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문제 정의
- woosongensis는 xylan 분해균으로 분리되었으며[12], 이로부터 β-xylosidase/α-arabinofuranosidase [13]와 GH11 xylanase의 유전자와 효소 특성이 보고된 바 있다[8]. 본 연구에서는 P. woosongensis로부터 신규 GH11 xylanase 유전 자를 클로닝하고 효소 반응특성을 조사하였다.
제안 방법
- 1 server로부터 아미노 말단의 26개 잔기가 signal peptide로 예측되었다. DEAE-Sepharose와 Phenyl-Separose 컬럼 크 로마토그래피 과정을 통해 xyn11B 유전자를 함유한 재조합대장균의 균체 파쇄상등액으로부터 Xyn11B를 부분 정제하였다. 부분 정제된 Xyn11B의 반응특성을 조사한 결과 pH 6.
- Genome Sequencer FLX Titanium (Roche, Germany)으로 부분적으로 결정된 P. woosongensis의 유전체 염기서열로부터 xylanase 유전자로 유추되는 DNA 단편을 증폭하기 위한 primers YB45C70-57F (GCATCTGCAGATGAC GAGATGCAGTTTAAAC; 밑줄은 PstI 위치)와 YB45C70-57R (CTTCGAATTCTTAATTGATTTCCAAATAATCGAG; 밑줄은 EcoRI 위치)을 설계하였다. P.
- woosongensis의 유전체 염기서열로부터 xylanase 유전자로 유추되는 DNA 단편을 증폭하기 위한 primers YB45C70-57F (GCATCTGCAGATGAC GAGATGCAGTTTAAAC; 밑줄은 PstI 위치)와 YB45C70-57R (CTTCGAATTCTTAATTGATTTCCAAATAATCGAG; 밑줄은 EcoRI 위치)을 설계하였다. P. woosongensis KCTC 3953를 tryptic soy broth 배지에서 배양하여 얻은 균체로부터 분리한 유전체 DNA를 주형, YB45C70-57F와 YB45C70-57R을 primers로 하고 pfu-X DNA polymerase을 사용하여 xylanase 유전자를 증폭하였다. PCR은 95℃에서 3분간 처리 후 95℃ (25초), 56℃ (40초), 72℃ (1분)의 반응을 25회 반복하고 최종적으로 72℃에서 20분간 반응함으로써 수행하였다.
- woosongensis KCTC 3953를 tryptic soy broth 배지에서 배양하여 얻은 균체로부터 분리한 유전체 DNA를 주형, YB45C70-57F와 YB45C70-57R을 primers로 하고 pfu-X DNA polymerase을 사용하여 xylanase 유전자를 증폭하였다. PCR은 95℃에서 3분간 처리 후 95℃ (25초), 56℃ (40초), 72℃ (1분)의 반응을 25회 반복하고 최종적으로 72℃에서 20분간 반응함으로써 수행하였다. 증폭된 DNA 단편은 제한 효소로 절단하여 pUC19 에 도입하였다.
- 증폭된 유전자를 pUC19의 lac promoter와 일치되도록 삽입하기 위해 upper primer YB45C70-57F와 lower primer YB45C70-57R에 PstI과 EcoRI 절단서열을 각각 도입하였다. PCR을 수행한 결과 예상되는 크기의 1.1-kb DNA 단편이 증폭되었으며 이를 PstI과 EcoRI으로 절단하여 동일한 효소로 절단된 pUC19에 도입하여 재조합 플라스미드 pXY70를 제조하였다. 클로닝된 DNA 단편의 유전자 염기서열을 결정한 결과 유전체 분석에서 결정된 서열과 동일하였고 356 아미노산 잔기로 구성된 단백질을 코드하는 1,071 bp 크기의 xylanase 유전자가 확인되었으며 이를 xyn11B 유전자로 명명하였다.
- Paenibacillus woosongensis의 유전체 부분 염기서열로부터 유추된 xylanase 유전자를 PCR 증폭하여 클로닝하고 염기서열을 결정하였다. 클로닝된 xylanase 유전자는 xyn11B로 명명되었으며, 356 아미노산으로 구성된 단백질을 코드하는 1,071 뉴클레오티드로 이루어졌다.
- Phenyl-Sepharose 컬럼 크로마토그래피 과정을 통해 얻은 분획 중 효소활성이 높은 분획의 부분정제 효소액을 사용하여 PwXyn11B의 특성을 조사하였다. 반응온도와 pH가 xylanase 활성에 미치는 영향을 조사한 결과 Fig.
- PwXyn11B의 효소 특성을 조사하기 위해 재료 및 방법에 기술한 대로 pwxyn11B 유전자를 함유한 E. coli DH5α 배양 균체로부터 PwXyn11B를 부분 정제하였다.
- 동일한 완충용액으로 평형화한 DEAE-Sepharose column (Sigma-Aldrich, USA)에 단백질 용액을 주입하여 크로마토그래피를 진행하였다. Xylanase가 컬럼에 흡착되지 않고 용출되었으므로 용출된 효소 용액에 고농도의 ammonium sulfate 용액을 첨가하여 최종적으로 1 M ammonium sulfate와 20 mM Tris (pH 8.0)을 포함하는 용액이 되도록 하였다. 동일 용액으로 평형화 시킨 Phenyl-Sepharose 컬럼(Sigma-Aldrich, USA)에 효소 용액을 주입하여 흡착시키고 ammonium sulfate의 농도를 1 M에서 0 M까지 역으로 농도구배를 주어 흡착된 단백질을 분획하였다.
- 균체를 초음파 파쇄하고 원심분리한 후 균체 파쇄 상등액을 채취하여 ammonium sulfate (25−70%)로 침전하여 단백질을 분획하였다.
- curdlanolyticus B-6 [17]의 xylanases는 PwXyn11B보다 아미노 말단이 11개 잔기 또는 8개 잔기를 더 긴 것으로 보고되어 아미노 말단이 일치하지 않았다. 그러므로 pwxyn11B 유전자의 개시 코돈을 확인하기 위해 구조유전자의 상부 지역의 염기서열에서 리보좀 결합위치(RBS)에 해당하는 염기서열을 조사하였다. 그 결과 pwxyn11B 유전자의 개시 코돈 ATG로부터 7 nucleotides가 떨어져 있는 지역에는 RBS로 예측되는 염기서열(GGGAGG)이 존재하였으나, P.
- 열안정성은 20−60℃ 범위의 온도에서 xylanase 효소액을 1시간 동안 방치한 후 잔존활성을 측정하여 결정하였다. 금속이온과 화합물이 효소 활성에 미치는 영향을 조사하기 위해서는 최종 농도가 5 mM 이 되도록 반응액에 첨가하고 효소활성을 측정하였다.
- 금속이온을 비롯한 화합물이 PwXyn11B 활성에 미치는 영향을 분석하여 XynG1-1, XylX와 XynNF와 비교하였다(Table 2). PwXyn11B는 Ca2+과 Mg2+에 의해서는 활성이 약간 증가되었으며 K+과 Fe2+에 의해서는 거의 영향을 받지 않았다.
- 0)을 포함하는 용액이 되도록 하였다. 동일 용액으로 평형화 시킨 Phenyl-Sepharose 컬럼(Sigma-Aldrich, USA)에 효소 용액을 주입하여 흡착시키고 ammonium sulfate의 농도를 1 M에서 0 M까지 역으로 농도구배를 주어 흡착된 단백질을 분획하였다. 활성 분획을 모아 10 mM potassium phosphate 완충액(pH 6.
- 0)으로 현탁하고 동일 완충액으로 투석하였다. 동일한 완충용액으로 평형화한 DEAE-Sepharose column (Sigma-Aldrich, USA)에 단백질 용액을 주입하여 크로마토그래피를 진행하였다. Xylanase가 컬럼에 흡착되지 않고 용출되었으므로 용출된 효소 용액에 고농도의 ammonium sulfate 용액을 첨가하여 최종적으로 1 M ammonium sulfate와 20 mM Tris (pH 8.
- 열안정성은 20−60℃ 범위의 온도에서 xylanase 효소액을 1시간 동안 방치한 후 잔존활성을 측정하여 결정하였다.
- 이를 Escherichia coli DH5α에 형질전환하고 oat spelt xylan (0.5%)과 ampicillin이 첨가된 LB 배지에 도말한 후 형성된 콜로니 중 주변의 oat spelt xylan이 분해되어 투명환을 보이는 것을 xylanase를 생산하는 형질전환주로 선발하였다.
- woosongensis의 유전체 분석 결과 이미 보고된 GH11 xylanase [8]와는 다른 별개의 xylanase로 예상되는 유전자가 발견되었으며 이를 PCR 클로닝하기 위한 primers를 제조하였다. 증폭된 유전자를 pUC19의 lac promoter와 일치되도록 삽입하기 위해 upper primer YB45C70-57F와 lower primer YB45C70-57R에 PstI과 EcoRI 절단서열을 각각 도입하였다. PCR을 수행한 결과 예상되는 크기의 1.
- 효소 활성에 미치는 반응 온도의 영향을 조사하기 위하여 30−65℃와 pH 4.5−9.0의 범위에서 xylanase 활성을 각각 측정하였다.
대상 데이터
- Xyn11B의 아미노산 배열을 분석한 결과 glycosyl hydrolase family 11에 속하는 xylanase와 상동성이 높은 활성영역과 탄수화물 결합영역을 포함하고 있는 다영역 효소로 확인되었다. SignalP4.1 server로부터 아미노 말단의 26개 잔기가 signal peptide로 예측되었다. DEAE-Sepharose와 Phenyl-Separose 컬럼 크 로마토그래피 과정을 통해 xyn11B 유전자를 함유한 재조합대장균의 균체 파쇄상등액으로부터 Xyn11B를 부분 정제하였다.
성능/효과
- 41M-1 (BAA82316)의 xylanases와는 74−79% 상동성을 보여 PwXyn11B는 신규의 xylanase로 확인되었다(Fig. 1).
- P. campinasensis의 XylX [15]와 XynG1-1 [16]은 60℃와 pH 7.0에서 동일하게 최대 효소활성을 보이며, 열안정성도높아 XynG1-1은 70℃와 80℃에서 각각 1시간 방치한 후에도 77.1%과 50.2%의 잔존활성을 보였으며, XylX는 60℃에서 8시간 동안 방치하였을 때도 거의 실활되지 않았다. 분자량이 37 kDa인 Paenibacillus sp.
- campinasensis 균주 BL11과 G1-1의 xylanases (XylX와 XynG1-1)와 아미노 말단의 크기가 일치하도록 11개 아미노 말단 잔기 코돈을 추가적으로 포함한 지점의 ATG 코돈의 상부 지역에는 RBS 서열이 없었으므로 예측된 PwXyn11B의 개시 코돈은 맞는 것으로 판단되었다. P. curdlanolyticus B-6 xylanase (PcXyn11A)의 유전자와 그 주변의 염기서열 (FJ956758)을 분석한 결과 개시 코돈으로 보고된 ATG의 상부지역에는 RBS 서열이 없으며, 9번째 코돈인 ATG의 상부 지역으로 7 nucleotides가 떨어져서 RBS로 예측되는 서열(GGGAGG)이 존재하였다. XylX (DQ241676)와 XynG1-1 (JF830005)의 경우는 오직 구조 유전자의 염기서열만 보고되어 있으므로 개시 코돈의 상부 지역에서 RBS 서열의 존재 유무를 분석할 수 없었다.
- PePPER webserver (http:// pepper.molgenrug.nl.)를 이용하여 xyn11B 유전자의 상부지 역을 분석한 결과 ATG 개시 코돈의 상부 167−196번째 염기서열(TTGACGATAGAA GCTTTATTTTATTACAAG)이 promoter에 해당하는 것으로 예측되었다(GenBank accession no. KY964450).
- 1에 보인 바와 같이 다른 xylanase와 차이가 있었다. PwXyn11B의 아미노산 배열을 미국의 NCBI database에 등록된 다른 효소 비교한 결과 P. ihumii의 유전체 염기서열에서 예측된 xylanase (WP_055108594)와 상동성이 93%로 가장 높았다. 이외에 P.
- 2). Xylanase 활성을 갖는 분획에서 pwxyn11B 유전자로부터 예측되는 mature protein (35.8 kDa)의 크기보다 작은 단백질만 관찰된 것으로 보아 재조합 대장균에서 생산된 단백질은 분해가 일어난 것으로 여겨졌다.
- 25 M ammonium sulfate 농도에서 용출되었다. Xylanase 활성을 보이는 각 분획을 SDSPAGE로 분석한 결과 30 kDa 단백질이 검출되었으며 이를 농축하여 분석한 결과 크기 작은 여러 단백질이 적은 양으로 함께 관찰되었다(Fig. 2). Xylanase 활성을 갖는 분획에서 pwxyn11B 유전자로부터 예측되는 mature protein (35.
- 클로닝된 xylanase 유전자는 xyn11B로 명명되었으며, 356 아미노산으로 구성된 단백질을 코드하는 1,071 뉴클레오티드로 이루어졌다. Xyn11B의 아미노산 배열을 분석한 결과 glycosyl hydrolase family 11에 속하는 xylanase와 상동성이 높은 활성영역과 탄수화물 결합영역을 포함하고 있는 다영역 효소로 확인되었다. SignalP4.
- 결합되지 않은 효소액을 Phenyl-Sepharose 컬럼 크로마토그래피를 수행한 결과 PwXyn11B는 Phenyl-Sepharose 컬럼에 흡착되었으며 0.5−0.25 M ammonium sulfate 농도에서 용출되었다.
- 그러므로 pwxyn11B 유전자의 개시 코돈을 확인하기 위해 구조유전자의 상부 지역의 염기서열에서 리보좀 결합위치(RBS)에 해당하는 염기서열을 조사하였다. 그 결과 pwxyn11B 유전자의 개시 코돈 ATG로부터 7 nucleotides가 떨어져 있는 지역에는 RBS로 예측되는 염기서열(GGGAGG)이 존재하였으나, P. campinasensis 균주 BL11과 G1-1의 xylanases (XylX와 XynG1-1)와 아미노 말단의 크기가 일치하도록 11개 아미노 말단 잔기 코돈을 추가적으로 포함한 지점의 ATG 코돈의 상부 지역에는 RBS 서열이 없었으므로 예측된 PwXyn11B의 개시 코돈은 맞는 것으로 판단되었다. P.
- woosongensis Xyn11B (PwXyn11B)는 GH11 xylanase의 활성영역(38−218 잔기)과 CBM36 (240−355 잔기)이 배열된 다영역 효소로 확인되었다. 그리고 SignalP4.1 프로그램으로 분석한 결과 아미노 말단의 26개 잔기가 signal peptide로 예측되어 PwXyn11B는 signal peptidase I에 의해 절단되는 전형적인 잔기 배열(A-X-A)을 포함하지 않았으며 절단 부위는 A-V-S-A 잔기로 배열되었고 이는 Fig. 1에 보인 바와 같이 다른 xylanase와 차이가 있었다. PwXyn11B의 아미노산 배열을 미국의 NCBI database에 등록된 다른 효소 비교한 결과 P.
- 기질에 따른 반응성을 조사한 결과 PwXyn11B는 oat spelt xylan와 birchwood xylan에 대한 분해활성은 거의 유사하였 으나 이들에 비해 arabinoxylan에 분해활성은 약 1.4배 수준으로 높았다(Table 1). 반면에 carboxymethyl cellulose, locust bean gum과 같이 xylan이 아닌 섬유질계 물질을 분해하지 못하였고 para-nitrophenyl-β-xyloside나 para-nitrophenyl-β-glucoside도 분해하지 못하였다.
- 반응온도와 pH가 xylanase 활성에 미치는 영향을 조사한 결과 Fig. 3A에 보인 바와 같이 50℃와 pH 6.5에서 46.3 U/ml의 최대활성을 보였으며 pH 6.0−7.0 범위에서 최대활성의 90% 이상의 활성을 나타냈다.
- 부분 정제된 Xyn11B의 반응특성을 조사한 결과 pH 6.5와 50℃에서 최대 반응활성을 보였고 birchwood xylan이나 oat spelt xylan보다 arabinoxylan에 대한 활성이 높았으며 셀룰로스, 만난과 para-nitrophenyl-β-xylopyranoside에 대해서는 분해활성이 없었다.
- 0 범위에서 최대활성의 90% 이상의 활성을 나타냈다. 열안정성 조사를 위해 조효소액을 여러 온도에서 1시간 방치 후 잔존활성을 측정하였는데 30℃에서도 실활이 일어나기 시작하였으며 50℃에서 76% 정도의 활성을 유지하였고 60℃에서는 완전히 실활되었다(Fig. 3B).
- 유전자 염기서열로부터 유추된 아미노산 배열에 따르면 P. woosongensis Xyn11B (PwXyn11B)는 GH11 xylanase의 활성영역(38−218 잔기)과 CBM36 (240−355 잔기)이 배열된 다영역 효소로 확인되었다.
- 1-kb DNA 단편이 증폭되었으며 이를 PstI과 EcoRI으로 절단하여 동일한 효소로 절단된 pUC19에 도입하여 재조합 플라스미드 pXY70를 제조하였다. 클로닝된 DNA 단편의 유전자 염기서열을 결정한 결과 유전체 분석에서 결정된 서열과 동일하였고 356 아미노산 잔기로 구성된 단백질을 코드하는 1,071 bp 크기의 xylanase 유전자가 확인되었으며 이를 xyn11B 유전자로 명명하였다. PePPER webserver (http:// pepper.
- 활성영역과 CBM을 각각 비교하였을 때는 80−84%와 75−84%의 상동성을 보였고 활성 잔기로 예상되는 119Glu와 209Glu가 활성영역에 존재하였다.
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