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문제 정의
- 먹물버섯 류의 대표인 먹물버섯(Coprinus comatus)은 말의 분변, 두엄 그리고 낙엽에서 잘 자라며 리그닌 분해 효소군을 생성한다. 2013년 9월에 강원도 춘천 근교에서 C. comatus 균주 하나를 분리하였고 이 균주가 생성하는 laccase의 생화학적 특성과 정제된 효소에 의한 두 가지 염료의 탈색에 대하여 보고한다.
제안 방법
- 이 균으로부터 laccase를 정제하기 위하여 potato dextrose broth (Difco), yeast extract malt extract glucose 배지(yeast extract 4 g, malt extract 10 g, glucose 4 g, 1 L d-H2O), yeast extract peptone dextrose (YEPD) 배지(yeast extract 10 g, peptone 20 g, dextrose 20 g, 1 L d-H2O) 등의 액체배지에 접종하고 25°C에서 진탕배양 하면서 효소의 활성을 비교하였다.
- 리그닌 분해효소의 존재유무를 빠르게 확인할 때 자주 사용하는 RBBR (300 μM)과 polymeric 염료인 Poly-R 478 (0.01%) 190 μl에 효소 10 μl (10 u)을 더하고 25°C에서 배양하고 색깔의 변화를 600 nm와 400 nm에서 분석하였다.
- 효소활성의 최적 pH는 25°C에서 pH 3~6 (0.1 M citratephosphate buffer)와 pH 6~8 (0.1 M phosphate buffer)에서 분석하였고, 최적온도는 pH 4.3 에서 10~40°C 범위에서 분석하였다.
- 가장 높은 효소활성을 보인 YEPD 배지(300 ml, 1 L baffled flask)에서 3일 동안 진탕배양하고 원심분리(7,500 × g)와 여과과정을 거쳐 배양액(900 ml)을 수확하였다.
- 5 M NaCl gradient 용액으로 단백질을 용출하였다. 활성을 보인 분획을 ultrafiltration (pore size 10 kDa) 방법으로 농축하여 10% native gel로 만든 preparative gel electrophoresis(Prep Cell, Bio-Rad)에서 10 ml/h 속도로 단백질을 분리･정제하였다(Kim et al., 2008). Laccase 효소활성은 o-tolidine을 발색기질로 사용하여 측정하였고(Ko et al.
- , 2008). Laccase 효소활성은 o-tolidine을 발색기질로 사용하여 측정하였고(Ko et al., 2001) 효소단백질의 분자량은 10% SDS-PAGE를 사용하여 측정하였다(Laemmli, 1970). 효소활성의 최적 pH는 25°C에서 pH 3~6 (0.
- 3 에서 10~40°C 범위에서 분석하였다. 기질 o-tolidine에 대한 Km 값과 Vmax 값은 0.2~1.0 mM범위에서 초기반응속도를 측정하여 분석하였다. 모든 생화학적 특성분석 실험은 3개씩 동시에 진행하여 평균값을 구하였다.
- 먹물버섯 Coprinus comatus를 yeast extract peptone dextrose 액체배지에서 배양하고 laccase의 생성･분비를 확인하였다. 이 때 분비된 laccase를 이온교환수지 방법과 전기영동 분획 수집방법으로 순수하게 정제하였다.
- 정제된 laccase 10 U을 RBBR (300 μM)과 Poly-R 478 (0.01%) 190 μl에 각각 더하고 25°C에서 12시간 동안 탈색을 확인하였다.
- Laccase를 포함하여 리그닌 분해효소 활성을 빠르게 비교하는 목적으로 RBBR과 Pol-R 478의 탈색능을 분석하였다. 정제된 laccase 10 U을 RBBR (300 μM)과 Poly-R 478 (0.
대상 데이터
- 실험에 사용된 균주인 C. comatus는 2013년 9월 춘천 근교에서 분리하여 potato dextrose agar (Difco)에서 배양하고 보관하였다. 이 균으로부터 laccase를 정제하기 위하여 potato dextrose broth (Difco), yeast extract malt extract glucose 배지(yeast extract 4 g, malt extract 10 g, glucose 4 g, 1 L d-H2O), yeast extract peptone dextrose (YEPD) 배지(yeast extract 10 g, peptone 20 g, dextrose 20 g, 1 L d-H2O) 등의 액체배지에 접종하고 25°C에서 진탕배양 하면서 효소의 활성을 비교하였다.
데이터처리
- 0 mM범위에서 초기반응속도를 측정하여 분석하였다. 모든 생화학적 특성분석 실험은 3개씩 동시에 진행하여 평균값을 구하였다.
성능/효과
- C. comatus laccase cDNA를 Pichia pastoris에서 발현한 효소는 기질 2,6-dimethylphenol에서 pH 5.5, 70°C에서 최적활성을 보였고, 기질 syringaldazine에서 pH 6.0, 50°C에서 최적 활성을 보인 것과 크게 다르다(Bao et al., 2013).
- 최적 산도는 pH4.3이었으며(Fig. 2A), 최적 온도는 25°C로 확인되었다(Fig.2B).
- 여러 가지 액체배지에서 C. comatus를 진탕배양하고 laccase 활성을 비교한 결과 YEPD 배지에서 가장 높은 활성을 보였다(결과 미제시).
- 정제된 laccase 단백질의 분자량은 SDS-PAGE에서 약 67 kDa으로 추정(Fig. 1)되며, 동일 종에서 낮은 질소원 + 높은 탄소원(low nitrogen-high carbon: LNHC) 배양조건에서 생성되는 분자량 70 kDa의 laccase (Jiang et al., 2013)와 아교버섯 laccase의 분자량(75 kDa: Kim et al., 2008) 및 겨울우산버섯 laccase의 분자량(70 kDa: Kim et al., 2012) 보다 작은 것으로 확인되었다. 그러나 먹물버섯 류의 한 종인 두엄먹물버섯 Coprinellus congregatus가 생성･분비하는 산성 laccase의 분자량(60.
- 정제된 효소단백질의 분자량은 SDS-PAGE로 분석하였을 때 약 67 kDa으로 나타났고 최적산도는 pH 4.3, 최적온도는 25°C로 확인되었다.
- 0132 OD/min/unit로 나타났다. 정제된 laccase를 사용하여 염료 RBBR과 Poly R-478의 탈색을 분석한 결과 배양 12시간 후에 RBBR은 49.3% 탈색되었고 poly R-478은 41.6% 탈색되었다.
- 01%) 190 μl에 각각 더하고 25°C에서 12시간 동안 탈색을 확인하였다. RBBR은 49.3% 수준의 탈색을 보였고, Poly-R 478은 약 41.6% 수준의 탈색을 보였다(Fig. 3). C.
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