선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 그러나 아직까지 정제봉독은 식품의약품안전처의 식품원료로서 등재되지 않아 식용은 물론 정제봉독을 함유한 첨가제, 가축 사료 등으로 개발하는데 제약을 받고 있는 실정이다. 따라서 본 연구는 민간에서 복용하고 있으며 선진국에서도 식용으로 허락된 정제봉독을 식품원료로서 등록하기 위하여 필요한 안전성 시험을 수행하고자 하였다.
- 그러나 국내에서는 봉독이 식품 원료로서 등록되어 있지 않아 식품 또는 식품첨가물로 개발되지 못하고 있는 실정이다. 따라서 본 연구에서는 봉독 채집 장치를 사용하여 채집된 봉독을 정제한 정제봉독의 식용을 위하여 식품의약품안전처의 새로운 식품원료의 안전성 평가 가이드라인13,14)에 따라 유전독성평가의 하나인 복귀돌연변이시험을 수행함으로써 정제봉독의 식품원료로서의 안전성 여부를 평가하고자 하였다.
제안 방법
- 구입한 정제봉독의 성분 확인을 위하여 4 mg/mL의 농도로 3차 증류수에 녹여 PTFE 0.2 µm 필터(Sigma-Aldrich, MO, USA)로 여과하여 Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC)를 사용하여 분석하였다.
- 예비시험에서는 5~5000 µg/plate의 8 단계 농도를 처리하였으며, 시험물질 처리 시 top agar와 혼합할 때 및 집락 계수 시 평판에 침전 생성 여부를 관찰하였다. 따라서, 본 연구에서는 Table 3과 같이 시험 군을 구성하고, 음성 및 양성대조군을 포함하며, 농도 군 당 3 개의 평판을 사용하여 시험하였다.
- 본 연구에서는 유전독성 시험 중의 하나인 세균을 이용한 복귀돌연변이 시험을 수행하였다. 시험에 사용한 정제봉독은 부형제로 사용한 멸균생리식염수에 용해되었으며 모든 농도 군의 조제 물에서 침전은 관찰되지 않았으며, 정제봉독 조제 물을 top agar와 혼합할 때 모든 농도 군에서 혼탁이나 침전이 관찰되지 않았다.
- 양성판정 기준을 만족하지 못할 경우 음성으로 판정하였으며, 시험물질은 본 시험에 사용한 균주에 복귀돌연변이를 유발하지 않는 것으로 판단하였다. 생물학적 연관성 또한 판정에 참고하였다.
- 1 mL을, 양성대조군은 양성대조물질 용액을 동일한 방법으로 가하여 실시하였다. 시험물질 및 S9 mixture의 무균성 확인을 위해 봉독 시험물질 최고 농도액 0.1 mL 및 S9 mixture 0.5 mL을 각각 2 mL의 top agar에 혼합하여 평판을 제작하였다. 처리가 끝난 후 top agar가 굳으면 평판을 뒤집어 37 ± 2oC에서 50 ± 2 시간 배양한 후 복귀돌연변이 집락을 육안으로 계수하였다.
- 시험물질인 정제봉독 처리 시 정제봉독은 top agar에 혼합할 때 침전 생성 여부를 관찰하였다. 육안으로 확인 가능한 입자가 관찰되면 침전으로 판단하였다.
- 예비시험에서는 5~5000 µg/plate의 8 단계 농도를 처리하였으며, 시험물질 처리 시 top agar와 혼합할 때 및 집락 계수 시 평판에 침전 생성 여부를 관찰하였다.
- 1 mL을 혼합하고 즉시 vortex mixer로 2-3초간 진탕하여 minimal glucose agar plate에 부어 여러 방향으로 기울여 고루 퍼뜨려 굳게 하였다. 음성대조군은 시험물질 용액 대신 부형제 0.1 mL을, 양성대조군은 양성대조물질 용액을 동일한 방법으로 가하여 실시하였다. 시험물질 및 S9 mixture의 무균성 확인을 위해 봉독 시험물질 최고 농도액 0.
- 정제봉독의 처리 농도는 예비시험에서 본 시험과 같은 방법으로 5 종의 균주에 대하여 농도 군 당 1 개의 평판을 사용하여 대사활성계 적용 및 비적용 하에 시험물질을 처리하여 얻은 결과를 근거로 결정하였다(Data not shown). 예비시험에서는 5~5000 µg/plate의 8 단계 농도를 처리하였으며, 시험물질 처리 시 top agar와 혼합할 때 및 집락 계수 시 평판에 침전 생성 여부를 관찰하였다.
- 복귀돌연변이집락은 육안으로 계수하였다. 집락 계수 시 각 평판의 기본 성장균층의 형성 여부를 음성대조군과 비교하여 검사하였으며, 오염 혹은 기타 이상의 발생여부를 점검하였다. 기본 성장균층이 엷어지거나 없어지면서 집락수의 감소가 나타날 때 또는 미세집락(microcolony)이 나타난 경우를 세포독성이 있는 것으로 판단하였다.
- 집락수의 ‘감소’에 대해서는 공통된 기준이 없으므로, 본 시험에서는 편의상 집락수가 음성대조군에서 나타난 집락 수 평균치의 50% 미만으로 감소한 경우 혹은 증가 경향이 역전되는 경우를 세포독성으로 판단하였다.
대상 데이터
- Cofactor는 Wako Pure Chem (Wako Pure Chemical Industries Ltd., Osaka, Japan)을 사용하였고, 냉장보관(−1~10oC)하였다.
- 배양한 균 배양액 1 mL 당 dimethyl sulfoxide 90 µL를 가하여 냉동 보관용 바이알에 채워 액체질소에 보관하였으며, 형질이 확인 된 균주의 마스터 플레이트를 제작, 시험에 사용하였다.
- 표준품인 멜리틴, 아파아민(apamin) 그리고 포스포리파아제 A2 (phospholipase A2)는 시그마(Sigma-Aldrich, St, Louis, MO, USA)로 부터 구입하여 2 mg/mL로 만들어 시험 봉독과 동일한 필터를 사용하여 여과하였다. 분석 기기는 PDA (photo diode array, Waters, MA, USA) 검출기가 장착된 Acquity UPLC I-Class (Waters, Milford, MA, USA)를 사용하여, Table 1과 같은 컬럼 및 분석 조건으로 260 nm의 검출파장에서 분석하였다. 정제봉독 내의 멜리틴, 아파아민 그리고 포스포리파아제 A2의 함량은 각각의 표준품 수용액 시료에 나타나는 피크와 비교하여 63.
- 시험물질인 정제봉독은 봉독 채집 장치를 사용하여 서양종 꿀벌로부터 채취한 봉독을 ‘봉독의 간이 정제방법’8)으로 정제한 정제봉독을 구입하여 사용하였다(Chung Jin Biotech Co., Ansan, Korea).
- 2 (Thermo Fisher Scientic, Waltham, MA, USA)를 사용하였다. 최소배지는 1.5% Bacto agar (BD, Franklin Lakes, NJ, USA)와 Vogal-Bonner medium E (Institute for Systems Biology, Seattle, WA, USA) 및 2% glucose (Sigma-Aldrich, St, Louis, MO, USA)를 함유한 것을 페트리디쉬에 25 mL씩 분주한 것을 사용하였고, E. coli는 0.1% L-trytophan 액(Sigma-Aldrich, St, Louis, MO, USA)을 0.25 mL/L로 첨가한 배지를 사용하였다. Top agar는 0.
- 2 µm 필터(Sigma-Aldrich, MO, USA)로 여과하여 Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC)를 사용하여 분석하였다. 표준품인 멜리틴, 아파아민(apamin) 그리고 포스포리파아제 A2 (phospholipase A2)는 시그마(Sigma-Aldrich, St, Louis, MO, USA)로 부터 구입하여 2 mg/mL로 만들어 시험 봉독과 동일한 필터를 사용하여 여과하였다. 분석 기기는 PDA (photo diode array, Waters, MA, USA) 검출기가 장착된 Acquity UPLC I-Class (Waters, Milford, MA, USA)를 사용하여, Table 1과 같은 컬럼 및 분석 조건으로 260 nm의 검출파장에서 분석하였다.
- 히스티딘 요구성 균주인 Salmonella typhimurium TA100, TA1535, TA98 및 TA1537 16) 및 트립토판 요구성 균주인 Escherichia coli WP2 uvrA 17)를 Molecular toxicology사 (Boone, NC, USA) 로부터 구입 후 (주)켐온 비 임상 연구소(Yongin, Korea)에서 형질전환 후 계대 배양한 것을 시험에 사용하였다. 시험에 사용한 균주의 유전적 특징과 검출 가능한 돌연변이 유형은 Table 2와 같다.
데이터처리
- 통계분석은 실시하지 않았으며, 대사활성계 적용 여부에 상관없이 최소 1 개 균주에서 시험물질 처리군의 평균 집락 수가 농도 의존적으로 증가하거나 1 개 이상의 농도에서 재현성 있는 증가를 나타낼 때 양성으로 판정하였다. 양성판정 기준을 만족하지 못할 경우 음성으로 판정하였으며, 시험물질은 본 시험에 사용한 균주에 복귀돌연변이를 유발하지 않는 것으로 판단하였다.
이론/모형
- 배양한 균 배양액 1 mL 당 dimethyl sulfoxide 90 µL를 가하여 냉동 보관용 바이알에 채워 액체질소에 보관하였으며, 형질이 확인 된 균주의 마스터 플레이트를 제작, 시험에 사용하였다. 각 균주 대하여 Maron and Ames의16)방법에 준하여 시험하였다.
- 시험물질의 처리는 direct plate incorporation 방법으로 실시하였다. 시험균주는 master plate로부터 20 mL의 액체배지(2.
성능/효과
- S. typhimurium의 히스티딘 요구성 균주 TA100, TA1535 및 TA98 의 대사활 성계 적용 시 500 µ g/plate에서, 비적용에서는 50 µ g/plate에서 세포독성이 관찰되었으며 TA1537에서는 대사활성계 적용 시 1,500 µg/plate에서, 비적용에서는 500 µg/plate 에서 세포독성이 관찰되었다(Table 4).
- 집락 계수 시 각 평판의 기본 성장균층의 형성 여부를 음성대조군과 비교하여 검사하였으며, 오염 혹은 기타 이상의 발생여부를 점검하였다. 기본 성장균층이 엷어지거나 없어지면서 집락수의 감소가 나타날 때 또는 미세집락(microcolony)이 나타난 경우를 세포독성이 있는 것으로 판단하였다. 집락수의 ‘감소’에 대해서는 공통된 기준이 없으므로, 본 시험에서는 편의상 집락수가 음성대조군에서 나타난 집락 수 평균치의 50% 미만으로 감소한 경우 혹은 증가 경향이 역전되는 경우를 세포독성으로 판단하였다.
- 시험에 사용한 5 개 균주는 파장 600 nm에서의 흡광도 기준으로 생균수 측정 결과 0.53~3.51 × 109(TA균주) 및 1.18 × 109(E. coli) CFU/mL 이었으며, 모든 플레이트 당 처리된 생균수는 0.5 × 108CFU 이상이었다.
- 본 연구에서는 유전독성 시험 중의 하나인 세균을 이용한 복귀돌연변이 시험을 수행하였다. 시험에 사용한 정제봉독은 부형제로 사용한 멸균생리식염수에 용해되었으며 모든 농도 군의 조제 물에서 침전은 관찰되지 않았으며, 정제봉독 조제 물을 top agar와 혼합할 때 모든 농도 군에서 혼탁이나 침전이 관찰되지 않았다. 집락계수 시에도 모든 플레이트에서 침전이나 기타 이상은 관찰되지 않았으며, 정제봉독은 최고 농도 및 S9 mixture의 무균성을 확인하기 위한 플레이트에서 미생물 오염으로 인한 집락은 나타나지 않았다.
- 5 × 108CFU 이상이었다. 시험타당성 기준은 모두 만족하였으며, 모든 시험균주에서 대사활성계 적용 여부에 상관없이 시험물질 처리군의 평균 집락 수는 증가를 나타내지 않았으며, 이 결과는 양성판정 기준을 만족시키지 못하였다. 따라서, 시험물질인 정제봉독은 본 시험조건 하에 사용한 시험 균주에 복귀돌연변이를 유발하지 않는 것으로 사료되어 향후 염색체돌연변이, 소핵시험 등 안전성 시험을 추가 한다면, 식품 소재로 활용이 가능할 것으로 기대된다.
- 분석 기기는 PDA (photo diode array, Waters, MA, USA) 검출기가 장착된 Acquity UPLC I-Class (Waters, Milford, MA, USA)를 사용하여, Table 1과 같은 컬럼 및 분석 조건으로 260 nm의 검출파장에서 분석하였다. 정제봉독 내의 멜리틴, 아파아민 그리고 포스포리파아제 A2의 함량은 각각의 표준품 수용액 시료에 나타나는 피크와 비교하여 63.9%, 2.3% 그리고 10.9%로 확인되었다(Fig. 1).
- 시험에 사용한 정제봉독은 부형제로 사용한 멸균생리식염수에 용해되었으며 모든 농도 군의 조제 물에서 침전은 관찰되지 않았으며, 정제봉독 조제 물을 top agar와 혼합할 때 모든 농도 군에서 혼탁이나 침전이 관찰되지 않았다. 집락계수 시에도 모든 플레이트에서 침전이나 기타 이상은 관찰되지 않았으며, 정제봉독은 최고 농도 및 S9 mixture의 무균성을 확인하기 위한 플레이트에서 미생물 오염으로 인한 집락은 나타나지 않았다. S.
후속연구
- 시험타당성 기준은 모두 만족하였으며, 모든 시험균주에서 대사활성계 적용 여부에 상관없이 시험물질 처리군의 평균 집락 수는 증가를 나타내지 않았으며, 이 결과는 양성판정 기준을 만족시키지 못하였다. 따라서, 시험물질인 정제봉독은 본 시험조건 하에 사용한 시험 균주에 복귀돌연변이를 유발하지 않는 것으로 사료되어 향후 염색체돌연변이, 소핵시험 등 안전성 시험을 추가 한다면, 식품 소재로 활용이 가능할 것으로 기대된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.