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문제 정의
- MeOH 용매분획으로부터19 추가적으로 암세포 증식억제 성분을 분리하고자 하였다. 따라서 본 연구에서는 우리나라에 자생하는 순비기나무로부터 분리된 8 가지 화합물과 이들의 암세포 증식억제 효과에 대하여 보고하고자 한다.
제안 방법
- 이 과정을 2번 반복하였으며, 얻어진 추출액은 40℃ 수욕 상에서 진공 증발기로 농축하였다. Dichloromethane으로 추출하고 남은 잔사에 동량의 methanol (MeOH)을 부어 위와 동일한 과정을 반복하여 추출물을 얻었다. 두 용매로 추출한 양을 합하여 얻어진 추출물 145.
- 순비기나무 추출물의 용매분획층인 85% aq.MeOH 분획을 C18 flash chromatography와 reversed-phase HPLC를 차례로 수행하여 8개의 화합물을 분리하였다. 분리한 화합물은 2D-NMR 실험을 통하여 화학구조를 결정하였으며 이미 보고된 물질의 문헌치와 비교하여 구조를 최종 확인하였다(Fig.
- 순비기나무 추출물의 85% aq. MeOH 분획층 21.0 g을 MeOH과 물의 혼합용액(50, 60, 70, 80, 90% aq.MeOH and 100% MeOH)을 이용하여 C18역상 진공 크로마토그래피를 실시하였으며 6개의 크로마토그래피 분획(Rfc 1~6)을 얻었다. 그 중 70% aq.
- RI detector가 장착된 High Performance Liquid Chromatography (HPLC, Dionex P580) system을 이용하여 화합물을 분리 정제하였으며 HPLC column은 YMC pack ODS-A(250× 10 mm, S 5 μm, 12 mm)를 사용하였다.
- HT-1080과 MCF-7 암세포는 100 units/mL의 penicillin-streptomycin과 10%의 fetal bovine serum(FBS, Hyclone, Utah, USA)이 함유된 DMEM 배지(Hyclone, Utah, USA)를 사용하였으며, AGS와 HT-29 암세포의 경우, 100 units/mL의 penicillin streptomycin과 10%의 FBS가 함유된 RPMI 1640 배지 (Hyclone, Utah, USA)를 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator (Forma Scientific, Japan)에서 배양하였다. 배양된 각각의 암세포는 2~3일 간격으로 배지를 교환하고 6~7일 만에 PBS로 세척한 후 0.05% Trypsin -0.02% EDTA로 부착된 세포를 분리하여 원심분리한 후 집적된 암세포에 배지를 넣고 피펫으로 암세포가 골고루 분산되도록 잘 혼합하여 75 ml cell culture flask에 10 ml씩 일정 수 분할하여 주입한 후 다시 배양하였으며 계속해서 6~7일마다 계대 배양하면서 실험에 사용하였다.
- MeOH 분획을 C18 flash chromatography와 reversed-phase HPLC를 차례로 수행하여 8개의 화합물을 분리하였다. 분리한 화합물은 2D-NMR 실험을 통하여 화학구조를 결정하였으며 이미 보고된 물질의 문헌치와 비교하여 구조를 최종 확인하였다(Fig. 1). 화합물 1-3과 5-7은 본 연구그룹에서 이미 분리된 바 있으며 기존에 보고한 데이터와 비교하여 각각 artemetin(1), vitexcarpin(2), luteolin(3), xanthotoxin(4), vitetrifolin F(5), vitetrifolin E(6), vitetrifolin D(7)로 결정되었다.
- 생성된 formazan결정은 100 μL DMSO로 녹여 ELISA reader (Bio-Tek instruments, Winooski, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정 하여 암세포 증식 억제율(%)을 구하였다.
- 1). 화합물 1-3과 5-7은 본 연구그룹에서 이미 분리된 바 있으며 기존에 보고한 데이터와 비교하여 각각 artemetin(1), vitexcarpin(2), luteolin(3), xanthotoxin(4), vitetrifolin F(5), vitetrifolin E(6), vitetrifolin D(7)로 결정되었다.13-16
대상 데이터
- HT-1080 인체 섬유육종 암세포(HT-1080 human fibrosarcoma cell), AGS 인체 위암세포(AGS human gastric adenocarcinoma cell), HT-29 인체 결장암세포(HT-29 human colon cancer cell) 및 MCF-7 인체 유방암세포(MCF-7 human breast cancer cell)는 한국 세포주은행(Korean Cell Line Bank, KCLB)으로부터 분양 받아 배양하여 실험에 사용하였다. HT-1080과 MCF-7 암세포는 100 units/mL의 penicillin-streptomycin과 10%의 fetal bovine serum(FBS, Hyclone, Utah, USA)이 함유된 DMEM 배지(Hyclone, Utah, USA)를 사용하였으며, AGS와 HT-29 암세포의 경우, 100 units/mL의 penicillin streptomycin과 10%의 FBS가 함유된 RPMI 1640 배지 (Hyclone, Utah, USA)를 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator (Forma Scientific, Japan)에서 배양하였다.
- HT-1080 인체 섬유육종 암세포(HT-1080 human fibrosarcoma cell), AGS 인체 위암세포(AGS human gastric adenocarcinoma cell), HT-29 인체 결장암세포(HT-29 human colon cancer cell) 및 MCF-7 인체 유방암세포(MCF-7 human breast cancer cell)는 한국 세포주은행(Korean Cell Line Bank, KCLB)으로부터 분양 받아 배양하여 실험에 사용하였다. HT-1080과 MCF-7 암세포는 100 units/mL의 penicillin-streptomycin과 10%의 fetal bovine serum(FBS, Hyclone, Utah, USA)이 함유된 DMEM 배지(Hyclone, Utah, USA)를 사용하였으며, AGS와 HT-29 암세포의 경우, 100 units/mL의 penicillin streptomycin과 10%의 FBS가 함유된 RPMI 1640 배지 (Hyclone, Utah, USA)를 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator (Forma Scientific, Japan)에서 배양하였다. 배양된 각각의 암세포는 2~3일 간격으로 배지를 교환하고 6~7일 만에 PBS로 세척한 후 0.
- 대조 화합물로는 paclitaxel을 사용하였으며 이 화합물은 암세포 AGS, HT-29, HT-1080, MCF-7에 대해서 각각 7.1, 0.6, 30.7, 16.9 μM의 IC50값을 보여 주었다.
- 실험에 사용한 순비기나무(Vitex rotundifolia)는 2011년 7월 전라남도 무안군 해안에서 직접 채집하였으며 응달에서 건조 후 추출하기 전까지-25℃에서 냉동 보관하였다. 냉동보관된 순비기나무 시료(0.
- RI detector가 장착된 High Performance Liquid Chromatography (HPLC, Dionex P580) system을 이용하여 화합물을 분리 정제하였으며 HPLC column은 YMC pack ODS-A(250× 10 mm, S 5 μm, 12 mm)를 사용하였다. 화합물의 구조결정은 Varian NMR(300 MHz)과 Bruker NMR(900 MHz)을 사용하였으며 NMR 측정 용매는 CD3OD와 CDCl3(Cambridge Isotope Laboratories, Inc., USA)를 사용하였다.
- 화합물의 분리에 사용한 컬럼 충진제은 RP18(YMC-GELODS-A, 12 nm, S-75 μm)을 사용하였으며, TLC plate는 Silica F254s(Merck)를 사용하였다.
성능/효과
- 또한 특이하게 해양식물인 홍조류 Acantophora spicifera 에서도 발견된 바 있다.25 이 물질에 대한 생리활성 결과도 거의 보고되지 않았으며 여기에서 처음으로 인체암세포에 대한 증식억제 효과가 검색되었으며 4종류 인체암세포 모두에 유의적인 억제활성을 나타내었다. 특히 HT-1080과 AGS 세포에 더 좋은 억제활성을 나타내었다.
- 2개의 methyl기의 위치는 gHMBC 실험에서 δ 3.88과 δ 3.79의 methoxy기의 수소 신호는 각각 C-7(δ 167.1)과 C-3(δ 139.6)에 long-ranged correlation을 보여 주어 화합물 4의 화학구조는 quercetin-3,7-dimethyl ether로 확인되었다.
- HT-1080 섬유육종 세포와 AGS 위암세포의 경우에는 화합물 8이 가장 좋은 증식억제효과를 보여 100 μM의 농도에서 각각 55.5, 58.9%의 억제율을 보였으며 HT-29의 경우에는 10 μM의 농도에서도 32.2% 정도의 억제율을 보였다.
- HT-1080, AGS, HT-29, MCF-7 인체 암세포들에 대하여 화합물 4-8을 각각 100, 50, 10 μM의 농도로 처리한 결과 모든 화합물들이 농도의존적으로 인체암세포들의 증식을 억제하였다.
- 80% aq.MeOH 분획(Fr.4, 3.1 g)에 대해서도 역상 HPLC(ODS-A, 78% aq.MeOH)를 실시하였으며 그 결과 vitexcarpin(2, 71 mg)과 6개의 혼합물 분획들 (Mix.1~6)이 얻어 졌다. 혼합물 분획 1~3(Mix.
- 또한 13C NMR 스펙트럼과 DEPT 스펙트럼을 통하여 12개의 방향족 탄소 신호들외에 두 개의 carbonyls(δ 170.6과 167.0), 3개의 methylenes(δ 63.6, 38.8 and 36.9), 그리고 2개의 methines(δ 55.3 and 52.9) 신호들이 확인되었다.
- 이러한 NMR 스펙트럼 분석결과와 IR 스펙트럼 및 gDQCOSY 실험을 통하여 다음과 같은 부분구조들이 제안되었으며 이러한 부분구조들은 gHMBC 실험을 통하여 연결되어 화합물 8의 구조가 결정되었다. 문헌조사 결과 이 화합물은 이전에 보고되었던 aurantiamide로 확인되었으며 NMR 스펙트럼 데이터는 보고된 값과 잘 일치하였다.25-28
- 6)에 long-ranged correlation을 보여 주어 화합물 4의 화학구조는 quercetin-3,7-dimethyl ether로 확인되었다. 문헌조사 결과 이 화합물은 이전에 육상식물에서 분리되었으며 NMR 스펙트럼 데이터는 같은 용매에서 측정하였을 때 문헌에 보고된 값과 잘 일치되었다.21-24
- Quercetin dimethyl ether(4)의 생리 활성으로 혈관이완효과와23 항산화활성이29 알려져 있으나 다른 생리활성에 대해서는 거의 보고되지 않았다. 이물질의 4 종류의 인체암세포 증식억제활성을 측정한 결과 HT-1080과 AGS 세포에 대한 증식억제 활성이 비교적 좋았다. Aurantiamide(8)는 주로 acetate의 형태로 발견되었으며 amide 형태 자체로는 그렇게 많이 발견되지 않았다.
- 25 이 물질에 대한 생리활성 결과도 거의 보고되지 않았으며 여기에서 처음으로 인체암세포에 대한 증식억제 효과가 검색되었으며 4종류 인체암세포 모두에 유의적인 억제활성을 나타내었다. 특히 HT-1080과 AGS 세포에 더 좋은 억제활성을 나타내었다. 이 논문에서 처음으로 aurantiamide(8)의 모든 수소와 탄소에 대한 NMR 스펙트럼 데이터가 완전하게 지정(assigned)되었다.
- 화합물 4도 상대적으로 좋은 억제활성을 보여 HT-1080과 AGS 세포들에 대해서 100 μM의 농도에서 약 49.0, 46.8%의 억제율을 보였으며 10 μM의 농도에서도 약 35.7, 34.5%의 억제율을 보였다.
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