[논문]뉴캣슬병 바이러스 검출 및 병원성 감별을 위한 Duplex RT-PCR법 개발

김지예; 이현정; 장일; 이희수; 윤성준; 박지성; 설재구; 김승환; 홍지무; 최강석

doi:10.5536/kjps.2017.44.2.93

[국내논문] 뉴캣슬병 바이러스 검출 및 병원성 감별을 위한 Duplex RT-PCR법 개발
Development of a Duplex RT-PCR Assay for the Simultaneous Detection and Discrimination of Avirulent and Virulent Newcastle Disease Virus (NDV) 원문보기

한국가금학회지 = Korean journal of poultry science, v.44 no.2, 2017년, pp.93 - 102

김지예 (농림축산검역본부 동물약품평가과) , 이현정 (농림축산검역본부 조류질병과) , 장일 (농림축산검역본부 조류질병과) , 이희수 (농림축산검역본부 조류질병과) , 윤성준 ((주)인트론바이오테크놀로지) , 박지성 ((주)인트론바이오테크놀로지) , 설재구 ((주)인트론바이오테크놀로지) , 김승환 ((주)인트론바이오테크놀로지) , 홍지무 ((주)인트론바이오테크놀로지) , (중국 동물보건역학센터) , (중국 동물보건역학센터) , 최강석 (농림축산검역본부 조류질병과)

초록
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본 연구에서 NDV의 L유전자와 F유전자를 표적 부위로 각각 제작한 primer 세트를 사용함으로써 하나의 PCR 튜브에서 NDV 검출(386 bp의 증폭 크기)과 함께 병원성 NDV(229 bp의 증폭 크기)를 동시에 감별 증폭할 수 있는 dRT-PCR 검사법을 개발하였다. 개발된 dRT-PCR검사법은 NDV를 특이적으로 검출하고, 병원성을 감별하였다. 특히 국내 병성감정 실시기관에서 적용 중인 기존의 RT-PCR 상용키트에서는 검출하지 못하는 class I NDV과 PPMV(class II 유전형 VI형)을 NDV를 검출함과 동시에 병원성 NDV도 감별가능하였다. 개발된 dRT-PCR 검사법의 검출 민감도는 약 $10^{3.0}EID_{50}/0.1mL$로 평가되었다. 또한 ND발생국의 야외 시료에 적용했을 때, NDV 공통항원 검출율은 94.4%였으며, 병원성 NDV 검출율은 100%이었다. 그러므로 본 연구에서 개발한 dRT-PCR 검사법은 의심축 사례에서 ND를 신속 정확하게 진단하는 데 유용할 진단 방법을 제공할 수 있을 것으로 판단된다.

Abstract ▼ AI-Helper

A duplex RT-PCR (dRT-PCR) assay was developed for the simultaneous detection and discrimination of non-virulent and virulent Newcastle disease virus (NDV) in a single PCR tube. Primers targeting the large polymerase protein (L) gene and the fusion protein (F) gene of NDV were designed to detect all NDVs (by common type PCR primers) and virulent NDVs (by pathotype PCR primers), respectively and evaluated experimentally with reference NDV strains and other poultry viral pathogens. PCR products of the expected size of 386 bp were amplified from all NDV samples whereas PCR products of the expected size of 229 bp were amplified from virulent NDV samples alone. Cross reaction was not observed with other avian viral pathogens. The detection limit of NDV by the dRT-PCR was estimated to be $10^3$ 50% egg infectious dose/0.1 mL. In the dRT-PCR using field isolates of NDV, the pathotype PCR primers detected specifically all of virulent field isolates of NDV from Malaysia, Pakistan and China whereas common type PCR primers detected 94.4% (51/54) of field isolates of NDV from China. Three Chinese NDV isolates with false negative result were non-virulent viruses. Our results indicate that the dRT-PCR might provide a rapid and simple tool for rapid simultaneous detection and discrimination of non-virulent and virulent NDVs. Therefore the developed dRT-PCR assay provides a powerful novel means for the rapid diagnosis of Newcastle disease.

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AI 본문요약
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문제 정의

현재 국내 병성감정 실시기관에서 적용하고 있는 RT-PCR 상용키트의 경우, NDV class II 유전형 VI형에 해당하는 병원성 NDV인 비둘기 파라믹소바이러스(pigeon paramyxovirus; PPMV)와 비병원성 class I NDV를 검출하지 못하는 한계가 있었다. 따라서 본 연구에서는 기존의 RT-PCR 상용키트의 한계를 극복하고, 단일 PCR 튜브에서 NDV 검출 및 병원성 감별을 동시에 수행할 수 있는 duplex RT-PCR(dRTPCR) 검사법을 개발하고, NDV 검출 민감도, 특이도 및 진단검사 유효성을 평가하였다.
현재 뉴캣슬병 발생국에서 분리된 NDV 양성시료를 대상으로 본 연구에서 개발한 dRT-PCR의 야외시료에 대한 검출효능을 조사하기 위하여 검사하였다. 효능 평가에 사용된 NDV 양성시료로 말레이시아 NDV 양성시료 14점, 파키스탄 NDV 양성시료 3점, 중국 NDV 양성시료 54점이 사용하였다.
본 연구의 dRT-PCR 검사법을 적용했을 때 사용한 PCR primers가 NDV 스트레인을 특이적으로 검출하는 지 여부를 조사하였다. 본 연구의 dRT-PCR법으로 조사한 결과, 4개의 다른 APMV 혈청형(APMV-4, APMV-6, APMV-9, APMV15)과 다른 가금 병원체 3종(APMV, H9N2 AIV, IBDV) 모두에서 PCR 특이 band(386 bp, 229 bp)가 관찰되지 않았다[Fig.
본 연구에서 개발한 dRT-PCR 검사법의 NDV 검출 가능 농도를 측정하였다. NDV 검출 한계를 측정하기 위하여 병원성 NDV Kr005/00 스트레인을 사용하였다.
본 연구에서 개발한 dRT-PCR 검사법이 실제 ND 발생국가에서 유행하는 NDV를 검출하고, 동시에 병원성을 감별할 수 있는 지 조사하였다. 이를 위하여 말레이시아 및 파키스탄에서 분리된 NDV 양성 시료를 사용하였다.
본 연구에서는 기존 유전자 진단법이 가지는 일부 한계점을 개선하고자 dRT-PCR법을 개발했다. 기존 유전자 진단법은 NDV 공통항원 검출과 병원성 감별 검사를 각각 별도로 검사하여 판정하도록 개발되었다(Creelan et al.

제안 방법

본 연구에서 합성한 PCR primer들을 각각 7 pM이 첨가하여 제작한 RT-PCR premix PCR tube(iNtRON biotechnology)에 DNase/RNase free water 18 µL 및 상기 추출 RNA 2 µL를 첨가하였다.
그 후 45℃, 30분간 반응시킨 후 94℃ 5분 반응시켰다. 그 후 94℃ 30초(denaturation)와 56℃ 1분(annealing 및 extension)을 1 사이클로 하여 40회 반복 실시하여 RT-PCR을 실시하였다. PCR 반응산물에 대하여 ethidium bromide가 포함된 1.
그 후 94℃ 30초(denaturation)와 56℃ 1분(annealing 및 extension)을 1 사이클로 하여 40회 반복 실시하여 RT-PCR을 실시하였다. PCR 반응산물에 대하여 ethidium bromide가 포함된 1.5% 아가로스 겔을 사용하여 전기영동을 실시하여 NDV 유전자 특이 밴드의 증폭 여부를 확인하였다.
본 연구에서 개발한 dRT-PCR을 사용하여 NDV 공통항원 검출과 병원성 NDV 감별 효능을 평가하였다. 이를 위하여 NDV 8종(비병원성 4종 및 병원성 4종)을 사용하였다.
본 연구에서 개발한 dRT-PCR의 특이성 평가를 위하여 다른 APMV 혈청형 4종(APMV-4, APMV-6, APMV-9, APMV-15)과 다른 가금병원체 3종(AIV, APMV, IBDV)을 사용하였다. 또한, 동일 시료에 대하여 현재 국내 병성감정실시기관에서 사용하고 있는 기존 RT-PCR 상용키트(iNtRON biotechnology)를 사용하여 제조사의 권장방법대로 검사를 실시하고, 그 결과를 dRT-PCR 검사 결과와 비교하였다.
1 mL당 10⁸ 50% egg infective dose(EID50)되게 바이러스 역가를 조정하여 사용하였다. NDV 바이러스 원액을 0.01M phosphate buffered saline(PBS, pH 7.4)로 10배씩 단계 희석한 바이러스액을 상기의 방법에 따라 duplex RTPCR을 실시하였다. 그 후 전기영동을 실시하여 NDV특이 유전자 증폭 여부를 확인하였다.
4)로 10배씩 단계 희석한 바이러스액을 상기의 방법에 따라 duplex RTPCR을 실시하였다. 그 후 전기영동을 실시하여 NDV특이 유전자 증폭 여부를 확인하였다.
NDV 공통항원 검출 및 병원성 감별을 동시에 수행하기 위한 dRT-PCR 검사법을 개발하기 위하여 Fig. 1에서 보는 바와 같이 2종의 primer 세트를 각각 제작하였다. NDV공통항원 검출용 common type primer 세트는 모든 NDV를 검출하기 위한 용도로 제작하였으며, NDV 스트레인 간 유전자 변동성이 적은 L유전자를 primer 합성 부위로 선정하였다.
1에서 보는 바와 같이 2종의 primer 세트를 각각 제작하였다. NDV공통항원 검출용 common type primer 세트는 모든 NDV를 검출하기 위한 용도로 제작하였으며, NDV 스트레인 간 유전자 변동성이 적은 L유전자를 primer 합성 부위로 선정하였다. 그 결과, NDV SF2 스트레인(accession no.
그 결과, NDV SF2 스트레인(accession no. KF30-6265) 기준 게놈의 4,883에서 4,901번째에 해당하는 F 유전자 염기서열(5‘- AGGAGACAGAAACGCT TTA-3')을 포함하는 forward primer를, 게놈의 5,085에서 5,106번째에 해당하는 F 유전자 염기서열(5‘-ACA AAC TGT TGC ATC TTC CCA A-3')을 포함하는 reverse primer를 합성하여 229 bp의 유전자가 증폭되도록 primer 세트를 제작하였다.
KF306265) 기준 게놈의 9,428에서 9,450번째에 해당하는 L 유전자 염기서열(5’-YCARGCAGCTGAGATGTTRTG)을 포함하는 forward primer를, 게놈의 9,794에서 9,811번째에 해당하는 L 유전자 염기서열(5‘-ACA TGT GCG ATT GCC TTG TC-3')을 reverse primer(5‘-ACATGTGCG ATTGCCTTGTC-3')를 합성하여 386bp의 유전자가 증폭되도록 primer set를 합성하였다. NDV 병원성 감별용 patho-type primer 세트는 비병원성 스트레인과 병원성 스트레인 간 유전적 차이가 존재하는 F유전자 분절 부위 유전자 염기서열을 포함하도록 primer 합성 부위로 선정하였다. 그 결과, NDV SF2 스트레인(accession no.
2는 dRT-PCR을 실시하기 위하여 합성한 NDV 공통항원 검출용 primerset와 병원성 NDV 감별용 primer set를 도식화하여 나타낸 것이다. 즉, 모든 NDV의 경우 L 유전자 표적 primer 세트에 의해 386 bp의 PCR 증폭산물이, 병원성 NDV는 386 bp의 PCR 산물과 함께 F유전자 표적 primer 세트에 의해 229 bp의 PCR 증폭산물도 검출되도록 dRT-PCR을 개발하였다.
본 연구에서 개발한 dRT-PCR 검사법으로 NDV 검출 및 병원성 감별이 가능한 지를 조사하고, 현재 국내 병성감정 실시기관에서 적용 중인 기존 RT-PCR 상용키트와 비교 평가하였다. Fig.
NDV 검출 한계를 측정하기 위하여 병원성 NDV Kr005/00 스트레인을 사용하였다. 바이러스 원액(10⁸EID₅₀/0.1 mL)을 10진 희석한 다음, 각 희석액을 대상으로 dRT-PCR검사법으로 NDV 유전자가 증폭되어 검출되는지 여부를 조사하였다. Fig.
한편, dRT-PCR 검사법이 야외 시료에서 다양한 유전형의 NDV를 검출하고, 병원성을 감별할 수 있는지를 평가하였다. 이를 위하여, 중국 CAHEC 뉴캣슬병 OIE reference laboratory에서 보유하고 있는 중국에서 분리된 총 54점의 NDV 양성시료를 사용하였다.
수의 분야에서 분자생물학적 기법이 질병진단에 광범위하게 적용되기 전에는 바이러스 분리 동정 후 병원성 분석 등을 통해 ND를 진단하였다. 이러한 방법은 수 주의 진단 기간이 소요되는 문제가 있었다.
본 연구에서 NDV의 L유전자와 F유전자를 표적 부위로 각각 제작한 primer 세트를 사용함으로써 하나의 PCR 튜브에서 NDV 검출(386 bp의 증폭 크기)과 함께 병원성 NDV(229 bp의 증폭 크기)를 동시에 감별 증폭할 수 있는 dRTPCR 검사법을 개발하였다. 개발된 dRT-PCR검사법은 NDV를 특이적으로 검출하고, 병원성을 감별하였다.

대상 데이터

본 연구에서 사용한 공시 바이러스는 Table 1에서 보는 바와 같다. NDV의 경우, 비병원성 6종(H1700, DK01/06, Ulster2C, NDRL0901, LaSota, VG/GA), 병원성 5종(Herts33, KJW/49, Kr005/00, KN3/2011, Pak/A-1/2016)을 사용하였다. 또한 다른 APMV 혈청형 4종(APMV-4, APMV-6,APMV-9, APMV15), H9N2 조류인플루엔자 바이러스(avian influenza virus;AIV), 전염성F낭병 바이러스(infectious bursal disease virus;IBDV), 조류메타뉴모 바이러스(Avian metapneumovirus; AMPV)도 사용하였다.
NDV의 경우, 비병원성 6종(H1700, DK01/06, Ulster2C, NDRL0901, LaSota, VG/GA), 병원성 5종(Herts33, KJW/49, Kr005/00, KN3/2011, Pak/A-1/2016)을 사용하였다. 또한 다른 APMV 혈청형 4종(APMV-4, APMV-6,APMV-9, APMV15), H9N2 조류인플루엔자 바이러스(avian influenza virus;AIV), 전염성F낭병 바이러스(infectious bursal disease virus;IBDV), 조류메타뉴모 바이러스(Avian metapneumovirus; AMPV)도 사용하였다. 이들 병원체는 농림축산검역본부 뉴캣슬병 OIE reference laboratory에서 보관하고 있는 바이러스들이다.
Table 2에서 보는 바와 같이, primer 세트를 제작하기 위하여 GenBank에 등재되어 있는 NDV 14개 스트레인과 다른 7개 APMV 혈청형의 각 대표 스트레인의 유전정보를 사용하였다. NDV의 경우, 비병원성 스트레인 7종과 병원성 스트레인 7종을 사용하였다.
Table 2에서 보는 바와 같이, primer 세트를 제작하기 위하여 GenBank에 등재되어 있는 NDV 14개 스트레인과 다른 7개 APMV 혈청형의 각 대표 스트레인의 유전정보를 사용하였다. NDV의 경우, 비병원성 스트레인 7종과 병원성 스트레인 7종을 사용하였다.
본 연구에서 개발한 dRT-PCR을 사용하여 NDV 공통항원 검출과 병원성 NDV 감별 효능을 평가하였다. 이를 위하여 NDV 8종(비병원성 4종 및 병원성 4종)을 사용하였다. 본 연구에서 개발한 dRT-PCR의 특이성 평가를 위하여 다른 APMV 혈청형 4종(APMV-4, APMV-6, APMV-9, APMV-15)과 다른 가금병원체 3종(AIV, APMV, IBDV)을 사용하였다.
이를 위하여 NDV 8종(비병원성 4종 및 병원성 4종)을 사용하였다. 본 연구에서 개발한 dRT-PCR의 특이성 평가를 위하여 다른 APMV 혈청형 4종(APMV-4, APMV-6, APMV-9, APMV-15)과 다른 가금병원체 3종(AIV, APMV, IBDV)을 사용하였다. 또한, 동일 시료에 대하여 현재 국내 병성감정실시기관에서 사용하고 있는 기존 RT-PCR 상용키트(iNtRON biotechnology)를 사용하여 제조사의 권장방법대로 검사를 실시하고, 그 결과를 dRT-PCR 검사 결과와 비교하였다.
개발된 dRT-PCR의 NDV 검출능력 한계를 측정하기 위하여, NDV Kr005/00 스트레인을 사용하였다. 실험에 사용된 바이러스 0.1 mL당 10⁸ 50% egg infective dose(EID50)되게 바이러스 역가를 조정하여 사용하였다. NDV 바이러스 원액을 0.
현재 뉴캣슬병 발생국에서 분리된 NDV 양성시료를 대상으로 본 연구에서 개발한 dRT-PCR의 야외시료에 대한 검출효능을 조사하기 위하여 검사하였다. 효능 평가에 사용된 NDV 양성시료로 말레이시아 NDV 양성시료 14점, 파키스탄 NDV 양성시료 3점, 중국 NDV 양성시료 54점이 사용하였다. 말레이시아 및 파키스탄 유래 NDV 양성시료는 대한민국 농림축산검역본부 뉴캣슬병 OIE reference laboratory에서 강독형 및 유전형을, 중국유래 NDV 양성시료는 중국 동물보건역학센터(China Animal Health and Epidemiology Center; CAHEC) 뉴캣슬병 OIE reference laboratory에서 병원성형, 유전형을 최종 진단한 것이다.
효능 평가에 사용된 NDV 양성시료로 말레이시아 NDV 양성시료 14점, 파키스탄 NDV 양성시료 3점, 중국 NDV 양성시료 54점이 사용하였다. 말레이시아 및 파키스탄 유래 NDV 양성시료는 대한민국 농림축산검역본부 뉴캣슬병 OIE reference laboratory에서 강독형 및 유전형을, 중국유래 NDV 양성시료는 중국 동물보건역학센터(China Animal Health and Epidemiology Center; CAHEC) 뉴캣슬병 OIE reference laboratory에서 병원성형, 유전형을 최종 진단한 것이다.
본 연구에서 개발한 dRT-PCR 검사법의 NDV 검출 가능 농도를 측정하였다. NDV 검출 한계를 측정하기 위하여 병원성 NDV Kr005/00 스트레인을 사용하였다. 바이러스 원액(10⁸EID₅₀/0.
본 연구에서 개발한 dRT-PCR 검사법이 실제 ND 발생국가에서 유행하는 NDV를 검출하고, 동시에 병원성을 감별할 수 있는 지 조사하였다. 이를 위하여 말레이시아 및 파키스탄에서 분리된 NDV 양성 시료를 사용하였다. 이들 야외 시료는 대한민국 농림축산검역본부 뉴캣슬병 OIE reference laboratory에서 모두 class II 유전형 VII형 NDV 양성으로 판정한 사례였다(data not shown).
한편, dRT-PCR 검사법이 야외 시료에서 다양한 유전형의 NDV를 검출하고, 병원성을 감별할 수 있는지를 평가하였다. 이를 위하여, 중국 CAHEC 뉴캣슬병 OIE reference laboratory에서 보유하고 있는 중국에서 분리된 총 54점의 NDV 양성시료를 사용하였다. Table 3에서 보는 바와 같이, NDV 양성 야외시료의 94.

이론/모형

바이러스 시료로부터 RNA 핵산 추출은 LiliF^TM PGS DNA/RNA Extraction Kit (iNtRON biotechnology, 대한민국)를 사용하여, 제조사 권장방법에 의거하여 실시하였다. 본 연구에서 합성한 PCR primer들을 각각 7 pM이 첨가하여 제작한 RT-PCR premix PCR tube(iNtRON biotechnology)에 DNase/RNase free water 18 µL 및 상기 추출 RNA 2 µL를 첨가하였다.

성능/효과

1) APMV: avian paramyxovirus, IBV: infectious bronchitis virus, IBDV: infectious bursal disease virus, AIV(H9N2): avian influenza virus (H9N2), AMPV: avian metapneumovirus, IBDV: infectious bursal disease virus.
그 결과, NDV SF2 스트레인(accession no. KF306265) 기준 게놈의 9,428에서 9,450번째에 해당하는 L 유전자 염기서열(5’-YCARGCAGCTGAGATGTTRTG)을 포함하는 forward primer를, 게놈의 9,794에서 9,811번째에 해당하는 L 유전자 염기서열(5‘-ACA TGT GCG ATT GCC TTG TC-3')을 reverse primer(5‘-ACATGTGCG ATTGCCTTGTC-3')를 합성하여 386bp의 유전자가 증폭되도록 primer set를 합성하였다.
본 연구에서 개발한 dRT-PCR 검사법으로 NDV 검출 및 병원성 감별이 가능한 지를 조사하고, 현재 국내 병성감정 실시기관에서 적용 중인 기존 RT-PCR 상용키트와 비교 평가하였다. Fig. 2(A)에서 보는 바와 같이, 본 연구의 dRT-PCR법을 실시하여 전기영동법으로 특이 유전자 증폭 여부를 검사했을 때 NDV의 유전형과 관계없이 NDV 스트레인 11종 모두 특이적인 PCR 증폭 band(386 bp)가 관찰되었다. 이 결과는 본 연구의 dRT-PCR법을 적용했을 때 common type PCR primers가 NDV 공통항원을 모두 검출할 수 있음을 나타낸다.
2(A)에서 보는 바와 같이, 본 연구의 dRT-PCR법을 실시하여 전기영동법으로 특이 유전자 증폭 여부를 검사했을 때 NDV의 유전형과 관계없이 NDV 스트레인 11종 모두 특이적인 PCR 증폭 band(386 bp)가 관찰되었다. 이 결과는 본 연구의 dRT-PCR법을 적용했을 때 common type PCR primers가 NDV 공통항원을 모두 검출할 수 있음을 나타낸다. 한편, 병원성 NDV를 특이적으로 증폭하여 병원성 NDV를 감별할 수 있는 지를 조사한 결과, NDV의 유전형과 관계없이 병원성 NDV스트레인 5종(Herts33, KJW/49, KN3/2011, Kr005/00, PAK/A-1/2016) 모두에서 229 bp의 유전자가 증폭되었다.
그러나 비병원성 NDV 스트레인 6종(H1700, DK01/06,Ulster2C, NDRL0901, LaSota, VG/GA)에서는 229 bp의 증폭산물이 관찰되지 않았다. 이 결과는 본 연구의 dRT-PCR법을 적용했을 때, patho-type PCR primers가 병원성 NDV스트레인을 감별만을 감별해 낼 수 있음을 나타낸다. 또한, 기존 RT-PCR상용키트의 경우, NDV 공통항원을 검출하는 common type primers(증폭 크기 379 bp)를 사용했을 때 검사한 NDV11종 중 class I에 해당하는 NDV 스트레인 2종(DK01/06, H1700)을 검출하지 못했다[Fig 2(B) left].
본 연구의 dRT-PCR 검사법을 적용했을 때 사용한 PCR primers가 NDV 스트레인을 특이적으로 검출하는 지 여부를 조사하였다. 본 연구의 dRT-PCR법으로 조사한 결과, 4개의 다른 APMV 혈청형(APMV-4, APMV-6, APMV-9, APMV15)과 다른 가금 병원체 3종(APMV, H9N2 AIV, IBDV) 모두에서 PCR 특이 band(386 bp, 229 bp)가 관찰되지 않았다[Fig. 3(A)]. 그러므로 우리의 결과는 dRT-PCR 검사법이 NDV만 특이적으로 검출하고, 동시에 병원성 여부를 감별할 수 있음을 말해 준다.
3(A)]. 그러므로 우리의 결과는 dRT-PCR 검사법이 NDV만 특이적으로 검출하고, 동시에 병원성 여부를 감별할 수 있음을 말해 준다. 또한, 기존 RT-PCR 상용키트의 경우, common type primers(증폭 크기 379 bp)를 사용했을 때 APMV15에 대하여 양성 band가 관찰되었다[Fig.
3(B) right]. 우리의 결과는 RT-PCR 상용키트가 APMV-15에 대하여 비특이 반응을 나타냄을 알 수 있었다.
병원성 NDV를 감별 검출하는 patho-type primers의 경우에도 바이러스 원액을 10^-5배 희석한 농도까지 NDV 유전자(229 bp)를 검출할 수 있었다. 따라서 본 연구에서 개발한 dRT-PCR 검사법에 의한 NDV 검출용 common type primer 및 병원성 NDV 검출용 patho-type primer 모두 NDV 검출 민감도는 약 10^3.0EID₅₀/0.1 mL로 평가되었다.
이들 야외 시료는 대한민국 농림축산검역본부 뉴캣슬병 OIE reference laboratory에서 모두 class II 유전형 VII형 NDV 양성으로 판정한 사례였다(data not shown). 말레이시아의 14개 ND 발생 양계농장유래 NDV양성시료의 경우, 모두 386 bp와 229bp의 NDV 유전자가 동시에 검출되었다(Fig. 5). 파키스탄 ND 발생양계농장 유래 2개 농장(P 및 A 농장) 유래 양성 시료에서도 dRT-PCR 검사법은 모두 386 bp와 229 bp의 NDV유전자를 동시에 검출하였다(Fig.
5). 파키스탄 ND 발생양계농장 유래 2개 농장(P 및 A 농장) 유래 양성 시료에서도 dRT-PCR 검사법은 모두 386 bp와 229 bp의 NDV유전자를 동시에 검출하였다(Fig. 5). 이 결과로 볼 때, 개발된 dRT-PCR 검사법이 아시아 ND 발생지역에서 유행하는 강독형 NDV를 효과적으로 진단할 수 있음을 말해준다.
5). 이 결과로 볼 때, 개발된 dRT-PCR 검사법이 아시아 ND 발생지역에서 유행하는 강독형 NDV를 효과적으로 진단할 수 있음을 말해준다.
이 중 NDV를 검출하지 못했던 3점의 양성시료는 비병원성(약독형 및 무독형) NDV에 속하는 야외시료로서, class I NDV 야외분리주 2점과 class II 유전형 II형 야외주 1점이었다. 한편, 강독형 NDV 야외시료(class II 유전형 VI형 및 VII형)의 경우 모두 386 bp 및 229 bp의 NDV 유전자가 검출되어 dRT-PCR 검사법에 의해서도 모두 병원성 NDV로 판정되었다.
이 경우, 유전자 진단검사 과정에서 검체 시료 간 교차 오염이 일어날 가능성을 증가시킨다. 그래서 본 연구에서 개발한 dRT-PCR법은 NDV 공통항원 검출과 병원성 감별을 하나의 PCR tube에서 동시에 실시하도록 하여, 검사과정의 용이성을 증가시키고, 시료의 교차오염 가능성을 최소화할 수 있도록 하였다.
, 2008). 본 연구에서도 NDV 게놈의 F유전자 부위 대신 L유전자를 공통항원 검출 표적 부위로 선정하여 평가한 결과, class I NDV 분리주와 class II 유전형 VI형(중국 PPMV 분리주)을효과적으로 검출할 수 있게 되어, NDV 검출 효능이 기존유전자 진단법에 비해 개선되었다. 그럼에도 불구하고, 중국 현지평가에서 class I 바이러스 일부(2/17)와 calss II 유전형 I 바이러스 일부(1/17)에서 NDV 공통항원을 검출하지 못했다.
그럼에도 불구하고, 중국 현지평가에서 class I 바이러스 일부(2/17)와 calss II 유전형 I 바이러스 일부(1/17)에서 NDV 공통항원을 검출하지 못했다. 이 결과는 dRT-PCR법에 적용된 common PCR primers가 유전자 염기서열 차이 발생으로 인하여 이들 바이러스의 L유전자 표적 부위를 인식하지 못하거나, 검사 시료 내 바이러스 함량이 검출한계 이하로 존재하여 검출하지 못했을 가능성 등으로 인해 발생한 것으로 판단된다. 만약 전자의 경우라면, 프라이머 염기서열을 보다 정교하게 설계하여 이러한 한계를 추가적으로 개선할 필요가 있다.
중요하게도, 본 연구의 dRT-PCR검사법은 중국, 말레이시아, 파키스탄 지역에서 유행하고 있는 병원성 NDV 분리주를 모두 감별 진단하였다. 특히 국내 사용 중인 유전자검사키트가 검출하지 못했던 PPMV 분리주(class II 유전형 VI형 중국 분리주)을 효과적으로 검출할 수 있게 된 점은 PPMV각 국내 유입될 경우 신속 진단하여 조기에 방역조치를 취하는 데 크게 기여할 것으로 판단된다.
본 연구에서 NDV의 L유전자와 F유전자를 표적 부위로 각각 제작한 primer 세트를 사용함으로써 하나의 PCR 튜브에서 NDV 검출(386 bp의 증폭 크기)과 함께 병원성 NDV(229 bp의 증폭 크기)를 동시에 감별 증폭할 수 있는 dRTPCR 검사법을 개발하였다. 개발된 dRT-PCR검사법은 NDV를 특이적으로 검출하고, 병원성을 감별하였다. 특히 국내 병성감정 실시기관에서 적용 중인 기존의 RT-PCR 상용키트에서는 검출하지 못하는 class I NDV과 PPMV(class II 유전형 VI형)을 NDV를 검출함과 동시에 병원성 NDV도 감별가능하였다.
특히 국내 병성감정 실시기관에서 적용 중인 기존의 RT-PCR 상용키트에서는 검출하지 못하는 class I NDV과 PPMV(class II 유전형 VI형)을 NDV를 검출함과 동시에 병원성 NDV도 감별가능하였다. 개발된 dRT-PCR 검사법의 검출 민감도는 약 10^3.0EID50/0.1 mL로 평가되었다. 또한 ND발생국의 야외 시료에 적용했을 때, NDV 공통항원 검출율은 94.
1 mL로 평가되었다. 또한 ND발생국의 야외 시료에 적용했을 때, NDV 공통항원 검출율은 94.4%였으며, 병원성 NDV 검출율은 100%이었다. 그러므로 본 연구에서 개발한 dRT-PCR 검사법은 의심축 사례에서 ND를 신속 정확하게 진단하는 데 유용할 진단 방법을 제공할 수 있을 것으로 판단된다.
이 결과는 본 연구의 dRT-PCR법을 적용했을 때 common type PCR primers가 NDV 공통항원을 모두 검출할 수 있음을 나타낸다. 한편, 병원성 NDV를 특이적으로 증폭하여 병원성 NDV를 감별할 수 있는 지를 조사한 결과, NDV의 유전형과 관계없이 병원성 NDV스트레인 5종(Herts33, KJW/49, KN3/2011, Kr005/00, PAK/A-1/2016) 모두에서 229 bp의 유전자가 증폭되었다. 그러나 비병원성 NDV 스트레인 6종(H1700, DK01/06,Ulster2C, NDRL0901, LaSota, VG/GA)에서는 229 bp의 증폭산물이 관찰되지 않았다.

후속연구

중요하게도, 본 연구의 dRT-PCR검사법은 중국, 말레이시아, 파키스탄 지역에서 유행하고 있는 병원성 NDV 분리주를 모두 감별 진단하였다. 특히 국내 사용 중인 유전자검사키트가 검출하지 못했던 PPMV 분리주(class II 유전형 VI형 중국 분리주)을 효과적으로 검출할 수 있게 된 점은 PPMV각 국내 유입될 경우 신속 진단하여 조기에 방역조치를 취하는 데 크게 기여할 것으로 판단된다.
4%였으며, 병원성 NDV 검출율은 100%이었다. 그러므로 본 연구에서 개발한 dRT-PCR 검사법은 의심축 사례에서 ND를 신속 정확하게 진단하는 데 유용할 진단 방법을 제공할 수 있을 것으로 판단된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	뉴캣슬병이란 무엇인가?	뉴캣슬병(Newcastle disease; ND)은 전 세계 대부분 지역(특히 아시아와 아프리카)에서 발생하는 닭의 악성 전염병으로, 양계산업에 막대한 피해를 입히고 있다. ND가 발생한 양계농장의 경우, 감염 닭 대부분은 특별한 증상 없이 급사하는 지만, 일부 개체에서는 호흡기 증상(콧물, 기침 등)과소화기 증상(녹색 설사 등)을 보이며, 회복된 개체에서는 사경(torticolis) 등 특징적인 신경 증상이 관찰된다.
	뉴캣슬병이 발생한 양계농장에서 관찰되는 것은 무엇인가?	뉴캣슬병(Newcastle disease; ND)은 전 세계 대부분 지역(특히 아시아와 아프리카)에서 발생하는 닭의 악성 전염병으로, 양계산업에 막대한 피해를 입히고 있다. ND가 발생한 양계농장의 경우, 감염 닭 대부분은 특별한 증상 없이 급사하는 지만, 일부 개체에서는 호흡기 증상(콧물, 기침 등)과소화기 증상(녹색 설사 등)을 보이며, 회복된 개체에서는 사경(torticolis) 등 특징적인 신경 증상이 관찰된다. 또한 산란 중인 산란계 및 종계의 경우, 산란율 급감 또는 산란중지, 이상란 발생 등 임상증상이 관찰된다.
	NDV의 병원성을 측정하는 고전적인 방법은 무엇이 있는가?	, 2011). NDV의 병원성을 측정하는 고전적인 방법으로는 계태아 평균 치사시간(mean death time; MDT), 1일령 SPF 병아리에서의 뇌 내 병원성지수(intracerebral pathogencity index; ICPI), 6주령 SPF 닭에서의 정맥 내 병원성지수(intravenous pathogenicity index; IVPI) 등이 있다. 분자생물학적 방법으로 NDV의 F단백질 분절부위(112번부터 117번 아미노산 부위) 아미노산 서열 분석법이 있다.

참고문헌 (27)

Aldous EW, Collins MS, McGoldrick A, Alexander DJ 2001 Rapid pathotyping of Newcastle disease virus (NDV) using fluorogenic probes in a PCR assay. Vet Microbiol 80(3):201-212.

상세보기
Antal M, Farkas T, German P, Belak S, Kiss I 2007 Realtime reverse transcription-polymerase chain reaction detection of Newcastle disease virus using light upon extension fluorogenic primers. J Vet Diagn Invest 19(4):400-404.

상세보기
Cattoli G, Susta L, Terregino C, Brown C 2011 Newcastle disease: A review of field recognition and current methods of laboratory detection. J Vet Diagn Invest 23(4):637-656.

상세보기
Creelan JL, Graham DA, McCullough SJ 2002 Detection and differentiation of pathogenicity of avian paramyxovirus serotype 1 from field cases using one-step reverse transcriptase-polymerase chain reaction. Avian Pathol 31(5):493-499.

상세보기
Diel DG, da Silva LH, Liu H, Wang Z, Miller PJ, Afonso CL 2012 Genetic diversity of avian paramyxovirus type 1: Proposal for a unified nomenclature and classification system of Newcastle disease virus genotypes. Infect Genet Evol 12(8):1770-1779.

상세보기
Farkas T, Antal M, Sami L, German P, Kecskemeti S, Kardos G, Belak S, Kiss I 2007 Rapid and simultaneous detection of avian influenza and newcastle disease viruses by duplex polymerase chain reaction assay. Zoonoses Public Health 54(1):38-43.

상세보기
Fuller CM, Brodd L, Irvine RM, Alexander DJ, Aldous EW 2010 Development of an L gene real-time reverse-transcription PCR assay for the detection of avian paramyxovirus type 1 RNA in clinical samples. Arch Virol 155(6):817-823.

상세보기
Fuller CM, Collins MS, Alexander DJ 2009 Development of a real-time reverse-transcription PCR for the detection and simultaneous pathotyping of Newcastle disease virus isolates using a novel probe. Arch Virol 154:929-937.

상세보기
Hines NL, Miller CL 2012 Avian paramyxovirus serotype-1: A review of disease distribution, clinical symptoms, and laboratory diagnostics. Vet Med Int. 2012:708216.

상세보기
Hines NL, Killian ML, Pedersen JC, Reising MM, Mosos NA, Mathieu-Benson C, Miller CL 2012 An rRT-PCR assay to detect the matrix gene of a broad range of avian paramyxovirus serotype-1 strains. Avian Dis 56(2):387-395.

상세보기
Kim LM, King DJ, Curry PE, Suarez DL, Swayne DE, Stallknecht DE, Slemons RD, Pedersen JC, Senne DA, Winker K, Afonso CL 2007 Phylogenetic diversity among low-virulence newcastle disease viruses from waterfowl and shorebirds and comparison of genotype distributions to those of poultry-origin isolates. J Virol 81(22):12641-12653.

상세보기
Kwon HJ, Cho SH, Kim SJ 2006 Molecular differentiation of Korean Newcastle disease virus (NDV) by restriction enzyme analysis and pathotype-specific RT-PCR. Korean J Vet Res 46(4):371-379.
Lee HJ, Kim JY, Lee YJ, Lee EK, Song BM, Lee HS. Choi KS 2017 A novel avian paramyxovirus (putative serotype 15) isolated from wild birds. Front Microbiol. In press.
Liu X, Wang X, Wu S, Hu S, Peng Y, Xue F, Liu X 2009 Surveillance for avirulent Newcastle disease viruses in domestic ducks (Anas platyrhynchos and Cairina moschata) at live bird markets in Eastern China and characterization of the viruses isolated. Avian Pathol 38(5):377-391.

상세보기
Malik YS, Patnayak DP, Goyal SM 2004 Detection of three avian respiratory viruses by single-tube multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction assay. J Vet Diagn Invest 16(3):244-248.

상세보기
Mayo MA 2002 Virus taxonomy-Houston. Arch Virol 147:1071-1076.

상세보기
Mia Kim L, Suarez DL, Afonso CL 2008 Detection of a broad range of class I and II Newcastle disease viruses using a multiplex real-time reverse transcription polymerase chain reaction assay. J Vet Diagn Invest 20(4):414-425.

상세보기
Miller PJ, Haddas R, Simanov L, Lublin A, Rehmani SF, Wajid A, Bibi T, Khan TA, Yaqub T, Setiyaningsih S, Afonso CL 2015 Identification of new sub-genotypes of virulent Newcastle disease virus with potential panzootic features. Infect Genet Evol 29:216-229.

상세보기
Miller PJ, Decanini EL, Afonso CL 2009 Newcastle disease: evolution of genotypes and the related diagnostic challenges. Infect Genet Evol 10(1):26-35.
Miller PJ, Kim LM, Ip HS, Afonso CL 2009 Evolutionary dynamics of Newcastle disease virus. Virology 391(1):64-72.

상세보기
Pham HM, Konnai S, Usui T, Chang KS, Murata S, Mase M, Ohashi K, Onuma M 2005 Rapid detection and differentiation of Newcastle disease virus by real-time PCR with melting-curve analysis. Arch Virol 150(12):2429-2438.

상세보기
Seal BS, King DJ, Bennett JD 1995 Characterization of Newcastle-disease virus isolates by reverse transcription PCR coupled to direct nucleotide sequencing and development of sequence database for pathotype prediction and molecular epidemiologic analysis. J Clin Microbiol 33:2624-2630.
Tang Q, Wang J, Bao J, Sun H, Sun Y, Liu J, Pu J 2012 A multiplex RT-PCR assay for detection and differentiation of avian H3, H5, and H9 subtype influenza viruses and Newcastle disease viruses. J Virol Methods 181(2):164-169.

상세보기
Tiwari AK, Kataria RS, Nanthakumar T, Dash BB, Desai G 2004 Differential detection of Newcastle disease virus strains by degenerate primers based RT-PCR. Comp Immunol Microbiol Infect Dis 27(3):163-169.

상세보기
Yu XH, Cheng JL, Xue J, Jin JH, Song Y, Zhao J, Zhang GZ 2017 Roles of the polymerase-associated protein genes in newcastle disease virus virulence. Front Microbiol 8:161.
Zhang L, Pan Z, Geng S, Chen X, Hu S, Liu H, Wu Y, Jiao X, Liu X 2010 Sensitive, semi-nested RT-PCR amplification of fusion gene sequences for the rapid detection and differentiation of Newcastle disease virus. Res Vet Sci 89(2):282-289.

상세보기
Zhu J, Xu H, Liu J, Zhao Z, Hu S, Wang X, Liu X 2014 Surveillance of avirulent Newcastle disease viruses at live bird markets in Eastern China during 2008-2012 reveals a new sub-genotype of class I virus. Virol J 11:211.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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