ arm 플라스미드를 SalI와 Kpnl으로 절단하여 벡터를 제작하고, pGEM T-easy_Furin-2A 플라스미드를XhoI와 KpnI으로 절단하여 삽입체를 제작한 후 연결하였다. 그리고 pGEM T-easy_endostatin(KpnI-SalI) 플라스미드를 KpnI와 SalI으로 잘라서 첫 번째 삽입체를 제작하고, pGEM T-easy_BGH polyA(XhoI-EcoRI) 플라스미드를XhoI와 EcoRI으로 잘라서 두 번째 삽입체를 제작하였으며, KpnI와 EcoRI으로 절단 제작한 pBSK(-)/KpnI-EcoRI 벡터에 3 fragment ligation으로 클로닝하였다. pBSK(-)_β- casein 5’_F2A 플라스미드는 NotI와 KpnⅠ으로 잘라 첫 번째 삽입체를 제작하고, pBSK(-)_endostatin_BGH poly- A 플라스미드를 KpnI와 EcoRI으로 잘라서 두번째 삽입체를 제작하였다.
- 따라서 본 연구에서는 젖소 β-casein 유전자의 exon 7 위치를 특이적으로 절단할 수 있는 TALEN을 사용하여 knock-in 벡터의 5‘ 및 3’ 상동영역의 길이에 따라 젖소 체세포에서 knock-in 효율을 확인하였다.
- 또한 273 bp의 3’단편을 확보하기 위하여 앞에서 확보한 오른쪽 TALEN 결합 부위에 변이가 도입된 pGEM T-easy_β casein R2-RR 플라스미드를 주형으로 사용하고, S2(CCTAGTAC- AGGCTCTTGGTAGAGC)와 AS2 primer (TCAGAATCT- CCACGGGTAAGCCTA)을 이용하여 PCR을 수행하였다.
- 먼저 기존에 HepG2 세포로부터 RT-PCR에 의하여 확보되어 있는 T-easy_endostain 플라스미드를 주형으로 사용하고, KpnI S primer(GGTACCCACAGCCACCGCGACTTCCA- GCCGGTGCTC)와 SalI AS primer(GTCGACCTACTT- GGAGGCAGTCATGAAGCTGTTCTC) primer 쌍을 이용하여 PCR을 실시하였다. 또한 KpnI와 XbaI 제한효소 site를 가지는 단편을 확보하기 위하여 KpnI S primer와 XbaI AS primer(TCTAGACTACTTGGAGGCAGTCATG- AAGCTGTTCTC) 쌍을 이용하여 PCR 증폭하였다. Kno- ck-in 벡터 구축 시 사용된 Furin-2A(F2A), Bovine growth hormone PolyA(BGH polyA)와 PGK-neo 유전자는 이전에 확보되어 있는 단편을 이용하였다(Jeong 등, 2015).
- 마커 유전자인 PGK-neo 유전자를 삽입하기 위하여 기존에 확보되어 있는 pBSK(-)/ pKJ2-neo(EcoRI-HindIII) 플라스미드를 EcoRI와 HindIII로 절단하여 PGK-neo(EcoRI- HindIII) 단편을 확보한 다음 pBSK(-)m_β-casein m5’_F2A_endostatin_BGH polyA 플라스미드를 EcoRI와 HindIII로 절단하여 제조한 벡터에 subcloning하여 pBSK(-)m_β-casein m5’_F2A_endostatin_BGH polyA_PGK-neo 플라스미드를 확보하였다.
- T7 endonuclease I에 의한 활성 측정은 먼저 PCR prod- uct를 QIAgen quick Gel extract Kit(QIAgen, Venlo, Ne- derland)로 처리한 후 450ng의 DNA을 이용하여 실시하였다. 먼저 DNA 단편을 PCR 기계를 이용하여 95℃에서 10분 처리한 다음 85℃ 1분, 75℃ 1분, 65℃ 1분, 55℃ 1분, 45℃ 1분, 35℃ 1분, 25℃ 1분 처리하였다. 이렇게 처리된 DNA에 T7 endonuclease I(NEB, Ipswich, USA) 1μL(2 또는 4 unit)을 넣고 37℃에서 15분 처리한 후 2% 아가로스 젤에서 전기영동하여 절단된 단편을 확인하였다.
- DT-A_tEndo Knock-in 벡터 I의 제작은 다음과 같이 실시하였다. 먼저 F2A(XhoI-KpnI)과 endostatin 유전자(KpnI- XbaI)을 pGEM T-easy_Furin-2A 플라스미드와 pGEMT-easy_endostain 플라스미드로부터 제한효소 절단에 의하여 확보한 다음 pBKS(-)/XhoI-XbaI 벡터에 3 fragment ligation을 실시하여 pBKS(-)_F2A_endostatin 플라스미드를 확보하였다. pGEM T-easy_β-casein exon 7 mutant 5’ arm 플라스미드를 NotI와 XhoI으로 절단하여 약 1.
- Endostain 유전자는 knock-in 벡터 제작 시 제한효소 사용을 위해 3’말단의 제한효소를 다르게 2가지를 동정하였다. 먼저 기존에 HepG2 세포로부터 RT-PCR에 의하여 확보되어 있는 T-easy_endostain 플라스미드를 주형으로 사용하고, KpnI S primer(GGTACCCACAGCCACCGCGACTTCCA- GCCGGTGCTC)와 SalI AS primer(GTCGACCTACTT- GGAGGCAGTCATGAAGCTGTTCTC) primer 쌍을 이용하여 PCR을 실시하였다. 또한 KpnI와 XbaI 제한효소 site를 가지는 단편을 확보하기 위하여 KpnI S primer와 XbaI AS primer(TCTAGACTACTTGGAGGCAGTCATG- AAGCTGTTCTC) 쌍을 이용하여 PCR 증폭하였다.
- 06 kb의 5’ arm을 동정하기에 앞서 먼저 TALEN 결합 부위가 β-casein 유전자의 exon 7 위치에 존재하므로 아미노산 번역에는 변화가 없도록 TALEN 결합 부위에 변이를 도입하였다. 먼저 오른쪽 TALEN 결합 부위에 변이를 도입하기 위하여 아래와 같이 PCR point mutation을 실시하였다. 변이된 1,060bp의 5’ 단편을 확보하기 위하여 기존에 확보되어 있는 T-easy_β-casein exon 2-exon 8 플라스미드를 주형으로 이용하고, NotI 제한효소 site가 포함된 sense primer (GCGGCCGCGGCACTTAGGCCAAATTCTAAATC)와 AS1 primer(GACTGACAATGATAGGAAAGGGTC)을 이용하여 PCR 증폭하였다.
- 먼저 전체 염기서열을 확인한 pGEM T-easy_β-casein exon 2-exon 7 5’ arm 플라스미드로부터 NotI과 SalI으로 절단하여 삽입체를 제작하고, pBSK(-)/NotI- SalI 벡터에 클로닝하였다.
- 변이된 1,030 bp의 5’ 단편을 확보하기 위하여 앞에서 확보한 오른쪽 TALEN 결합 부위에 변이가 도입된 pGEM T-easy_β-casein R2-RR 플라스미드를 주형으로 사용하고, NotI 제한효소 site가 포함된 sense(GCGGCCGCGGCACTTAGGCCAAATTCTA- AATC)와 AS1 primer(GACTGACAATGATAGGAAAG- GGTC)를 이용하여 PCR을 수행하였다.
- 변이된 1,060bp의 5’ 단편을 확보하기 위하여 기존에 확보되어 있는 T-easy_β-casein exon 2-exon 8 플라스미드를 주형으로 이용하고, NotI 제한효소 site가 포함된 sense primer (GCGGCCGCGGCACTTAGGCCAAATTCTAAATC)와 AS1 primer(GACTGACAATGATAGGAAAGGGTC)을 이용하여 PCR 증폭하였다.
- 변이된 1.3 kb의 5’ arm을 확보하기 위하여 위에서 확보한 1,060 bp의 단편 238 bp의 단편을 1:1로 혼합한 후 이 혼합된 DNA 용액을 주형으로 이용하여 아래와 같이 PCR을 수행하였다.
- 변이된 238 bp의 3’ 단편을 확보하기 위해서는 S1(GACCCTTTCCTATCATTGTCAGTC)와AS2(TCAGAATCTCCACGGGTAAGCCTA) primer 쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다.
- 본 연구에서 구축된 knock-in 벡터는 β-casein exon 7의 3’ 말단에 exon 8의 한 개 코돈이 연결되도록 하였으며, 단백질 합성 시 β-casein과 endostatin이 분리될 수 있도록 F2A 염기서열을 그 뒤에 삽입하였다.
- 5 μg을100 μL Ham’s F-10(Gibco) 배지에 융해한 후 세포 현탁액 400 μL(5×106 세포)와 혼합한 다음 4 mm gap 큐벳에세포 및 벡터 혼합액을 넣었다. 상기 큐벳을 BTX Electrocell manipulator(BTX, Holliston, USA)에 장착한 다음 450 V, 4 pulses, 1 ms 조건에서 전기충격을 실시하였다. 전기충격 후 큐벳을 얼음 위에 10분 간 방치한 후 배양액으로 현탁하고 24 well 플레이트의 각 well당 약 4,000 세포가 들어가도록 분주하여 배양하였다.
- PCR은 NotI 제한효소 site가 포함된 sense(GCGGCCGCGGCAC- TTAGGCCAAATTCTAAATC)와 AS2 primer(TCAGAAT- CTCCACGGGTAAGCCTA)을 사용하여 실시하였다. 왼쪽 TALEN 결합 부위의 point mutation을 도입하기 위하여다음과 같이 PCR을 수행하였다. 변이된 1,030 bp의 5’ 단편을 확보하기 위하여 앞에서 확보한 오른쪽 TALEN 결합 부위에 변이가 도입된 pGEM T-easy_β-casein R2-RR 플라스미드를 주형으로 사용하고, NotI 제한효소 site가 포함된 sense(GCGGCCGCGGCACTTAGGCCAAATTCTA- AATC)와 AS1 primer(GACTGACAATGATAGGAAAG- GGTC)를 이용하여 PCR을 수행하였다.
- 이렇게 처리된 DNA에 T7 endonuclease I(NEB, Ipswich, USA) 1μL(2 또는 4 unit)을 넣고 37℃에서 15분 처리한 후 2% 아가로스 젤에서 전기영동하여 절단된 단편을 확인하였다.
- 젖소 β-casein 유전자 exon 7위치를 절단할 수 있는 TALEN은 툴젠으로부터 합성하였으며, TALEN은 left bin- ding site가 TGTACCAGGAGCCTGTACTC이며, right binding site는 TACAATAATAGGGAAGGGTC을 인식할 수 있도록 합성하였다.
- PCR은 Solg™ Pfu DNA polymerase(Solgent, Daejun, Korea)을 이용하여 94℃ 30초, 62℃ 40초, 72℃ 1분의 33cycle의 조건에서 실시하였다. 증폭된 product는 pGEM T-easy 벡터(Promega Co., Wisconsin,USA)에 클로닝하여 염기서열을 결정하여 TALEN 절단 부위의 insertion과 deletion(indels) 현상을 확인하였다. T7 endonuclease I에 의한 활성 측정은 먼저 PCR prod- uct를 QIAgen quick Gel extract Kit(QIAgen, Venlo, Ne- derland)로 처리한 후 450ng의 DNA을 이용하여 실시하였다.
- Knock-in 세포의 PCR 동정을 위한 세포 추출물과 ge- nome DNA 준비는 이전에 보고된 방법에 따라 실시하였다(Jeong 등, 2015). 체세포의 넉-인 여부 확인은 세포 추출물을 이용한 1차 PCR과 genome DNA을 이용한 2차 PCR을 실시하여 수행하였다. 2차 PCR에서는 3’ arm PCR, 5’ arm PCR과 targeted와 non-targeted PCR을 실시하여 knock-in 여부를 확인하였다.
- 또한 273 bp의 3’단편을 확보하기 위하여 앞에서 확보한 오른쪽 TALEN 결합 부위에 변이가 도입된 pGEM T-easy_β casein R2-RR 플라스미드를 주형으로 사용하고, S2(CCTAGTAC- AGGCTCTTGGTAGAGC)와 AS2 primer (TCAGAATCT- CCACGGGTAAGCCTA)을 이용하여 PCR을 수행하였다. 최종적으로 왼쪽 TALEN 결합 부위에 point mutation이 도입된 단편을 확보하기 위하여 위에서 확보한 약 1,030 bp의 단편과 273 bp의 단편을 1:1로 혼합하고, 이것을 주형으로 이용하여 다음과 같이 PCR을 실시하였다. PCR은 NotI 제한효소 site가 포함된 sense(GCGGCCGCGGCAC- TTAGGCCAAATTCTAAATC)와 AS2 primer(TCAGAAT- CTCCACGGGTAAGCCTA)을 사용하여 실시하였다.
대상 데이터
- Endostatin은 F2A 염기서열 뒤에 연결하였으며, BGH poly A signal에 의하여 발현될 수 있도록 구축되었다. 또한 positive 선별 마커로는 PGK-neo를 이용하였고, negative 선별마커로는diphteria toxin A(DT-A) 유전자를 이용하였다. 이와 같은 knock-in 벡터가 β-casein 위치에 상동 재조합되면 외래유전자인 endostatin 유전자는 β-casein 유전자의 gene regulatory DNA sequence에 의하여 β-casein과 연결된 mRNA로 발현하게 된다.
- 벡터를 세포에 도입한 다음 48시간 후 500 µg/mL의 G418(Gibco-BRL)로 10～12일간 선별하였다.
이론/모형
- Knock-in 세포의 PCR 동정을 위한 세포 추출물과 ge- nome DNA 준비는 이전에 보고된 방법에 따라 실시하였다(Jeong 등, 2015). 체세포의 넉-인 여부 확인은 세포 추출물을 이용한 1차 PCR과 genome DNA을 이용한 2차 PCR을 실시하여 수행하였다.
성능/효과
- 1차 PCR 수행 후 확인된 colony의 genome DNA을 이용하여 2차 PCR을 수행하였을 때 Fig. 4에 제시한 바와 같이 3’ arm PCR을 수행한 결과, 47, 24, 26, 33 colony에서는 2.2 kb의 밴드가 확인되었다.
- DT-A_cEndo Knock-in 벡터를 transfection 하였을 경우 G418 내성 colony는 127개가 선별되었으며, 이들 중 65개의 colony을 1차 PCR에 의하여 분석한 결과, 6개가 positive로 확인되었다. 이들 colony로부터 genome DNA을 회수하여 3’ arm, 5’ arm과 targeted and non-targeted PCR을 수행한 결과, 최종적으로 3개의 positive colony가 검출되어 효율은 4.
- DT-A_tEndo Knock-in 벡터 I을 체세포에 도입하였을 경우에는 Table 1에서 제시한 바와 같이 2.2%의 상동유전자 재조합 효율을 나타내고 있으며, DT-A_tEndo Kno- ck-in 벡터 II을 도입한 처리군에서는 4.8%의 효율로 DTA_tEndo Knock-in 벡터 I보다 좋은 효율을 나타내었다. DT-A_tEndo Knock-in 벡터 I이 도입된 knock-in 체세포의 PCR 분석 결과는 Fig.
- DT-A_tEndo Knock-in 벡터 I이 도입된 knock-in 체세포의 PCR 분석 결과는 Fig. 4에 제시한 바와 같이 3’ arm 1.5 kb 또는 0.9 kb, 5’ arm 2.4 kb 또는 2.2 kb가 검출되었으며, targeted와 non-targeted allele을 증폭하기 위하여 long PCR을 실시한 결과, 4.4 kb의 targeted band와 2.2 kb의 non-targeted band가 검출되었다.
- DT-A_tEndoKnock-in 벡터 II가 도입된 체세포의 PCR 분석 결과는 Fig. 4에 제시한 바와 같이 3’ arm 2.2 kb, 5’ arm 2.2 kb가 검출되었으며, targeted와 non-targeted allele을 증폭하기 위하여 long PCR을 실시한 결과, 4.4 kb의 targeted band와 2.2 kb의 non-targeted band가 검출되었다.
- Endostatin 아미노산은 β-casein exon 7의 아미노산과 F2A peptide와 in-frame으로 연결되어 있음을 확인하였다.
- TALEN의 활성을 검증하기 위하여 MAC-T 세포에 TALEN을 도입하고, 절단 부위를 포함하는 부분을 PCR 증폭하여 T7 endonuclease I assay를 실시하였다. Fig. 3B에 제시한 바와 같이 TALEN을 도입하고 T7 endonuclease Iassay를 실시한 결과, indel에 의하여 313 bp와 135 bp의 절단된 단편을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는, 세포에서 본 실험에서 사용한 TALEN이 내인성 target을 절단하는 좋은 활성을 나타내고 있음을 제시한 것이다.
- PCR 조건은 95℃ 10초, 58℃ 5초, 72℃ 5분 30초에서 33 cycle을 수행하였다. PCR 산물의 확인은 0.8% 아가로스 젤에서 전기영동하여 약 4.4 kb의 targeted allele과 2.2 kb의 non-tar- geted allele을 확인하였다.
- PCR 조건은 95℃ 10초, 58℃ 5초, 72℃ 5분 30초에서 33 cycle을 수행하였다. PCR 산물의 확인은 0.8% 아가로스 젤에서 전기영동하여 약 4.4 kb의 targeted allele과 2.2 kb의 non-tar- geted allele을 확인하였다.
- 그 결과, 5’ arm 4.9 kb와 3’ arm 1.8 kb를 가지고 있는 knock-in 벡터를 TALEN과 함께 체세포에 도입하였을 때 4.6%의 상동재조합 효율을 얻을 수 있었다.
- 그리고 1.06 kb의 5’ arm과 0.64 kb 또는 1.8 kb의 3’ arm을 사용하였을 때 3’ arm이 1.8 kb인 경우 4.8%로 0.64 kb의 3’ arm을 사용할 때의 2.2% 효율 보다 높은 것으로 확인되었다.
- 2 kb의 밴드가 확인되었다. 따라서 3개의 colony는 모두 한쪽 allele에서 상동유전자 재조합이 일어난 heterozygous로 확인되었다.
- 또한 5’ arm PCR에서는 24, 26, 33 colony에서만 5.9 kb의 밴드가 확인되었으며, 상동유전자 재조합이 일어난 allele와 그렇지 않은 allele을 확인하기 위하여 targeted와 non-targeted PCR을 수행한 결과, 24, 26, 33 colony에서 상동유전자 재조합이 일어난 4.4 kb와 상동유전자 재조합이 일어나지 않은 2.2 kb의 밴드가 확인되었다.
- Endostatin 아미노산은 β-casein exon 7의 아미노산과 F2A peptide와 in-frame으로 연결되어 있음을 확인하였다. 또한 Mac-T 세포에 넉-인 벡터를 도입한 후 endostatin 유전자의 mRNA 발현을 RT-PCR로 확인되었다(결과 제시 안함). 이러한 결과는 본 연구에서 개발한 knock-in 벡터가 상동유전자 재조합에 의하여 β-casein 위치에 삽입되면 정상적으로 endostatin 유전자가 발현될 수 있음을 나타낸다.
- 6%로 낮은 결과를 보이고 있지만 유전자 가위인 TALEN을 이용하여 β-casein 위치에 knock-in 벡터를 상동재조합에 의하여 도입할 수 있음을 나타내고 있다. 또한 본 연구에서도 TALEN을 이용하지 않았을 경우에는 knock-in 효율이 0%(결과제시 안함)로써 Liu 등(2014)의 결과와 일치하는 결과를 보였다. 그렇지만 3’ arm이 짧은(0.
- 이들 colony로부터 genome DNA을 회수하여 3’ arm, 5’ arm과 targeted and non-targeted PCR을 수행한 결과, 최종적으로 3개의 positive colony가 검출되어 효율은 4.6%로 확인되었다.
- 이러한 결과는 고전적인 knock-in 벡터인 DT-A_cEndoKnock-in 벡터를 이용하거나, 5‘ arm이 약 1 kb로 짧은 벡터를 이용하더라도 knock-in이 가능하다는 것을 나타내고 있으며, 3’ arm이 짧은 경우는 다소 효율이 낮다는 것을 나타내고 있다.
- 또한 Jeong등(2015)은 사람 FGF2 유전자를 소 β-casein 엑손 3위치에 F2A와 융합시켜 소 β-casein 유전자 위치에 knock-in 된 체세포를 확보하고 수정란을 생산하였다고 보고하고 있다. 이러한 결과는 본 연구에서 개발된 knock-in 벡터에 의하여 형질전환 가축이 생산되면 유즙으로부터 endo- statin이 분비될 수 있음을 나타낸다.
- 이러한 결과는 본 연구에서 개발한 knock-in 벡터가 상동유전자 재조합에 의하여 β-casein 위치에 삽입되면 정상적으로 endostatin 유전자가 발현될 수 있음을 나타낸다.
- 6%인 것으로 보고하였다(Cui 등, 2015). 이러한 결과는 본 연구에서 얻은 적중 효율이 2.2～4.6%로 낮은 결과를 보이고 있지만 유전자 가위인 TALEN을 이용하여 β-casein 위치에 knock-in 벡터를 상동재조합에 의하여 도입할 수 있음을 나타내고 있다. 또한 본 연구에서도 TALEN을 이용하지 않았을 경우에는 knock-in 효율이 0%(결과제시 안함)로써 Liu 등(2014)의 결과와 일치하는 결과를 보였다.
- 이러한 결과는 본 연구에서 활성을 나타내는 TALEN을 이용하여 소 β-casein 엑손 7위치 knock-in 벡터를 knock-in 시킬 수 있음을 나타낸다.
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