본 연구에서는 동시당화발효공정으로 바이오에탄올을 생산하기 위하여 바이오캡슐 형성을 시도하였다. 다수의 당화곰팡이 균주들과 발효 효모 균주들이 먼저 탐색되었다. Aspergillus sp. BCNU 6200, Penicillium sp. BCNU 6201 및 P. chrysogenum KACC 44363이 ${\alpha}$-amylase와 glucoamylase와 같은 당화 효소를 우수하게 생산하는 균주이었으며, Saccharomyces cerevisiae IFO-M-07이 조사된 균주 중에서 가장 에탄올 생산능이 높았다. 다음으로 pellet 형성 및 바이오 캡슐 형성을 위한 최적 조건을 평가하였다. 모든 조사된 곰팡이 모두 pellet을 형성하였으며, 바이오캡슐의 최적조건은 $28^{\circ}C$, 120 rpm이었다. 최종적으로 형성된 바이오캡슐을 이용하여 동시당화발효를 수행하여, Aspergillus sp. BCNU 6200의 바이오캡슐(Aspergillus sp. BCNU 6200 + S. cerevisiae IFO-M-07)이 10일간 발효시 $30^{\circ}C$, 120 rpm에서 3.9%의 에탄올을 생산함을 확인하였다. 본 실험 결과는 동시 당화발효 공정으로 바이오에탄올을 생산하는데 있어서 바이오캡슐을 활용함에 관한 유용한 정보를 제공하고 있다.
본 연구에서는 동시당화발효공정으로 바이오에탄올을 생산하기 위하여 바이오캡슐 형성을 시도하였다. 다수의 당화곰팡이 균주들과 발효 효모 균주들이 먼저 탐색되었다. Aspergillus sp. BCNU 6200, Penicillium sp. BCNU 6201 및 P. chrysogenum KACC 44363이 ${\alpha}$-amylase와 glucoamylase와 같은 당화 효소를 우수하게 생산하는 균주이었으며, Saccharomyces cerevisiae IFO-M-07이 조사된 균주 중에서 가장 에탄올 생산능이 높았다. 다음으로 pellet 형성 및 바이오 캡슐 형성을 위한 최적 조건을 평가하였다. 모든 조사된 곰팡이 모두 pellet을 형성하였으며, 바이오캡슐의 최적조건은 $28^{\circ}C$, 120 rpm이었다. 최종적으로 형성된 바이오캡슐을 이용하여 동시당화발효를 수행하여, Aspergillus sp. BCNU 6200의 바이오캡슐(Aspergillus sp. BCNU 6200 + S. cerevisiae IFO-M-07)이 10일간 발효시 $30^{\circ}C$, 120 rpm에서 3.9%의 에탄올을 생산함을 확인하였다. 본 실험 결과는 동시 당화발효 공정으로 바이오에탄올을 생산하는데 있어서 바이오캡슐을 활용함에 관한 유용한 정보를 제공하고 있다.
For the production of bioethanol by the synchronous saccharification and fermentation (SSF) process, bio-capsule formation was attempted. Many saccharifying fungal strains and fermentative yeast strains were first screened. Aspergillus sp. BCNU 6200, Penicillium sp. BCNU 6201, and P. chrysogenum KAC...
For the production of bioethanol by the synchronous saccharification and fermentation (SSF) process, bio-capsule formation was attempted. Many saccharifying fungal strains and fermentative yeast strains were first screened. Aspergillus sp. BCNU 6200, Penicillium sp. BCNU 6201, and P. chrysogenum KACC 44363 were found to be excellent producers of saccharifying enzymes such as ${\alpha}$-amylase and glucoamylase. Saccharomyces cerevisiae IFO-M-07 showed the highest ethanol productivity among the tested strains. Secondly, we determined the optimal conditions for pellet formation, and those for bio-capsule formation. All the tested fungal strains formed pellets, and the optimal conditions for bio-capsule formation were $28^{\circ}C$ and 120 rpm. Lastly, SSF process was performed using a bio-capsule. An ethanol yield of 3.9% was achieved by using the Aspergillus sp. BCNU 6200 bio-capsule (Aspergillus sp. BCNU 6200 + S. cerevisiae IFO-M-07) at $30^{\circ}C$ with shaking at 120 rpm during the 10 days of incubation. The results provide useful information on the application of a bio-capsule in bioethanol production under the SSF process.
For the production of bioethanol by the synchronous saccharification and fermentation (SSF) process, bio-capsule formation was attempted. Many saccharifying fungal strains and fermentative yeast strains were first screened. Aspergillus sp. BCNU 6200, Penicillium sp. BCNU 6201, and P. chrysogenum KACC 44363 were found to be excellent producers of saccharifying enzymes such as ${\alpha}$-amylase and glucoamylase. Saccharomyces cerevisiae IFO-M-07 showed the highest ethanol productivity among the tested strains. Secondly, we determined the optimal conditions for pellet formation, and those for bio-capsule formation. All the tested fungal strains formed pellets, and the optimal conditions for bio-capsule formation were $28^{\circ}C$ and 120 rpm. Lastly, SSF process was performed using a bio-capsule. An ethanol yield of 3.9% was achieved by using the Aspergillus sp. BCNU 6200 bio-capsule (Aspergillus sp. BCNU 6200 + S. cerevisiae IFO-M-07) at $30^{\circ}C$ with shaking at 120 rpm during the 10 days of incubation. The results provide useful information on the application of a bio-capsule in bioethanol production under the SSF process.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 바이오에탄올 생산공정에서 동시당화발효 공정을 적용하기 위하여 당화능이 우수한 곰팡이와 알코올 발효능이 우수한 효모를 탐색 및 분리하여 이들 균주들을 이용하여 바이오캡슐 형성 최적 조건을 검토하였다. 나아가 바이오캡슐을 적용하여 동시당화발효를 수행하여 그 결과를 보고하고자 한다.
곰팡이와 효모를 이용한 바이오캡슐 형성은 영양원이 제한된 환경에서 효모는 한 세대 이상 성장하지 못하므로 곰팡이가 형성하는 pellet 사이로 들어가 엮여 자연적으로 공고정화되는 원리를 이용한 것이다[12]. 따라서 곰팡이의 pellet 형성은 바이오캡슐의 기초가 되므로 당화능이 우수한 3 균주에 대한 pellet 형성 여부를 조사하였다. 그 결과, P.
따라서 본 연구에서는 바이오에탄올 생산공정에서 동시당화발효 공정을 적용하기 위하여 당화능이 우수한 곰팡이와 알코올 발효능이 우수한 효모를 탐색 및 분리하여 이들 균주들을 이용하여 바이오캡슐 형성 최적 조건을 검토하였다. 나아가 바이오캡슐을 적용하여 동시당화발효를 수행하여 그 결과를 보고하고자 한다.
본 연구에서는 당화능이 우수한 균주 및 에탄올 발효능이 우수한 균주를 탐색하였으며, 이를 이용하여 바이오캡슐을 형성하기 위한 최적 조건을 조사하여 동시당화발효를 수행하였다. 이번 결과는 향후 바이오에탄올 생성공정에서 바이오캡슐을 이용하여 동시당화발효를 수행하기 위한 기초자료로 활용될 수 있으며, 이상의 연구를 바탕으로 에탄올 수율 향상을 위한 추후 연구가 이루어져야 할 것으로 사료된다.
본 연구에서는 동시당화발효공정으로 바이오에탄올을 생산하기 위하여 바이오캡슐 형성을 시도하였다. 다수의 당화 곰팡이 균주들과 발효 효모 균주들이 먼저 탐색되었다.
선별 균주의 바이오캡슐 형성 조건을 탐색하기 위해 pellet 형성 여부, 온도 및 진탕속도를 평가하였다. Pellet 형성 여부를 조사하기 위해 각각 0.1 M PBS (pH 7)에 녹인 10 ml의 yeast nitrogen base medium without amino acids (YNB; 67 g/l)와 90 ml의 gluconic acid (5 g/l)를 혼합하여 제조한 배지에 곰팡이 포자를 접종하고 120 rpm에서 28℃로 7일간 배양하며 경시적으로 관찰하였다. 최적 형성 온도는 동일한 배지에 4 × 106 cell/ml의 농도로 조절한 효모와 곰팡이 포자를 접종하고 120 rpm에서 28℃ 및 30℃로 7일간 배양한 후 형성된 바이오캡슐 크기를 측정하였다.
chrysogenum KACC 44307 및 Aspergillus niger KACC 40280을 농업유전자원정보센터(Korean Agricultureal Culutre Collection, KACC)에서 분양받았고, Saccharomyces cerevisiae IFO-M-07을 일산실업㈜에서 제공받아 사용하였다. 각 균주들은 PDA 배지에 계대배양하여 보관 및 실험에 이용하였다.
곰팡이 단독 균주 및 효모 단독 균주를 최적 조건에서 형성된 바이오캡슐의 대조구로 하여 동시당화발효를 수행한 결과, 시간에 따른 포도당 함량 및 에탄올 생산능을 비교하였다(Fig. 4). 선별 곰팡이 각각의 pellet 및 바이오캡슐(곰팡이 + 효모)의 경우 초기 동시당화발효 단계에서 곰팡이가 분비하는 당화효소에 의해 전분이 당화되어 포도당이 축적되는 것이 관찰되었다.
균주를 starch broth (starch 10 g/l, beef extract 3 g/l)에 접종하여 30℃에서 48시간 동안 배양하였으며, 배양액은 18,000 ×g에서 5분간 원심분리하여 잔여 전분 및 균사와 상등액을 분리하였으며, 상등액을 α-amylase 및 glucoamylase 효소 활성 측정을 위한 시료로 사용하였다.
chrysogenum KACC 44363이 α-amylase와 glucoamylase와 같은 당화 효소를 우수하게 생산하는 균주이었으며, Saccharomyces cerevisiae IFO-M-07이 조사된 균주 중에서 가장 에탄올 생산능이 높았다. 다음으로 pellet 형성 및 바이오 캡슐 형성을 위한 최적 조건을 평가하였다. 모든 조사된 곰팡이 모두 pellet을 형성하였으며, 바이오캡슐의 최적조건은 28℃, 120 rpm이었다.
동시당화발효를 수행하기 위해 starch 100 g/l, NaNO33 g/l, KCl 0.1 g/l, MgSO4 ·7H2O 1 g/l, Fe2SO4·7H2O 0.01 g/l를 혼합한 배지에 바이오캡슐을 1.5% 첨가하고 30℃에서 120 rpm 으로 10일간 배양하였으며, 24시간 간격으로 18,000 ×g에서 10분간 원심분리한 후 얻은 상등액을 이용하여 포도당 함량 및 에탄올 생성량을 측정하였다[18].
3A), 따라서 바이오캡슐 형성에 이용 가능할 것으로 판단되었다. 바이오캡슐 형성 최적 조건을 검토하기 위해 우선 온도를 조사하였으며, 그 결과는 Fig. 3B와 같다. 30℃, 120 rpm에서 바이오캡슐을 형성한 P.
바이오캡슐을 형성하기 위한 곰팡이와 효모를 분리하기 위해 토양, 과일, 시판 막걸리, 발효식품 및 누룩을 분리원으로 사용하였으며, 각 시료를 멸균수에 현탁한 후 적정농도로 희석하여 chloramphenicol (35 mg/l)이 첨가된 potato dextrose agar (PDA) 배지에 0.2 ml씩 도말하여 28℃로 4−5일간 배양한 후 모양, 색깔 및 크기 등의 형태적 특징을 통해 단일 집락을 분리하였다.
선별 균주의 바이오캡슐 형성 조건을 탐색하기 위해 pellet 형성 여부, 온도 및 진탕속도를 평가하였다. Pellet 형성 여부를 조사하기 위해 각각 0.
chrysogenum은 다양한 범위의 pH에서 α-amylase를 분비 생산하여 생물공학의 잠재적인 자원으로 연구되고 있으며[19], Aspergillus 중 일부 균주들은 α-amylase 및 glucoamylase와 같은 당화효소들을 분비 생산하여 곡류전분을 분해하는 것으로 알려져 있다[15, 16]. 이에 당화능이 우수한 3 균주를 최종 선별하였으며, 이를 이용하여 바이오 캡슐 형성 최적 조건을 탐색하였다.
34 M potassium dichromate, 5 M sulfuric acid)와 30분간 혼합하였다. 이후 microplate reader (Model 550, Bio-Rad, USA)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 대조구로는 선별 균주 각각의 pellet 및 효모를 이용하였다.
최적 형성 온도는 동일한 배지에 4 × 106 cell/ml의 농도로 조절한 효모와 곰팡이 포자를 접종하고 120 rpm에서 28℃ 및 30℃로 7일간 배양한 후 형성된 바이오캡슐 크기를 측정하였다.
5% 첨가하고 30℃에서 120 rpm 으로 10일간 배양하였으며, 24시간 간격으로 18,000 ×g에서 10분간 원심분리한 후 얻은 상등액을 이용하여 포도당 함량 및 에탄올 생성량을 측정하였다[18]. 포도당 함량은 DNS method로 정량하였으며[15], 에탄올 생성량은 dichromate method를 변형하여 측정하였다[17]. 1 ml의 상등액에 1 ml 의 tri-n-butylphosphate를 첨가하여 30분간 vortexing한 후, 층 분리가 일어났을 때 0.
2 ml의 starch (1 g/l) 를 첨가하고 30℃에서 20분간 반응시켜 α-amylase 활성을 측정하였다. 한편 100 mM sodium acetate buffer (pH 5.5)에녹인 0.2 ml의 starch (1 g/l)를 첨가하여 50℃에서 20분간 반응시켜 glucoamylase 활성을 측정하였다. 효소활성은 유리된 환원당을 DNS method로 정량하였으며, 각 효소의 활성 1 unit은 1분당 1 μM의 포도당을 만드는데 필요한 효소량으로 정의하였다[15, 16].
형태학적 특징을 통해 1차 선별된 21개의 곰팡이, 13개의 효모와 분양 및 제공받은 4개 균주를 이용하여 당화효소 활성 및 에탄올 생성능을 측정하였으며 당화능이 우수한 곰팡이 3종, 에탄올 생성능이 높은 효모 1종을 최종 선별하였다.
대상 데이터
와 유사한 에탄올 발효능을 나타내었다[17]. 따라서 S. cerevisiae IFO-M-07을 바이오캡슐 제조용 발효 균주로 최종 선별하였다.
2 ml씩 도말하여 28℃로 4−5일간 배양한 후 모양, 색깔 및 크기 등의 형태적 특징을 통해 단일 집락을 분리하였다. 또한 Penicillium chrysogenum KACC 44363, P. chrysogenum KACC 44307 및 Aspergillus niger KACC 40280을 농업유전자원정보센터(Korean Agricultureal Culutre Collection, KACC)에서 분양받았고, Saccharomyces cerevisiae IFO-M-07을 일산실업㈜에서 제공받아 사용하였다. 각 균주들은 PDA 배지에 계대배양하여 보관 및 실험에 이용하였다.
이론/모형
Pre-culture of various yeast strains were inoculated into new YPD medium and cultivated at 28℃ for 48 h. Ethanol productivity was measured using the dichromate method.
α-Amylase and glucoamylase activities were determined using crude enzyme solution obtained by centrifugation and starch broth at 30℃ for 48 h. The released glucose was measured with DNS method. Enzyme activity unit was expressed as the amount of enzyme releasing one μmole of glucose equivalent per minute per ml.
에탄올 생성량은 yeast extract peptone dextrose (YPD; yeast extract 10 g/l, peptone 20 g/l, glucose 200 g/l) 배지에 전배양한 효모를 1% 농도로 접종하고 28℃에서 48시간 동안 정치 배양한 후 10,000 ×g에서 10분간 원심분리하여 상등액을 에탄올 함량 측정에 사용하였다. 에탄올 생성량은 dichromate method에 따라 측정하였다[17].
성능/효과
3 mm 크기로 가장 작았다. 28℃와 30℃ 에서 형성된 바이오캡슐 크기를 전반적으로 비교하였을 때, 유의차가 거의 없는 것으로 나타나 바이오캡슐 형성 온도는 일반적인 진균류의 배양온도를 고려할 때 28℃가 가장 적합한 것으로 판단되었다. 진탕속도의 경우 곰팡이 종류와 관계없이 100 rpm에서 배양했을 때 바이오캡슐의 크기가 크고 다소 불규칙적인 구형을 나타냈으며, 반면에 150 rpm으로 배 양하였을 경우 크기가 작고 구형의 바이오캡슐을 형성하였다 (Fig.
Aspergillus sp. BCNU 6200의 바이오캡슐 (Aspergillus sp. BCNU 6200 + S. cerevisiae IFO-M-07)은 3일째부터 포도당 함량이 급격하게 감소되었고, 4일째에 3.9% 의 에탄올을 생산하여 에탄올 생성능이 가장 우수하였으며, P. chrysogenum KACC 44363의 바이오캡슐(P. chrysogenum KACC 44363 + S. cerevisiae IFO-M-07)은 5일째부터 포도당 함량이 감소하여, 8일째에 1.75%의 에탄올을 생산하였다. 이는 A.
최종적으로 형성된 바이오캡슐을 이용하여 동시당화발효를 수행하여, Aspergillus sp. BCNU 6200의 바이오캡슐(Aspergillus sp. BCNU 6200 + S. cerevisiae IFO-M-07)이 10일간 발효시 30℃, 120 rpm에서 3.9%의 에탄올을 생산함을 확인하였다. 본 실험 결과는 동시 당화발효 공정으로 바이오에탄올을 생산하는데 있어서 바이오캡슐을 활용함에 관한 유용한 정보를 제공하고 있다.
BCNU 6200 및 Penicillium sp. BCNU 6201 모두 pellet을 형성하는 것으로 확인되었으며(Fig. 3A), 따라서 바이오캡슐 형성에 이용 가능할 것으로 판단되었다. 바이오캡슐 형성 최적 조건을 검토하기 위해 우선 온도를 조사하였으며, 그 결과는 Fig.
BCNU 6201 및 P. chrysogenum KACC 44363이 α-amylase와 glucoamylase와 같은 당화 효소를 우수하게 생산하는 균주이었으며, Saccharomyces cerevisiae IFO-M-07이 조사된 균주 중에서 가장 에탄올 생산능이 높았다.
BCNU 6200 그리고 Penicillium sp. BCNU 6201 순으로 활성이 좋은 것으로 조사되었다(Fig. 1). Glucoamylase 활성은 Aspergillus sp.
cerevisiae IFO-M-07은 전분 당화력이 결여되어 있어, 포도당이 생산되지 않았으며, 이에 에탄올도 생성되지 않았다. 이러한 결과를 통해 바이오캡슐을 이용할 경우 당화공정과 발효공정이 동시에 수행되어 에탄올이 생성되는 것을 확인하였다.
한편 에탄올 생성량을 확인한 결과, 일산실업㈜에서 제공 받은 S. cerevisiae IFO-M-07이 4.7%로 에탄올 발효능이 가장 높은 것으로 확인되었으며(Fig. 2), 이는 흑마늘 와인을 제조하기 위해 선별되어진 Saccharomyces sp.와 유사한 에탄올 발효능을 나타내었다[17].
후속연구
이번 결과는 향후 바이오에탄올 생성공정에서 바이오캡슐을 이용하여 동시당화발효를 수행하기 위한 기초자료로 활용될 수 있으며, 이상의 연구를 바탕으로 에탄올 수율 향상을 위한 추후 연구가 이루어져야 할 것으로 사료된다. 또한 연속 동시당화발효가 4회까지는 가능한 것으로 조사되었으나 (unpublished data), 보다 자세한 연속 동시당화발효 공정에 대한 연구가 지속적으로 연구되어야 할 것이다.
9%의 에탄올을 생산함을 확인하였다. 본 실험 결과는 동시 당화발효 공정으로 바이오에탄올을 생산하는데 있어서 바이오캡슐을 활용함에 관한 유용한 정보를 제공하고 있다.
본 연구에서는 당화능이 우수한 균주 및 에탄올 발효능이 우수한 균주를 탐색하였으며, 이를 이용하여 바이오캡슐을 형성하기 위한 최적 조건을 조사하여 동시당화발효를 수행하였다. 이번 결과는 향후 바이오에탄올 생성공정에서 바이오캡슐을 이용하여 동시당화발효를 수행하기 위한 기초자료로 활용될 수 있으며, 이상의 연구를 바탕으로 에탄올 수율 향상을 위한 추후 연구가 이루어져야 할 것으로 사료된다. 또한 연속 동시당화발효가 4회까지는 가능한 것으로 조사되었으나 (unpublished data), 보다 자세한 연속 동시당화발효 공정에 대한 연구가 지속적으로 연구되어야 할 것이다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
동시당화발효란 무엇인가?
이에 생산 비용을 보다 절감하기 위하여 최근에는 재생 가능하며 저렴한 미세조류[6], 산업 폐액[7] 및 음식 폐기물[8, 9] 등을 자원으로 이용하거나 동시당화발효(Synchronous saccharification and fermentation, SSF) [8, 10]를 통한 바이오에탄올 생산에 대한 연구가 지속적으로 진행되고 있다. 동시당화발효는 기존의 공정과 달리 당화효소를 분비하는 미생물과 발효 미생물을 혼합하여 당화공정과 발효공정을 동시에 수행하는 것으로, 곰팡이에 의해 생성된 포도당이 효모에 의해 빠르게 에탄올로 전환되어 포도당에 의한 전분의 효소적 가수분해에 대한 저해 작용을 최대한 줄이며 동시에 공정비용을 절감시킴으로써 공정의 효율을 향상시킬 수 있다[9].
효모를 이용하는 에탄올 발효 공정의 단점은 무엇인가?
3)를 사용하는 당화, 마지막으로 효모를 이용하는 에탄올 발효 공정으로 크게 3단계로 나누어져 있다[5]. 이러한 공정의 전분 용액화 및 당화를 위해 상업적 효소를 이용하는 전처리 과정은 에탄올 발효에 관여하는 효모의 전분 분해력 결여로 인한 것으로, 상업효소 사용경비로 인해 에탄올 생산 비용이 상대적으로 높다[3, 5]. 이에 생산 비용을 보다 절감하기 위하여 최근에는 재생 가능하며 저렴한 미세조류[6], 산업 폐액[7] 및 음식 폐기물[8, 9] 등을 자원으로 이용하거나 동시당화발효(Synchronous saccharification and fermentation, SSF) [8, 10]를 통한 바이오에탄올 생산에 대한 연구가 지속적으로 진행되고 있다.
동시당화발효의 장점은?
이에 생산 비용을 보다 절감하기 위하여 최근에는 재생 가능하며 저렴한 미세조류[6], 산업 폐액[7] 및 음식 폐기물[8, 9] 등을 자원으로 이용하거나 동시당화발효(Synchronous saccharification and fermentation, SSF) [8, 10]를 통한 바이오에탄올 생산에 대한 연구가 지속적으로 진행되고 있다. 동시당화발효는 기존의 공정과 달리 당화효소를 분비하는 미생물과 발효 미생물을 혼합하여 당화공정과 발효공정을 동시에 수행하는 것으로, 곰팡이에 의해 생성된 포도당이 효모에 의해 빠르게 에탄올로 전환되어 포도당에 의한 전분의 효소적 가수분해에 대한 저해 작용을 최대한 줄이며 동시에 공정비용을 절감시킴으로써 공정의 효율을 향상시킬 수 있다[9].
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