[논문]유통식육에서의 톡소포자충 검출을 위한 유전자검사법 개발

윤한성; 서수환; 곽효선; 주인선

doi:10.13103/jfhs.2017.32.3.199

유통식육에서의 톡소포자충 검출을 위한 유전자검사법 개발
Real-time PCR assay for the Detection of Toxoplasma gondii in Retail Meats: Proof-of-concept Study 원문보기

한국식품위생안전성학회지 = Journal of food hygiene and safety, v.32 no.3, 2017년, pp.199 - 205

윤한성 (식품의약품안전처 미생물과) , 서수환 (식품의약품안전처 미생물과) , 곽효선 (식품의약품안전처 미생물과) , 주인선 (식품의약품안전처 미생물과)

초록
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인수공통 감염증의 하나인 톡소포자충의 검출을 위해서는 대부분은 ELISA 법이 사용 되고 있으나, 충체가 사멸된 후에도 양성반응이 나타나는 등 사용에 제한이 있다. 반면 유전자 검출법은 현재 감염상태를 확인 할 수 있기 때문에 식중독 원인조사 등에 적합하다고 판단되어 이를 활용하여 본 연구를 진행하였다. 톡소포자충의 유전정보를 통해 529 repeat region의 염기서열을 얻고, 프라이머 및 TaqMan 프로브를 설계하여 real-time PCR을 이용한 검출법을 개발하였다. 검출한계(lower limit of detection) 및 적정곡선을 확인한 결과 10 genomic DNA copy가 검출한계로 확인되었고, 정량을 위한 곡선은 $10^1{\sim}10^6$ DNA copies까지 0.999의 $R^2$ 값을 나타내었다. 개발된 검출법의 증폭효율을 비교하기 위해 B1 gene 타겟 프라이머 세트와 타입별 검출한계를 비교한 결과, type 1, 2, 3 톡소포자충에서 같거나 더 나은 검출한계를 보였다. 또한 식품에서 주로 분리되는 식중독 세균 14종 및 원충 3종에 대해 특이도를 비교한 결과, 모두 음성으로 나타났다. 개발된 검출법을 식육검체에 적용하였을 때 type 1, 2, 3에서 모두 원활한 검출결과를 보여 증폭방해물질이 존재하지 않은 것으로 확인되었다. 본 연구를 통해 개발된 유전자검출법은 국내 유통 중인 식육에서 인수 공통감염 원충의 하나인 톡소포자충의 감염 여부를 확인하는 사전적 모니터링의 방법으로 활용될 예정이다.

Abstract ▼ AI-Helper

Although many PCR-based assays have been developed, the majority of rapid detection of Toxoplasma gondii in animal and their meat product has been dependent on immunogenic assays. Thus, there is still a need for more reliable PCR based detection method for T. gondii in retail meats. Recently, a 529-bp repeat element that exists in 200-300 copies per genome of T. gondii genome had been spotlighted for its usefulness as potential detection targers. In this study, the 529-bp repeat element was selected for real-time PCR to detect three types of T. gondii (type I, II and III). A primer pair targeting 82-bp of the 529-bp element detected all three types of T. gondii and showed high level of specificity against 14 different food-borne pathogens as well as 3 protozoan parasites such as Giardia lamblia, Cryptosporidium parvum and Entamoeba histolytica. Application of the new real-time PCR assay in meat samples showed improved detection sensitivity compared to the B1-gene targeted method suggesting potential new target for Toxoplasma gondii screening in retail meats.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 비교적 새로운 유전자인 529-bp repeat region을 이용하여 식육 내 원충 감염을 확인할 수 있는 실시간 유전자 검출법을 개발하여 식품에 적용할 수 있는 방법을 개발하여 국내 유통 중인 식육에서 인수공통감염원충의 하나인 톡소포자충의 감염 여부를 확인하고자 한다.

제안 방법

본 연구에서는 이 유전자를 활용하여 검출민감도를 최대한으로 높였고, 또한 200~300 bp의 유전자가 각기 다른 부위에 포함되어 있어 프라이머와 프로브를 잘못 디자인하면 특이도에 영향을 받을 수 있기 때문에 NCBI로부터 얻은 유전정보를 alignment하여 최소한의 mismatch를 가지는 부위를 골라냈으며, TaqMan probe는 Tm (Meltingtem perature) 값을 프라이머 보다 8~10°C 높게 설정하여 사용하였다. 비특이적 반응에 의한 위양성을 최소화할 수 있게 프라이머 및 프루브를 수동으로 제작하여 실시간유전자 증폭법에 적용하였다.

대상 데이터

본연구에 사용된 톡소포자충은 Type 1 strain인 RH (ATCC 50147)과 KI-1 (Korean isolate, KCDC), Type 2인 ME49 (ATCC 50611)과 PTG (ATCC 50941), Type 3인 STRL (ATCC 50955) 총 5종이 사용 되었고, 특이도 확인시험에 사용한 균주는 식품에서 주로 분리되는 식중독 세균 14종 및 원충 3종이 사용 되었다(Table 1).

성능/효과

본 연구에서는 529 repeat region 부위에 프라이머 및 프로브를 설계하였으며, 실험한 결과 검출 한계는 10 copies까지 모두(3/3) 검출되었고, 85 bp에서 뚜렷한 band가 생성되어 유전자 증폭이 잘 이루어 졌다. 그리고 B1 gene과 비교 하였을 때 민감도가 더 좋은 것으로 나타났으며, 특이도 확인 시험에서는 T. gondii의 DNA에서만 증폭곡선이 확인되었다. 식육검체에 적용하였을 때 증폭방해물질(inhibitor)이 존재하지 않는다는 것도 확인 하였다.
본 연구에서는 529 repeat region 부위에 프라이머 및 프로브를 설계하였으며, 실험한 결과 검출 한계는 10 copies까지 모두(3/3) 검출되었고, 85 bp에서 뚜렷한 band가 생성되어 유전자 증폭이 잘 이루어 졌다. 그리고 B1 gene과 비교 하였을 때 민감도가 더 좋은 것으로 나타났으며, 특이도 확인 시험에서는 T.
gondii의 DNA에서만 증폭곡선이 확인되었다. 식육검체에 적용하였을 때 증폭방해물질(inhibitor)이 존재하지 않는다는 것도 확인 하였다. 본 연구에서 개발된 유전자 검출법은 국내 유통 중인 식육에서 톡소포자충 감염여부를 확인하는 모니터링에 활용될 예정이다.

후속연구

식육검체에 적용하였을 때 증폭방해물질(inhibitor)이 존재하지 않는다는 것도 확인 하였다. 본 연구에서 개발된 유전자 검출법은 국내 유통 중인 식육에서 톡소포자충 감염여부를 확인하는 모니터링에 활용될 예정이다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	톡소포자 충의 3가지 감염단계는?	사람에게 감염되었을 때는 유산까지 일으키고 때로는 중추신경계까지 영향을 줄 수 있다21,28,32). 톡소포자충은 형태학적으로 다른 3가지 감염단계(infection stag)를 가지게 되는데, 감염 급성기에 빠르게 분열하는 단계인 tachyzoite, 만성감염 시 동물 조직에서 cyst를 형성하고 휴면기(dormant) 상태인 bradyzoite, 그리고 oocysts로서 고양이 배설물에서 발견되는 sporozoites 형태로 생활사를 이룬다3).
	톡소포자충의 인체감염의 경로는?	인체감염의 경로는 Toxoplasma cycsts를 포함하는 가축의 근육이 제대로 조리되지 않은 채 섭취되는 경우8), 배설물에 오염된 손으로 요리한 음식재료에서의 oocyst 섭취7,23,34) 장기이식 및 수혈, 임산부에 의한 태아전파(transplacental transmission) 및 tachyzoites의 감염 등이 있다7,10). 톡소포자충은 숙주 내에 감염 후 숙주의 면역반응을 회피하고자 근육이나 뇌에 침입해서 tissue cyst를 형성하여 장기간 숙주 내에 기생한다.
	톡소포자충을 단백질에 따라 3가지 형태로 분류하면?	톡소포자충은 tachyzoite 표면 단백질에 따라 3가지 형태로 분류할 수 있다. 국내에서 가장 많이 보고된 RH strain과 한국에서 처음 보고된 KI-1 strain이 포함된 제 1형은 독력(virulence)이 가장 높으며, 제 2형에는 ME49, PTG, Beverly strain 등이, 제 3형에는 VEG와 CTG strain 등이 포함되며 이 두 가지 형태는 독력이 약하거나 없다고 알려져 있다9,12).

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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