사료자원에 서식하는 세균의 소화효소활성, 항생제내성 및 병원성에 관한 특성 Characteristics of digestive enzyme activity, antibiotic resistance, and pathogenicity of bacteria inhabited in animal feed resources원문보기
Among different types of spoilage, microbial contamination can cause feed decomposition, which results in decreases in feed intake and productivity, infection, and breeding disorder. During the storage time, various microbes have a chance to inoculate with depreciation of feed and to infect the anim...
Among different types of spoilage, microbial contamination can cause feed decomposition, which results in decreases in feed intake and productivity, infection, and breeding disorder. During the storage time, various microbes have a chance to inoculate with depreciation of feed and to infect the animals. We investigated bacteria that inhabit diverse feed ingredients and complete feed which have been stored for a few months. We isolated and identified 30 genera and 62 species of bacteria. Among these 62 species, 21 species were of non-pathogenic bacteria, 18 species were of pathogenic bacteria, 9 species were of opportunistic pathogens, and 14 species were of unknown bacteria. Pantoea allii and 24 species showed proteolytic enzyme activity. We also confirmed that 6 species including Pseudomonas psychrotolerans showed ${\alpha}$-amylase activity, and 29 species including Burkholderia vietnamiensis showed cellulase activity. Microbacterium testaceum and 3 species showed resistance to Ampicillin, Kanamycin, Streptomycin, Gentamicin, Carbenicillin, and Erythromycin ($50{\mu}g/mL$). Using mealworm larvae (Tenebrio molitor L.) as a model for pathogenicity, we confirmed that 8 species including Staphylococcus xylosus had pathogenicity for mealworm larvae. Especially, Enterobacter hormaechei, Staphylococcus xylosus, and Staphylococcus hominis were reported as being pathogenic for humans. This research suggests that hygienic management of animal feed is essential because beneficial and harmful bacteria can inhabit animal feed differently during storage and distribution.
Among different types of spoilage, microbial contamination can cause feed decomposition, which results in decreases in feed intake and productivity, infection, and breeding disorder. During the storage time, various microbes have a chance to inoculate with depreciation of feed and to infect the animals. We investigated bacteria that inhabit diverse feed ingredients and complete feed which have been stored for a few months. We isolated and identified 30 genera and 62 species of bacteria. Among these 62 species, 21 species were of non-pathogenic bacteria, 18 species were of pathogenic bacteria, 9 species were of opportunistic pathogens, and 14 species were of unknown bacteria. Pantoea allii and 24 species showed proteolytic enzyme activity. We also confirmed that 6 species including Pseudomonas psychrotolerans showed ${\alpha}$-amylase activity, and 29 species including Burkholderia vietnamiensis showed cellulase activity. Microbacterium testaceum and 3 species showed resistance to Ampicillin, Kanamycin, Streptomycin, Gentamicin, Carbenicillin, and Erythromycin ($50{\mu}g/mL$). Using mealworm larvae (Tenebrio molitor L.) as a model for pathogenicity, we confirmed that 8 species including Staphylococcus xylosus had pathogenicity for mealworm larvae. Especially, Enterobacter hormaechei, Staphylococcus xylosus, and Staphylococcus hominis were reported as being pathogenic for humans. This research suggests that hygienic management of animal feed is essential because beneficial and harmful bacteria can inhabit animal feed differently during storage and distribution.
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문제 정의
단미사료, 비지박, 맥주박, 미강 등 사료용 농업부산물, 배합사료 및 사일리지 등 사료원료 및 사료에 따라 수분함량이나 영양분 조성이 매우 다양하다. 본 연구에서는 사료보관에 따른 다양한 사료원료 및 배합사료에 서식하는 세균을 분리 및 동정하여 이들 세균들의 효소활성, 약제내성 및 병원성을 파악하여 미생물학적 변화 특성을 구명하고자 하였다.
제안 방법
1/10 농도의 NA, LB, MRS, YM, R2A 영양배지로 1% 한천배지를 만들어 약 50°C 정도로 식힌 후 배지가 굳기 전에 분리한 세균의 배양액의 양을 배지의 10%가 되게 넣고 굳혀 젤리를 만들었다.
, USA)을 사용했으며 모두 50 μg/mL의 농도로 진행하였다. 24시간 배양한 각 세균들을 최초로 분리했던 배지의 종류에 맞춰 도말한 후 배지에 well을 만들어 각각의 항생제를 분주하였다. NA, LB, MRS 배지는 37°C에서 24시간, YM 배지는 30°C에서 48시간 그리고 R2A 배지는 25°C에서 72시간 배양하였다.
90 mm 배양접시에 밀기울을 1 g씩 담고 며칠 동안 관찰할 것을 고려하여 10∼12일령의 활동성이 높은 갈색거저리 유충을 골라서 넣었다.
시료를 도말한 NA, LB, MRS 배지는 37°C에서 24시간, YM 배지는 30°C에서 48시간 그리고 R2A 배지는 25°C에서 72시간 배양하였다. 각 배지에서 단일 집락을 확인한 후 동정하였다. 동정은 마크로젠(Seoul, Korea)에 의뢰하였으며 16S ribosomal DNA의 염기서열을 분석하였다.
그 후 투명환을 측정하여 지름이 0.0∼10 mm 이하는 +, 10∼20 mm 이하는 ++, 20∼30 mm 이하는 +++, 30 mm 이상은 ++++로 표시하였다.
각 배지에서 단일 집락을 확인한 후 동정하였다. 동정은 마크로젠(Seoul, Korea)에 의뢰하였으며 16S ribosomal DNA의 염기서열을 분석하였다. 추출한 DNA의 증폭에는 27F (5′-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3′), 1492R (5′-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3′) 프라이머를 사용하였다.
본 연구에서는 미강, 두부비지, 맥주박, 보리, 배합 사료(가금, 양돈, 착유우), 그리고 옥수수 사일리지에서 서식하고 있는 세균들을 동정하여 유해균과 유익균의 분포를 조사하였다. 대부분의 사료는 제조 후 유통 시간이 오래된 제품들에서 조사하였으며 이들 사료원료와 배합사료에는 다양한 세균들을 확인할 수 있었다.
사료자원에서 분리한 세균들의 병원성을 조사하기 위하여 곤충인 갈색거저리 유충을 이용하여 분리한 세균들을 급여하여 병원성이 어느 정도 있는지 관찰하였다(Fig. 1). 양성대조구로는 병원성균인 Listeria monocytogenes SK728을 배지에 넣어 급여하였다.
이렇게 만들어진 평판접시는 30°C에서 보관하였다. 세균이 포함된 배지 젤리를 넣고 72시간 후 죽은 갈색거저리 유충의 수를 세어 기록하였다(0점). 살아있는 갈색거저리 유충은(즉 건드리지 않아도 활발하게 움직이면) 3점, 건드린 후에 움직임이 있으면 2점, 그리고 건드린 이후에도 움직임이 거의 없고 머리나 꼬리의 움직임만 조금 있을 경우에는 1점으로 점수화하였다.
시료를 도말한 NA, LB, MRS 배지는 37°C에서 24시간, YM 배지는 30°C에서 48시간 그리고 R2A 배지는 25°C에서 72시간 배양하였다.
이 젤리를 갈색거저리 유충이 들어 있는 배양접시에 넣어 주었다. 음성대조구로 무균배지들(LB, MRS, YM, R2A) 을 이용하였고 양성대조구에는 LB에 병원성이 있는 Listeria monocytogenes SK728를 접종한 후 만든 젤리를 급여하여 이용하였다.
효소활성을 측정하기 위해 agar well diffusion method (Perez 등, 1990)를 이용하였다. 전분분해효소, 섬유소분해효소, 단백질분해효소, 지방분해효소의 활성을 확인하였다. 각각의 효소활성을 확인하기 위해서 Starch (Sigma-Aldrich Co.
채취한 시료 1 g을 멸균 증류수 9 mL로 희석(1:9) 한 후 단계 희석하여 Nutrient Agar (NA), Luria Bertani (LB), de Man, Rogosa and Sharpe (MRS), Yeast Malt (YM), Reasoner's 2A (R2A) 평판 배지에 도말하였다.
항생제는 Ampicillin과 Kanamycin (Bio basic Inc., Canada), Streptomycin, Gentamicin, Carbenicillin, Erythromycin (SigmaAldrich Co., USA)을 사용했으며 모두 50 μg/mL의 농도로 진행하였다.
대상 데이터
염기서열의 분석에는 분석시료에 따라 미강, 비지박, 맥주박은 785F (5′-GGA TTA GAT ACC CTG GTA-3′), 907R (5′-CCG TCA ATT CMT TTR AGT TT-3′) 프라이머를 사용하였으며, 보리, 양돈 사료, 양계사료, 축우사료 및 사일리지는 27F 프라이머를 사용하였다. DNA 상동성 검색은 NCBI의 BLAST와 EzTaxon의 데이터베이스를 이용하였다.
갈색거저리 유충이 죽으면 멜라닌화로 인해 검게 되는 것을 이용하여 분리한 세균들의 병원성을 조사하였다(Noonin 등, 2010). 갈색거저리 유충은 양주시 농업기술센터에서 분양받아 사용하였다. 한 종류의 세균에 갈색거저리 유충 10마리를 사용하여 실험하였다.
다양한 사료 원료에 서식하는 세균을 분리 및 동정하기 위하여 여러 가지 사료 원료를 이용하였다. 단미사료에 해당하는 보리, 사료용 농업 부산물인 비지박, 맥주박, 미강과 배합사료인 양돈 사료, 양계 사료, 축우 사료와 사일리지를 실험 재료로 사용하였다.
다양한 사료 원료에 서식하는 세균을 분리 및 동정하기 위하여 여러 가지 사료 원료를 이용하였다. 단미사료에 해당하는 보리, 사료용 농업 부산물인 비지박, 맥주박, 미강과 배합사료인 양돈 사료, 양계 사료, 축우 사료와 사일리지를 실험 재료로 사용하였다. 모든 시료는 시중에 유통되는 사료원료를 각 1점씩 이용하였다.
또한 각 재료들은 신선한 상태에서 실험에 사용하지 않고 본 실험실에서 2주∼6개월 정도 상온에 보관한 후 채취하여 실험에 사용하였다.
단미사료에 해당하는 보리, 사료용 농업 부산물인 비지박, 맥주박, 미강과 배합사료인 양돈 사료, 양계 사료, 축우 사료와 사일리지를 실험 재료로 사용하였다. 모든 시료는 시중에 유통되는 사료원료를 각 1점씩 이용하였다. 또한 각 재료들은 신선한 상태에서 실험에 사용하지 않고 본 실험실에서 2주∼6개월 정도 상온에 보관한 후 채취하여 실험에 사용하였다.
갈색거저리 유충은 양주시 농업기술센터에서 분양받아 사용하였다. 한 종류의 세균에 갈색거저리 유충 10마리를 사용하여 실험하였다. 90 mm 배양접시에 밀기울을 1 g씩 담고 며칠 동안 관찰할 것을 고려하여 10∼12일령의 활동성이 높은 갈색거저리 유충을 골라서 넣었다.
이론/모형
항생제 내성 실험을 위해 효소활성 실험과 동일하게 agar well diffusion method를 이용하였다. 항생제는 Ampicillin과 Kanamycin (Bio basic Inc.
효소활성을 측정하기 위해 agar well diffusion method (Perez 등, 1990)를 이용하였다. 전분분해효소, 섬유소분해효소, 단백질분해효소, 지방분해효소의 활성을 확인하였다.
성능/효과
Curtobacterium citreum SK3897, Xanthomonas maliensis SK3853 그리고 Staphylococcus hominis SK3730은 치사율이 각각 20%, 30%, 30%로 높은 치사율은 아니었으나 병원성 점수는 10점 이하로 매우 낮은 점수를 기록하였다.
Table 1에서와 같이 Lactococcus lactis SK3858, Lactobacillus plantarum SK3728, Bacillus megaterium SK3755, Bacillus amyloiquefaciens SK3736, Bacillus subtilis SK3754와 같은 유익한 균과 Stenotrophomonas maltophilia SK3725, Enterococcus faecium SK3745, Staphylococcus saprophyticus SK3714 등과 같이 병원성을 가지는 것으로 예상되는 균들이 주로 서식하는 것으로 나타났다. Bacillus pumilus SK3716, Bacillus cereus SK3758, SK3903 등처럼 유익한 균이지만 특정 환경에서는 독소를 생성하는 병원성을 가지는 것으로 보고된 균주도 있었다(From 등, 2007).
높은 치사율과 낮은 병원성 점수를 기록한 세균들 중 사람에게 감염을 일으키는 세균은 Enterobacter hormaechei SK3902와 Staphylococcus xylosus SK3715, Staphylococcus hominis SK3730으로 나타났다. 특히, Enterobacter hormaechei SK3902는 사람에게는 감염증을 일으키지만(Wenger 등, 1997), 토마토와 같은 식물에 있어서는 반대로 성장을 촉진시키는 기능이 있는 것으로 나타났다(Egamberdieva 등, 2014; Vaikuntapu 등, 2014).
본 연구에서는 미강, 두부비지, 맥주박, 보리, 배합 사료(가금, 양돈, 착유우), 그리고 옥수수 사일리지에서 서식하고 있는 세균들을 동정하여 유해균과 유익균의 분포를 조사하였다. 대부분의 사료는 제조 후 유통 시간이 오래된 제품들에서 조사하였으며 이들 사료원료와 배합사료에는 다양한 세균들을 확인할 수 있었다. 이들 세균들은 대부분 일차적으로는 수확 시 토양에서 작물로 전이된 균들로 추정되며, 일부는 사료제조 후에도 포자형성균은 생존하여 다시 영양 세포로 자라는 것으로 추정된다.
대조구인 Listeria monocytogenes SK728의 60%의 치사율과 같은 수치를 기록한 균주는 Staphylococcus xylosus SK3715와 Bacillus amyloliquefaciens SK3736이었으며 이보다 조금 낮은 치사율인 50%를 기록한 세균은 Enterobacter hormaechei SK3902, Bacillus altitudinis SK3862 및 Bacillus aryabhattai SK3757이었다. 이들 균주는 병원성 점수가 10점 이하를 기록했다.
병원성균과 기회감염균이 거의 1/2 정도 분리된 것은 단미사료 및 배합사료 샘플들 이 신선한 것을 사용한 것이 아니기 때문에 저장기간 동안 유해균의 오염 및 증식이 일어난 것으로 판단된다. 분리한 세균들 중 그람양성균과 그람음성균은 각 각 65%와 35%로 나타났다.
이중 간균은 41종, 구균은 16종이었으며 구상간균은 5종이 분리되었다. 비병원성균이 21종으로 가장 많았으며 병원성균이 18종, 그리고 병원성인 기회 감염균이 9종, 그리고 유익한 균인지 아니면 병원성 균주인지에 관해 아직 잘 알려지지 않은 세균이 14종이 분리되었다. 병원성균과 기회감염균이 거의 1/2 정도 분리된 것은 단미사료 및 배합사료 샘플들 이 신선한 것을 사용한 것이 아니기 때문에 저장기간 동안 유해균의 오염 및 증식이 일어난 것으로 판단된다.
양성대조구로는 병원성균인 Listeria monocytogenes SK728을 배지에 넣어 급여하였다. 아무런 세균을 넣지 않은 경우에도 시간이 경과하면서 자연 사멸하게 되는 치사율이 평균 약 10%였으며 병원성 점수는 평균 27점이었다. 즉 병원성균의 감염이 아닌 자연적으로 갈색거저리 유충이 사멸하는 확률이 약 10%가 될 수 있음을 시사하였다.
사료자원인 미강, 두부비지, 맥주박, 보리, 배합사료(가금, 양돈, 착유우), 그리고 옥수수 사일리지에서 30개의 속, 62종의 세균을 분리하고 동정을 하였다 (Table 1). 이중 간균은 41종, 구균은 16종이었으며 구상간균은 5종이 분리되었다. 비병원성균이 21종으로 가장 많았으며 병원성균이 18종, 그리고 병원성인 기회 감염균이 9종, 그리고 유익한 균인지 아니면 병원성 균주인지에 관해 아직 잘 알려지지 않은 세균이 14종이 분리되었다.
Table 1에서와 같이 Pantoea allii SK3890 외 24종의 세균에서는 단백질분해 활성이 확인되었다. 전분분해 효소는 Pseudomonas psychrotolerans SK3910 외 5종, 섬유소분해효소는 Burkholderia vietnamiensis SK3869 외 28종에서 분비되는 것으로 나타났다. 그러나 지방 분해효소의 활성을 보이는 세균은 없었다.
아무런 세균을 넣지 않은 경우에도 시간이 경과하면서 자연 사멸하게 되는 치사율이 평균 약 10%였으며 병원성 점수는 평균 27점이었다. 즉 병원성균의 감염이 아닌 자연적으로 갈색거저리 유충이 사멸하는 확률이 약 10%가 될 수 있음을 시사하였다. 그러나 병원 성균인 Listeria monocytogenes SK728을 첨가한 경우에는 치사율이 60%로 가장 높았으며 병원성 점수는 4점으로 가장 낮은 수치를 나타내었다.
특히 Pantoea allii SK3890, Leclercia adecarboxylata SK3896, Pseudomonas psychrotolerans SK3910, Bacillus altitudinis SK3862, Bacillus methylotrophicus SK3711, Bacillus aquimaris SK3712, Staphylococcus xylosus SK3715, Bacillus pumilus SK3716, Enterococcus durans SK3722, Lactobacillus plantarum SK3728, Lactobacillus curvatus SK3733, Bacillus amyloliquefaciens SK3736, Bacillus safensis SK3738, Pediococcus lolii SK3746, Streptomyces albidoflavus SK3753, Bacillus subtilis SK3754, Bacillus megaterium SK3755, Acinetobacter calcoaceticus SK3760, Acinetobacter oleivorans SK3761 균주가 2개 이상의 소화효소 활성이 높은 균주로 확인되었다. 특히 보리와 사일리지에서 분리ㆍ동정한 대부분 세균들은 다른 사료자원에서 분리된 것들보다도 효소 활성이 높은 특징을 보였다.
특히 Pantoea allii SK3890, Leclercia adecarboxylata SK3896, Pseudomonas psychrotolerans SK3910, Bacillus altitudinis SK3862, Bacillus methylotrophicus SK3711, Bacillus aquimaris SK3712, Staphylococcus xylosus SK3715, Bacillus pumilus SK3716, Enterococcus durans SK3722, Lactobacillus plantarum SK3728, Lactobacillus curvatus SK3733, Bacillus amyloliquefaciens SK3736, Bacillus safensis SK3738, Pediococcus lolii SK3746, Streptomyces albidoflavus SK3753, Bacillus subtilis SK3754, Bacillus megaterium SK3755, Acinetobacter calcoaceticus SK3760, Acinetobacter oleivorans SK3761 균주가 2개 이상의 소화효소 활성이 높은 균주로 확인되었다. 특히 보리와 사일리지에서 분리ㆍ동정한 대부분 세균들은 다른 사료자원에서 분리된 것들보다도 효소 활성이 높은 특징을 보였다.
항생제 내성 실험에서 Microbacterium testaceum SK3888, Kocuria aegyptia SK3889, Methylbacterium oryzae SK3898, Stenotrophomonas maltophilia SK3725의 4종류의 세균은 Ampicillin, Kanamycin, Streptomycin, Gentamicin, Carbenicillin, Erythromycin의 6가지 항생제에 대해 모두 내성을 가지고 있음을 알 수 있었다. 특이한 것은 이들 세균들은 단백질분해효소, 전분분해효소, 섬유소분해효소를 분비하지 않았다.
후속연구
따라서 사료는 오염되지 않도록 보관하면서 신선한 것을 가축에게 급여하는 것이 위생적 관점에서 바람직하다. 배합사료의 제조 직후나 농업부산물의 발생 시부터 유통 및 저장기간 동안 미생물의 발생에 대한 연구를 통하여 사료를 안전하게 관리하기 위한 기초 자료가 보다 필요할 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
사료의 오염을 일으키는 원인은?
사료의 오염은 가축들의 사료섭취량 저하, 소화 및 번식장애로 인한 가축의 생산성 저하를 일으킨다(Fink-Gremmels, 2008). 사료의 오염에는 농약, 중금속이나 기계 윤활유 등에 의한 화학적 오염, 금속과 유리조각에 의한 물리적 오염, 그리고 기생충이나 병원균, 바이러스, 곰팡이 등의 미생물에 의한 오염이 있다. 사료원료에는 유용 미생물과 유해 미생물이 모두 서식할 수 있다(Kim 등, 2014).
아플라톡신의 특징은?
현재 우리나라에서 규제하고 있는 사료 내 곰팡이 독소는 아플라톡신과 오크라톡신이다. 아플라톡신은 동물실험을 통해 발암성이 가장 강한 발암물질이자(Chawanthayatham 등, 2015) 돌연변이원이며(MoctezumaZarate 등, 2015), 1960년 영국에서 칠면조의 대량 폐사의 원인으로 밝혀진 적도 있다(Blount, 1961). 오크 라톡신은 신장과 간을 손상시키며 면역기능의 저하를 일으킨다(Hanif와 Muhammad, 2015).
곰팡이 독소 중 에스트로겐과 구조가 유사하여 가축의 번식 장애를 유발하는 독소는?
국내에서는 규제 대상이 아닌 T-2 독소는 과아미노산혈증(Hyperaminoacidemia)을 일으키고(Meloche와 Smith, 1995), 디옥시니발레놀(DON)은 구토를 일으키는 대표적인 곰팡이 독소이다(Chung 등, 1991). 제랄레논은 에스트 로겐과 구조적으로 유사하여 섭취한 가축에게 번식 장애를 유발한다(Smith, 1980). 또한 사료의 오염은 축산물의 품질에도 영향을 줄 수 있는데, 착유우가 아플라톡신 B1을 섭취하면 우유 중에 아플라톡신 M1의 형태로 분비된다(Iha 등, 2013).
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