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문제 정의
- 항비만 및 당대사 조절작용과 관련하여 부자는 골격근 세포 배양모델에서 당대사를 증가시키고6), 에너지 조절 및 미토콘드리아 생합성에 관여하는 PGC-1α 및 adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK)를 활성화시켰으며11), 2형 당뇨병 동물모델에서 공복혈당 감소 효능을 나타냈다12). 그러나 비만형 동물모델에서 부자의 항비만 및 당대사 조절 효능과 관련한 연구가 이뤄지지 않았기 때문에, 본 연구에서 고지방식이로 유발된 비만형 동물 모델에 부자를 투여하여 부자의 항비만 및 당대사 조절 효능을 평가하였다.
제안 방법
- 각 조직 슬라이드를 H&E로 염색하였으며, 광학현미경(Leica DM 500; Leica, Wetzlar, Germany)을 통해 조직학적 변화를 관찰하였다.
- 부자의 항비만 효능을 보다 구체적으로 평가하기 위하여 부자 추출물 투여 후 백색지방조직 중 내장지방의 무게 변화를 측정하였다. 내장지방은 부고환지방, 신장주위지방 및 장간막지방으로 이루어져 있으므로19), 이들을 각각 적출한 후, 무게를 비교하였다. 세 가지 종류의 지방 무게를 각각 비교했을 때, 고지방식이 대조군과 부자 투여군 간의 유의한 차이가 없었으며, 내장지방의 총량 역시 두 군 간의 유의한 차이가 없었다(Table 2).
- 혈당은 매주 1회 12시간 이상 절식시킨 후 모든 동물의 꼬리정맥으로부터 혈액을 수집하여 혈당측정기(Accu-Check; Ro Che Diagnostics, Basel, Switzerland)를 이용하여 측정하였다. 또한 기초체온은 매주 1회 오후 3시에 직장 체온을 thermo Couple probe (Physitemp, Clifton, NJ, USA)를 이용하여 측정하였다.
- 또한 비만으로 인한 간 손상 및 약물의 간 기능 보호효과를 평가하기 위해서 가장 일반적인 간 기능 평가 항목인 AST, ALT의 혈청 농도를 측정하였다. 정상식이군에 비해서 고지방식이군에서 두 항목의 농도가 각각 상승하였으며, 고지방식이군과 비교 시 부자 투여군에서 개선 작용이 관찰되지 않았다.
- 모든 실험동물을 희생시키고 심장으로부터 생리식염수를 관류하여 혈액을 제거한 후 백색지방(내장지방: 부고환 지방, 신장주위지방, 장간막지방), 간, 췌장 및 비복근을 적출한 후, 생리식염수로 세척한 다음 여과지로 수분을 제거한 후 무게를 측정하였다.
- Louis, MO, USA)로 여과한 후 잔류물에 동량의 물을 첨가하여 동일방법으로 2차 추출하였다. 모든 추출액을 합하여 회전식 감압농축기(Buchi Rotavapor R-114 system)로 감압 농축한 후 동결건조(Freeze Dryer FD5508A; Ilsin Lab., Dongducheon, Korea)하여 물추출물 건조분말을 제조하였다. 수득률은 22.
- 부자의 항비만 효능을 보다 구체적으로 평가하기 위하여 부자 추출물 투여 후 백색지방조직 중 내장지방의 무게 변화를 측정하였다. 내장지방은 부고환지방, 신장주위지방 및 장간막지방으로 이루어져 있으므로19), 이들을 각각 적출한 후, 무게를 비교하였다.
- . 비만형 동물 모델에서 부자의 당 대사 관련 효과를 평가하기 위하여 공복 혈당 및 내당능을 평가하였다. 공복혈당은 정상식이군이 101.
- 약물투여 종료 후 최소 12시간 이상 절식시킨 후 모든 동물을 희생시키고 복대정맥으로부터 혈액을 수집하였다. 수집된 혈액은 6, 000 rpm에 15분간 원심 분리함으로써 혈청을 분리하였으며, 자동혈액분석기(FDC7000i; Fujifilm Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 혈청 내 aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), 총콜레스테롤(total cholesterol, TC), high-density lipoproteincholesterol (HDL-C) 및 중성지방(triglyceride, TG)의 농도를 측정하였다.
- 시료의 조제는 약재 200 g에 증류수 2 L를 가하여 2시간 동안 100°C에서 환류 추출하고, 전액을 여과지(Whatman No. 2; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로 여과한 후 잔류물에 동량의 물을 첨가하여 동일방법으로 2차 추출하였다.
- 약물투여 종료 후 최소 12시간 이상 절식시킨 후 모든 동물을 희생시키고 복대정맥으로부터 혈액을 수집하였다. 수집된 혈액은 6, 000 rpm에 15분간 원심 분리함으로써 혈청을 분리하였으며, 자동혈액분석기(FDC7000i; Fujifilm Co.
- 정상식이군을 제외한 나머지 세 개의 군들은 고지방식이를 약물 투여 없이 1주간 섭취시켰다. 이를 통해 정상식이군에 비해 10% 이상의 체중 증가가 유도된 것을 확인한 후, 고지방식이를 지속하면서 고지방식이군에는 생리식염수, 부자 투여군에는 농도를 달리한 부자를 각 16주간 경구 투여하였다. 정상식이 사료는 엔비고사(Envigo, Alconbury Huntingdon, UK)의 2018S 사료를 사용하였고, 고지방식이 사료는 60 kcal%의 지방을 함유하는 Research diets사(New Brunswick, NJ, USA)의 D12492를 사용하였다.
- 부자는 골격근내 열 발생에 관여하는 UCP 3의 발현량을 증가시키는 효능을 나타내었으며10), 갑상선 기능 저하증 동물모델에서 체온 저하를 개선시켰고, 체온 조절과 관련한 척수후신경절과 뇌의 체온조절단백질의 발현을 조절하였다20). 이에 열 발생 촉진을 통한 에너지 대사율 조절의 간접적인 평가를 위하여 고지방식이 기간별로 기초체온을 측정, 비교하였다. 그 결과 부자 추출물은 고지방식이 대조군에 비하여 체온을 상승시키는 경향을 나타냈으나, 통계적인 유의성은 없었다(Fig.
- 적출한 간을 4%의 paraformaldehyde에 24시간 담가 고정하고, 파라핀 포매 과정을 거친 후 조직 절편기(microtome)를 이용하여 3 µm 두께로 박절하여 조직 슬라이드를 제작하였다.
- 구입 후 1주 동안 적응기간을 주었으며 일반적인 행동 이상 여부를 관찰하여 이상이 관찰되는 동물은 실험에 사용하지 않았다. 정상식이군(normal diet group), 고지방식이군(high fat diet group), 고지방식이와 부자 100 mg/kg/day 투여군(ACD 100) 및 고지방식이와 부자 300 mg/kg/day 투여군(ACD 300)의네 개의 군에 실험동물을 각 세 마리씩 무작위 배정하였다. 정상식이군을 제외한 나머지 세 개의 군들은 고지방식이를 약물 투여 없이 1주간 섭취시켰다.
- 체중은 실험기간 동안 매주 1회 측정하였고, 또한 실험기간 동안 3일 간격으로 음수량과 섭식량을 측정하였다. 혈당은 매주 1회 12시간 이상 절식시킨 후 모든 동물의 꼬리정맥으로부터 혈액을 수집하여 혈당측정기(Accu-Check; Ro Che Diagnostics, Basel, Switzerland)를 이용하여 측정하였다.
- 경구내당능 검사(oral glucose tolerance test)는 약물투여 마지막 날 12시간 이상 모든 동물을 금식시키고 실시하였다. 포도당 용액을 체중(kg)당 2 g씩 경구 투여한 다음 0, 30, 60, 90, 120분에 각각 실험동물의 꼬리정맥으로부터 혈액을 수집하고 혈당측정기(Accu-Check)를 이용하여 혈당 변화를 측정하였다.
- 체중은 실험기간 동안 매주 1회 측정하였고, 또한 실험기간 동안 3일 간격으로 음수량과 섭식량을 측정하였다. 혈당은 매주 1회 12시간 이상 절식시킨 후 모든 동물의 꼬리정맥으로부터 혈액을 수집하여 혈당측정기(Accu-Check; Ro Che Diagnostics, Basel, Switzerland)를 이용하여 측정하였다. 또한 기초체온은 매주 1회 오후 3시에 직장 체온을 thermo Couple probe (Physitemp, Clifton, NJ, USA)를 이용하여 측정하였다.
- 혈청 지질 개선과 관련하여 TC, TG 및 HDL-C의 수치를 측정하였다. 정상식이군과 고지방식이군을 비교 시 TG는 두 군 간 유의한 차이가 없었으며, HDL-C는 고지방식이군에서 오히려 높게 측정되었는데, 이전 동일 동물 모델을 사용한 이전 연구에서도 동일한 결과를 확인할 수 있었다14, 15, 21, 22).
대상 데이터
- 부자는 수치를 한 포부자를 (주)광명당제약(Ulsan, Korea)으로부터 구입하였다. 시료의 조제는 약재 200 g에 증류수 2 L를 가하여 2시간 동안 100°C에서 환류 추출하고, 전액을 여과지(Whatman No.
- 실험동물은 5주령 C57BL/6 수컷 마우스를 (주)샘타코바이오코리아(Samtako Bio Korea, Osan, Korea)로부터 구입하였다. 모든 실험동물은 동물보호법 13조 규정에 따라 관리하였으며, 실험기간 동안 항온, 항습이 가능한 사육장에서 실내온도 22°C±2°C, 습도 55%±5%, 명암 12시간(day light 06:00∼18:00)을 주기로 실험종료 시까지 일정한 사육조건 환경을 유지하였다.
데이터처리
- 각 실험 모든 측정값은 평균±표준오차(means±standard errors of the mean)로 표시하였고 통계적 분석은 GraphPad Prism program ver. 5.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)으로 one-way ANOVA (Tukey’s post hoc test)를 사용하여 각 군 간의 차이를 분석하였으며, P값이 0.05 미만인 경우 통계적으로 유의한 것으로 판정하였다.
이론/모형
- 간 조직의 지질 축적 상태를 H&E 염색법을 통해 평가하였다.
- 이를 통해 정상식이군에 비해 10% 이상의 체중 증가가 유도된 것을 확인한 후, 고지방식이를 지속하면서 고지방식이군에는 생리식염수, 부자 투여군에는 농도를 달리한 부자를 각 16주간 경구 투여하였다. 정상식이 사료는 엔비고사(Envigo, Alconbury Huntingdon, UK)의 2018S 사료를 사용하였고, 고지방식이 사료는 60 kcal%의 지방을 함유하는 Research diets사(New Brunswick, NJ, USA)의 D12492를 사용하였다.
성능/효과
- 하퇴비복근으로 측정된 골격근량의 비율은 고지방식이군이 정상식이군에 비해서 유의하게 감소하여16-18) 이전 연구와 동일하게 비만할수록 근육 비율이 감소하는 결과를 보였으며 고지방식이 대조군과 부자 투여군 간의 유의한 차이는 없었다(Table 1).
- 16주간의 고지방식이 및 약물 투여 후, 고지방식이군의 체중이 45.0±1.0 g, 정상식이군의 체중이 30.0±2.6 g으로 고지방식이군의 체중이 유의하게 증가하였다.
- 고지방식이로 유도된 C57BL/6 마우스 비만형 동물모델에 부자 물추출물(100, 300 mg/kg)을 16주간 투여한 결과, 체중, 지방조직 무게, 간 조직 내 지질침착 및 혈청 지질 수치에서 유의한 항비만 효능을 확인할 수 없었다. 그러나 부자 물추출물은 비만으로 인한 공복혈당 및 당내성에는 농도 의존적으로 유의한 개선 효능을 나타냈다.
- 공복혈당은 정상식이군이 101.3±5.9 mg/dl, 고지방식이군이 148.3±6.5mg/dl로 고지방식이군에서 유의하게 상승하였다.
- 1A), 통계적인 유의성은 없었지만, ACD 100에 비해서 ACD 300에서 체중이 증가하는 경향을 나타내었다. 군별로 섭취한 열량을 비교했을 때, 고지방식이군과 2종의 부자투여군 간의 유의한 차이가 없었으므로(Fig. 1B), 부자 투여가 식이 섭취량에는 영향을 주지 않는 것으로 나타났다.
- 이에 열 발생 촉진을 통한 에너지 대사율 조절의 간접적인 평가를 위하여 고지방식이 기간별로 기초체온을 측정, 비교하였다. 그 결과 부자 추출물은 고지방식이 대조군에 비하여 체온을 상승시키는 경향을 나타냈으나, 통계적인 유의성은 없었다(Fig. 4).
- 3A). 또한 경구당부하검사를 통해 내당능장애를 측정하였는데, 고지방식이군은 포도당 투여 직후부터 120분까지 정상 식이군에 비해서 지속적인 내당능장애를 나타내었으며, 부자 투여 시 시간 경과에 따라 혈당이 보다 효과적으로 감소하는 분포를 나타내었다(Fig. 3B). 이를 곡선하면적(area under the curve)으로 분석한 결과, 부자 투여군이 고지방식이군에 비해서 농도 의존적으로 유의하게 감소하였다(Fig.
- 모든 실험동물은 동물보호법 13조 규정에 따라 관리하였으며, 실험기간 동안 항온, 항습이 가능한 사육장에서 실내온도 22°C±2°C, 습도 55%±5%, 명암 12시간(day light 06:00∼18:00)을 주기로 실험종료 시까지 일정한 사육조건 환경을 유지하였다.
- 정상식이군에 비해서 고지방식이군에서 두 항목의 농도가 각각 상승하였으며, 고지방식이군과 비교 시 부자 투여군에서 개선 작용이 관찰되지 않았다. 부자 투여군에서 각 농도별 한 개체씩 AST 및 ALT의 혈청 농도가 두드러지게 상승한 것으로 나타났는데, AST의 경우 부자 100 mg/kg 투여군에서 369 UI/L, ALT의 경우 부자 300 mg/kg 투여군에서 422 UI/L까지 상승한 개체가 각각 있었다. 본 연구와 동일한 포부자 물추출물을300 mg/kg의 동일 농도로 갑상선기능저하증 흰쥐모델에 4주간 투여한 연구에서 AST 및 ALT 혈청 농도가 각각 60∼80 UI/L 및 40∼60 UI/L로 나타난 바 있다20).
- 부자 투여군은 100 mg/kg 농도에서 127.5±8.7 mg/dl 및 300mg/kg 농도에서 116.0±7.8 mg/dl로 고지방식이군에 비해 농도 의존적으로 유의하게 감소하는 것으로 나타났다(Fig. 3A).
- 부자 투여군은 ACD 100이 42.0±2.7 g, ACD 300이 44.6±4.9 g으로 고지방식이 대조군에 비해서 유의한 체중변화가 없었으며(Fig. 1A), 통계적인 유의성은 없었지만, ACD 100에 비해서 ACD 300에서 체중이 증가하는 경향을 나타내었다.
- 내장지방은 부고환지방, 신장주위지방 및 장간막지방으로 이루어져 있으므로19), 이들을 각각 적출한 후, 무게를 비교하였다. 세 가지 종류의 지방 무게를 각각 비교했을 때, 고지방식이 대조군과 부자 투여군 간의 유의한 차이가 없었으며, 내장지방의 총량 역시 두 군 간의 유의한 차이가 없었다(Table 2).
- 앞서 설명한 결과에서 부자 추출물의 항비만 작용은 거의 나타나지 않은 것에 반해 공복혈당 및 내당능장애 개선효능을 확인할 수 있었다. 부자의 당 대사 조절 효능과 관련한 기존 연구에서 2형 당뇨병 동물모델에서 부자 추출액 경구 투여 시 혈당이 유의하게 감소한 것으로 보고된 바 있으며12), 또한 골격근 세포 배양 모델에서 부자 추출액이 세포 내로의 glucose uptake를 증가시켰고6), 당 대사와 관련 있는 AMPK 및 PGC1a의 발현량을 증가시킨 것으로 보고된바 있다11).
- 3B). 이를 곡선하면적(area under the curve)으로 분석한 결과, 부자 투여군이 고지방식이군에 비해서 농도 의존적으로 유의하게 감소하였다(Fig. 3C).
- 간 조직의 지질 축적 상태를 H&E 염색법을 통해 평가하였다. 정상식이군에 비해 고지방식이군에서 지방구의 크기 및 개수가 현저하게 증가하여 비만으로 인한 지방간의 형태가 나타났다. 부자 투여군과 고지방식이군과 비교 시 간 조직 내 지질 축적 정도의 뚜렷한 개선 효과는 나타나지 않았다(Fig.
후속연구
- 부자의 당 대사 조절 효능과 관련한 기존 연구에서 2형 당뇨병 동물모델에서 부자 추출액 경구 투여 시 혈당이 유의하게 감소한 것으로 보고된 바 있으며12), 또한 골격근 세포 배양 모델에서 부자 추출액이 세포 내로의 glucose uptake를 증가시켰고6), 당 대사와 관련 있는 AMPK 및 PGC1a의 발현량을 증가시킨 것으로 보고된바 있다11). 따라서 부자의 당대사 조절, 항당뇨 작용에 대해서는 추후 연구를 통해 효능 및 작용 기전을 보다 구체적으로 확인할 필요가 있다.
- 본 연구와 동일한 포부자 물추출물을300 mg/kg의 동일 농도로 갑상선기능저하증 흰쥐모델에 4주간 투여한 연구에서 AST 및 ALT 혈청 농도가 각각 60∼80 UI/L 및 40∼60 UI/L로 나타난 바 있다20). 본 연구에서 일부 개체의 간 기능 저하가 비만으로 인한 간 내 지질축적에 따른 간 손상의 결과인지 혹은 비교적 장기간의 약물 투여(16주)로 인한 약물 독성에 간 손상의 결과인지에 대해서는 추후 연구를 통해서 보다 엄격히 평가해야 하겠다.
- 그러나 부자 물추출물은 비만으로 인한 공복혈당 및 당내성에는 농도 의존적으로 유의한 개선 효능을 나타냈다. 부자 추출물의 비만으로 유발된 당내성에서 조절 효능 및 작용 기전에 대해서 추후 연구가 필요하겠다.
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