[논문]여정실의 항산화 활성

서영완; 김호준

doi:10.4217/opr.2017.39.2.115

여정실의 항산화 활성
Antioxidant Activity of Fruits of Ligustrum japonicum 원문보기

Ocean and polar research, v.39 no.2, 2017년, pp.115 - 124

서영완 (한국해양대학교 해양생명과학부) , 김호준 (한국해양대학교 해양생명과학부)

Abstract ▼ AI-Helper

The objective of this study is to evaluate the antioxidant activity of the fruits of Ligustrum japonicum. The crude extract was successively fractionated into n-hexane, 85% aqueous methanol (85% aq.MeOH), n-butanol (n-BuOH), and water fractions by means of solvent polarity. The crude extract and its solvent fractions were evaluated for their antioxidant effect by four different assay systems: scavenging power on peroxynitrite and intralcellular ROS produced in HT-1080 cells; DNA oxidation inhibition; ferric reducing antioxidant power (FRAP). The n-BuOH fraction exhibiting potent antioxidant activity was further purified by C18 silica gel column chromatography and RP-HPLC to give tyrosol (1) and salidroside (2). The structure of isolated compounds was determined by extensive 2 D NMR experiments such as $^1H$ COSY, NOESY, HSQC and HMBC as well as by comparison with the published spectral data.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구팀에서는 염생식물 자원이 항산화제의 원천으로서의 가능성을 탐색하기 위하여 염생식물 추출물들에 대한 항산화 활성을 스크리닝하는 과정속에 광나무의 열매인 여정실 추출물이 유의적인 항산화 활성을 나타내었다. 따라서 본 연구에서는 여정실 추출물과 유기용매 분획을 제조하고 이들에 대한 peroxynitrite 소거능, 세포내 ROS의 소거효과, DNA 산화 억제 등 항산화 활성을 검색하고 항산화 활성이 우수한 n-BuOH 분획으로부터 항산화 활성성분을 분리하고자 하였다.
본 연구팀에서는 염생식물 자원이 항산화제의 원천으로서의 가능성을 탐색하기 위하여 염생식물 추출물들에 대한 항산화 활성을 스크리닝하는 과정속에 광나무의 열매인 여정실 추출물이 유의적인 항산화 활성을 나타내었다. 따라서 본 연구에서는 여정실 추출물과 유기용매 분획을 제조하고 이들에 대한 peroxynitrite 소거능, 세포내 ROS의 소거효과, DNA 산화 억제 등 항산화 활성을 검색하고 항산화 활성이 우수한 n-BuOH 분획으로부터 항산화 활성성분을 분리하고자 하였다.

제안 방법

이 항산화 활성 측정법은 비극성분자인 DCFH-DA가 세포내로 용이하게 들어 간 후에 세포내 esterase 효소에 의해 acetate기가 떨어져 나가고 비형광성 물질인 DCFH로 되고 이 물질이 활성산소에 의해 산화되어 형광물질인DCF로 바뀌는 원리를 이용하여 세포내에 존재하는 활성산소종을 측정하는 것이다. 대조군으로는 시료를 제외하고 500 μM H₂O₂만 처리한 control과 시료와 H₂O₂ 둘다 처리하지 않은 blank를 사용하여 비교하였으며 0, 30, 60,90, 120분 간격으로 DCF fluorescence 값을 측정하였다.
모든 용매분획의 항산화 활성결과를 고려할 때 n-BuOH 분획층이 가장 좋은 항산화 활성을 나타내었기 때문에 n-BuOH 분획층으로부터 항산화 성분 분리를 시도하여 n-BuOH 분획층으로부터 알려진 폴리페놀 성분인 tyrosol(1)과 salidroside(2)를 분리하였다(Fig. 7).
섬유육종세포인 HT-1080 세포로부터 genomic DNA를 추출하여 시료로 처리한 후, 0.1 mM H₂O₂와 0.1 M FeSO₄로 산화시켜, DNA의 산화정도를 측정하였다. 대조군으로는 시료를 처리하지 않고 H₂O₂와 FeSO₄로 산화시킨 control과, 시료를 처리하지 않고 산화도 시키지 않은 blank를 사용하여 비교하였다.
세포내 활성산소종 소거효과는 섬유육종 세포인 HT-1080을 사용하였으며, 형광물질인 DCF-DA가 세포내 생성된 자유 라디칼과 반응하여 형광물질인 DCF로 산화되는 원리를 이용하여 측정하였다(Okimoto et al. 2000).
또한 Fe³⁺ 이온에 대해서도 우수한 환원력을 나타내었으며 DNA 산화에 대해서도 유의적인 억제효과를 나타내었다. 유기 추출물의 활성 성분을 추적하기 위하여 추출물을 용매극성에 따라 n-hexane, 85% aq.MeOH, n-BuOH, water 용매층으로 분획하였고 각각의 분획층에 대해서도 항산화 활성을 검색하였다. 이미 결과부분에서 언급된 것처럼 n-hexane 분획층을 제외하고는 모든 용매분획층이 모든 항산화 활성검색에서 좋은 효과를 나타내었으며 n-hexane 분획층도 nitric oxide 및 peroxynitrite 억제효과와 환원력 측정에 있어서는 다른 용매분획층들 보다는 못해도 비교적 좋은 활성을 보였다.

대상 데이터

광나무의 열매인 여정실을 dichloromathane(CH₂Cl₂) 용매에 24시간 동안 침지 후 여과하여 dichloromathane 추출물을 얻었으며, 이 과정을 2회 실시하였다. 남은 잔사에동량의 methanol(MeOH) 용매를 침지 후 여과하는 방식을 사용하였으며, 이 과정을 2회 반복하였다.
인간섬유육종 세포주인 HT-1080 세포는 한국세포주 은행(KCLB, Korean cell line Bank)에서 분양받아 실험에 사용하였다. 100 unit/mL의 penicillin-streptomycin과 10%FBS(fetal bovine serum)가 함유된 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle medium)을 사용하여 37℃, 5% CO₂ 배양기(Forma scientific, Japan)에서 배양하였다.

데이터처리

이는 SIN-1이 NO•와 O₂•⁻를 동시에 발생시켜 ONOO⁻를 생성시키는 화합물이기 때문에, DHR 123를 급속하게 산화시키는 authentic peroxynitrite와 다르게 DHR 123를점진적으로 산화시키기 때문이다. Blank는 0.3 N NaOH를 사용하였고, 실험은 3회 반복하여 실시하였으며, 결과는 blank를 차감한 값을 평균하여 대조군에 대한 백분율로 계산하였다.
대조군과 각 시료로부터 얻은 실험 결과들의 유의성을 검정하기 위하여 분산분석(ANOVA)을 행한 후 P < 0.05수준에서 Duncan’s multiple range test를 실시하였으며,그 결과는 평균(mean) ± 표준오차(standard error of mean,SEM)로 표시하였다. 모든 통계 분석은 statistic analysis system v9.
05수준에서 Duncan’s multiple range test를 실시하였으며,그 결과는 평균(mean) ± 표준오차(standard error of mean,SEM)로 표시하였다. 모든 통계 분석은 statistic analysis system v9.1(SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) 통계프로그램을 이용하여 처리하였다.

이론/모형

HT-1080 세포를 MTT-assay를 이용하여 생존율을 측정하였다. 배양된 세포가 well 당 1 × 10⁷ cells/mL가 되도록 96-well plate에 분주하여 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24시간 동안 배양한 후, 실험에 사용하였다.
세포 내 자유라디칼 생성 정도는 DCF-DA assay로 측정하였다. 섬유 육종 세포 HT 1080은 96 well plate에 5 × 10³ cells/well로 분주하여 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양한 후, Hank’s balanced salt solution(HBSS)으로 희석한 20 μM의 2’,7’-dichlorodihydro fluorescein diacetate(DCF-DA, fluorescence probe)를 첨가하여 20분간 배양하였다.
여정실의 추출물과 추출물의 유기용매 분획층(n-hexane, 85% aq.MeOH, n-BuOH, water)의 항산화 활성을 측정하기 위해 섬유육종 세포인 HT-1080 세포의 생존율에 미치는 시료의 영향을 확인하기 위해 MTT assay를 이용하여 세포생존율을 측정하였다. 이때 시료는 200, 100, 50, 10,1 μg/mL의 농도로 희석하여 사용하였다.

성능/효과

본 연구에서 사용된 여정실의 유기용매 추출물은 HT-1080 세포내에서 발생된 ROS에 대해서 좋은 소거활성을 나타내었을 뿐만 아니라 nitric oxide와 그리고 authentic peroxynitrite 및 SIN-1에서 유도된 peroxynitrite에 대해서도 우수한 억제효과를 나타내었다. 또한 Fe³⁺ 이온에 대해서도 우수한 환원력을 나타내었으며 DNA 산화에 대해서도 유의적인 억제효과를 나타내었다.
위의 실험 결과, n-hexane 분획층을 제외한 모든 시료들이 200 μg/mL 농도에서 authentic peroxynitrite에 대해서 80% 이상의 소거율을 나타내었고 n-hexane 분획층도 76.7%의 소거율을 나타내었다. 또 n-BuOH과 water 분획 층은 10 μg/mL 농도에서도 각각 58.
이상의 결과들로부터 여정실 유기용매 추출물과 극성에 따른 유기용매 분획물은 산화스트레스로 인해 생성되는 산소 및 질소활성종에 의한 산화적 손상을 억제하는 효과가 있는 것으로 확인되었다. 특히 분리된 2개의 폴리페놀 계열의 화합물들은 활성산소종과 활성질소종에 대해 유의적인 소거효과를 가지는 것으로 나타나 n-BuOH 분획층의 항산화활성에 부분적으로라도 기여한다는 사실이 확인되었으며, 추후 지속적인 연구를 통하여 이 분획층으로부터 유사한 계열의 화합물들을 추가로 분리할 수 있을 것으로 기대된다.

후속연구

이상의 결과들로부터 여정실 유기용매 추출물과 극성에 따른 유기용매 분획물은 산화스트레스로 인해 생성되는 산소 및 질소활성종에 의한 산화적 손상을 억제하는 효과가 있는 것으로 확인되었다. 특히 분리된 2개의 폴리페놀 계열의 화합물들은 활성산소종과 활성질소종에 대해 유의적인 소거효과를 가지는 것으로 나타나 n-BuOH 분획층의 항산화활성에 부분적으로라도 기여한다는 사실이 확인되었으며, 추후 지속적인 연구를 통하여 이 분획층으로부터 유사한 계열의 화합물들을 추가로 분리할 수 있을 것으로 기대된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	염생식물에 대한 일반적인 정의는 무엇인가?	염분이 있는 토양에서 자라는 식물을 염생식물이라고 부르는데 염생식물에 대한 정의는 연구자에 따라 다르지만 일반적으로 내염성이 있으며 염분을 배출하거나 축적하는 기작을 가지고 있는 식물이라고 할 수 있다(Kim 2006). 염생식물은 다른 육상식물들에 비하여 높은 염분함량을 가지는데 이와 같이 높은 고염 스트레스는 식물조직에 높은 산화스트레스를 유도한다.
	고염 스트레스는 어떠한 과정으로 산화스트레스를 유도하는가?	염생식물은 다른 육상식물들에 비하여 높은 염분함량을 가지는데 이와 같이 높은 고염 스트레스는 식물조직에 높은 산화스트레스를 유도한다. 문헌에 의하면 고염 스트레스는 기체 교환을 감소시켜 잎 조직에 이산화탄소 공급을 제한하고, 결국에는 광합성 전자 전달을 급감시키기 때문에 superoxide 음이온, 과산화수소 및 히드록실 라디칼(hydroxyl radical)과 같은 다앙한 활성산소종의 생성을 유도한다고 알려져 있다(Ozgur et al. 2013; Bose et al.
	염분 스트레스에 적응하기 위한 내염성 식물인 염생식물의 독특한 항산화 기작은 무엇인가?	이러한 염분 스트레스에 적응하기 위하여 내염성 식물인 염생식물은 독특한 항산화 기작을 발전시켜 왔다. 문헌에 의하면 내염성식물들이 중성식물에 비해서 비타민 E, 폴리페놀 등과 같은 항산화물질들을 더 높은 함량으로 보유하고 있음이 확인되었으며 실제로 염생식물의 항산화 능력이 증가하는 것은 식물조직내의 폴리페놀 축적과 밀접한 관련이 있다는 사실이 알려졌다. 지금까지 발표된 문헌에 의하면 염생식물의 전체 폴리페놀 함량이 중성식물(glycophyte)보다 2배 정도 높은 것으로 보고되었다(Ksouri et al. 2012a,b; Bose et al.

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용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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