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문제 정의
- 본 연구에서는 가짜 식품 유통 근절을 위해 형태학적으로 구별이 어려운 참조기(L. polyactis) 와 형태학적 유사 어종인 부세, 흑조기, 긴가이석태의 정확한 분류 기술의 확립하고자, 국제생물바코드컨소시엄(Consortium for the Barcode of Life)에서 제안된 종 판별 바코드 영역인 미토콘드리아 DNA염기서열의 cytochrome coxidase I (COI) 유전자 영역에서종 특이 primer를 설계하여 한번의 PCR 반응으로 4종에 대한 다중 판별이 가능한 MSS-PCR 조건을 확립하고자 하였다[27].
- 본 연구에서는 참조기와 유사 어종인 부세, 흑조기, 그리고 긴가이석태를 대상으로 미토콘드리아 DNA의 COI 유전자 영역을 분석하였고, 종 특이적 primer를 제작하여 참조기류의 종판별을 위한 MSS-PCR 분석법을 개발하였다. 분석에 사용된 primer는 각 종별 PCR 산물의 크기를 최대한 고려하여 제작하였기 때문에 아가로스 겔 전기영동으로 명확하게 판별이 가능하며, 차후 종판별 문제를 야기시키는 유사 어종에 대한 추가적인 적용에 용이할 것이다.
제안 방법
- MSS-PCR 분석 감도 검사를 위해 어류 4종의 DNA를 10 ng/μl, 1 ng/μl, 0.1 ng/μl, 그리고 0.01 ng/μl 으로 정량하여 실험하였다.
- MSS-PCR 증폭을 위한 primer mixture로는 4개의 종 특이 forward primer와, 1개의 Sci-R reverse primer를 사용하였다.반응액의 조성은 genomic DNA 0.
- PCR cycling의 조건은 94°C에서 7분 동안 pre-denaturation 후 94°C에서 30초간 denaturation, 52°C에서 30초간 annealing 및 72°C에서 1분간 extension의 조건으로 35cycle을진행하였고 최종적으로 72°C에서 7분 동안 final extension을수행하였다.
- PCR 증폭을 위한 반응액 조성은 각시료에서 추출한 genomic DNA 1 μl, 10x Ex Taq buffer 2μl, 2.5 mM dNTP mixture 1.6 μl, 10 pmol forward primer 1 μl, 10 pmol reverse primer 1 μl, Ex Taq polymerase (Takara, Japan) 5 unit으로 총 20 μl로, PCR 반응은 ABI verity fast thermal cyclers (Applied Biosystems, USA)를 사용하였다.
- 참조기(Lp-F/Sci-R)의 경우 46~62℃에서, 부세(Lc-F/Sci-R)는 46~66℃, 흑조기(An-F/ Sci-R)는 50~66℃, 그리고 긴가이석태(Pe-F/Sci-R)는 46~66°C에서 종 특이적 증폭 반응이 일어났다. 따라서, 모든 primer가종 특이적 결합을 나타내는 온도인 50~62℃ 중 56℃를 MSSPCR을 위한 적정 온도로 설정하였다.
- 미토콘드리아 DNA의 COI 유전자 내의 종간·종내 변이 및보존된 영역을 확인하기 위하여 NCBI GenBank에 등록된 민어과에 속하는 참조기(L. polyactis, GU586227), 부세(L. crocea, EU339149), 민어(Miichthys miiuy, HM447240), 홍민어(Sciaenops ocellatus, NC016867)의 미토콘드리아 DNA 완전유전체 정보를 Bioedit program (http://mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html)을 이용하여 정렬하였다.
- 반응액의 조성은 genomic DNA 0.5 μl, 10x Ex Taq buffer 1 μl, 2,5 mM dNTP mixture 0.8 μl, 10 pmol forward primer mixture 1 μl, reverse primer 0.5 μl, Ex Taq polymerase (Takara, Japan) 2.5 unit으로 총 10 μl로, PCR 반응은 ABI verity fast thermal (Applied Biosystems, USA)를 사용하였다.
- 참조기, 흑조기, 부세, 그리고 긴가이석태 시료는 국립수산 과학원 수산생명자원 수장고에 보존 되어 있는 표준시료 각 16개체를 사용하였다(Table 1). 시료로부터 genomic DNA는 magnetic bead 방식의 MagExtractor genome DNA purification Kit (Toyobo, Japan)와 자동 핵산 추출 장비인 MFX-6100(Toyobo, Japan)를 사용하여 추출하였다. 추출을 위한 시료 전 처리는 근육조직 20 mg을 1.
- 염기서열분석으로 통해 얻어진 민어과 4종에 대한 양방향 서열은 SeqMan program (DNASTAR Inc, USA)을 사용하여 각각 assemble하였으며, 최종적으로 1,410 bp의 염기서열을 분석하였다. 얻어진 COI 영역 염기서열은 point mutation에 의해 나타나는 종내 변이 유전자를 제외하고, 종간 특이성을 나타내는 SNP (single nucleotide polymorphism) 유전자를 탐색하였다. 종 특이 primer는 전기영동 분석 시 각종에 대한PCR 산물의 크기에 따른 종 구별을 명확히 하기 위해, PCR 산물의 크기를 고려하여 SNP 유전자를 선택하였다(Fig.
- 염기서열분석으로 통해 얻어진 민어과 4종에 대한 양방향 서열은 SeqMan program (DNASTAR Inc, USA)을 사용하여 각각 assemble하였으며, 최종적으로 1,410 bp의 염기서열을 분석하였다. 얻어진 COI 영역 염기서열은 point mutation에 의해 나타나는 종내 변이 유전자를 제외하고, 종간 특이성을 나타내는 SNP (single nucleotide polymorphism) 유전자를 탐색하였다.
- 이후 보전적인 유전자를 기준으로 이들 어종의 COI 유전자를 증폭할 수 있는 특이 forward primer (Sci-F, 5’-GCCTACTTCTTCAGATTTGCAA-3') 와 reverse primer (Sci-R, 5’-AAGTGGCAGAGCGGTTATG-3’)를 제작하였다(Fig. 1).
- PCR cycling은 전술한 바와 동일하나, annealing 온도 조건을 56℃로 진행하였다. 이후 증폭된 PCR 산물은 1% agarose gel 에서 30분 동안 전기영동을 이용하여 분리하였으며, 1x redsafe (iNtRON, Korea)로 염색하여 Gel Doc image analysis system (ATTO corporation, Japan)으로 확인하였다.
- 제작된 종 특이 forward primer는 gradient PCR을 통해 교차반응 여부 검사를 진행하였다. 참조기(Lp-F/Sci-R)의 경우 46~62℃에서, 부세(Lc-F/Sci-R)는 46~66℃, 흑조기(An-F/ Sci-R)는 50~66℃, 그리고 긴가이석태(Pe-F/Sci-R)는 46~66°C에서 종 특이적 증폭 반응이 일어났다.
- 얻어진 COI 영역 염기서열은 point mutation에 의해 나타나는 종내 변이 유전자를 제외하고, 종간 특이성을 나타내는 SNP (single nucleotide polymorphism) 유전자를 탐색하였다. 종 특이 primer는 전기영동 분석 시 각종에 대한PCR 산물의 크기에 따른 종 구별을 명확히 하기 위해, PCR 산물의 크기를 고려하여 SNP 유전자를 선택하였다(Fig. 2). 종 특이 primer의 제작은 SNP 유전자가 3’ 말단에 위치하도록 하여 서로 다른 4개의 forward primer를 제작하였으며, 제작된 종 특이 forward primer는 서로 비슷한 Tm값을 가지며 30% 이상의 GC 비율과 self-dimer을 고려하여 제작 하였다 (Table 2).
- 종 특이 primer의 제작은 SNP 유전자가 3’ 말단에 위치하도록 하여 서로 다른 4개의 forward primer를 제작하였으며, 제작된 종 특이 forward primer는 서로 비슷한 Tm값을 가지며 30% 이상의 GC 비율과 self-dimer을 고려하여 제작 하였다 (Table 2).
- PCR cycling의 조건은 94°C에서 7분 동안 pre-denaturation 후 94°C에서 30초간 denaturation, 52°C에서 30초간 annealing 및 72°C에서 1분간 extension의 조건으로 35cycle을진행하였고 최종적으로 72°C에서 7분 동안 final extension을수행하였다. 증폭된 PCR 산물은 자동염기서열 분석기인 ABI 3730XL (Applied Biosystems, USA)를 이용하여 분석을 진행 하였다.
대상 데이터
- Identificaiton of species by multiplex PCR using species specific primers. The order of the samples is as follows:lane 1, Template mixture; lane 2, L. polyactis; lane 3, A.nibe; lane 4, L. crocea; lane 5, P. elogatus; lane M, 100 bp ladder (iNtRON, South Korea).
- 참조기, 흑조기, 부세, 그리고 긴가이석태 시료는 국립수산 과학원 수산생명자원 수장고에 보존 되어 있는 표준시료 각 16개체를 사용하였다(Table 1). 시료로부터 genomic DNA는 magnetic bead 방식의 MagExtractor genome DNA purification Kit (Toyobo, Japan)와 자동 핵산 추출 장비인 MFX-6100(Toyobo, Japan)를 사용하여 추출하였다.
성능/효과
- 동일한 양의 forward primer를 넣은 MSS-PCR 산물을 아가로스 겔 전기영동을 통해 확인한 결과 각각의 종은 선명한 DNA 증폭을 나타냈으며, 증폭된 산물의 크기에 따라 참조기는 약 1,500 bp, 흑조기는 약 1,000 bp, 부세는 약 470 bp, 그리고 긴가이석태는 약 180 bp의 크기로 명확하게 판별이 가능하 였다. Primer dimer 및 비-특이적인 산물의 증폭은 일어나지 않았으며, 4종의 DNA 혼합물에서도 교차반응 없이 종 특이적인 증폭이 확인 되었다(Fig. 3).
- 각 종별 PCR 분석 감도는 4종 모두에서 0.1 ng/μl 의 DNA 농도까지 검출이 가능하였다(Fig. 4).
- 동일한 양의 forward primer를 넣은 MSS-PCR 산물을 아가로스 겔 전기영동을 통해 확인한 결과 각각의 종은 선명한 DNA 증폭을 나타냈으며, 증폭된 산물의 크기에 따라 참조기는 약 1,500 bp, 흑조기는 약 1,000 bp, 부세는 약 470 bp, 그리고 긴가이석태는 약 180 bp의 크기로 명확하게 판별이 가능하 였다. Primer dimer 및 비-특이적인 산물의 증폭은 일어나지 않았으며, 4종의 DNA 혼합물에서도 교차반응 없이 종 특이적인 증폭이 확인 되었다(Fig.
- 염기서열분석을 통해 얻어진 1,410 bp를 DNA Sequence Polymorphism (DnaSP, ver. 5.10.01) 프로그램을 사용하여 분석한 결과 각 16개체의 시료에서 참조기와 부세는 각각 2개의 haplotype이 나타났으며, 흑조기와 긴가이석태는 각각 동일한 haplotype이 나타났다. 종내 유전적 변이를 제외하고, 종특이성을 나타내는 SNP 유전자는 참조기 79개, 부세 62개, 흑조기 63개, 그리고 긴가이석태 97개로 확인되었다(Fig.
- 01) 프로그램을 사용하여 분석한 결과 각 16개체의 시료에서 참조기와 부세는 각각 2개의 haplotype이 나타났으며, 흑조기와 긴가이석태는 각각 동일한 haplotype이 나타났다. 종내 유전적 변이를 제외하고, 종특이성을 나타내는 SNP 유전자는 참조기 79개, 부세 62개, 흑조기 63개, 그리고 긴가이석태 97개로 확인되었다(Fig. 2).
후속연구
- 분석에 사용된 primer는 각 종별 PCR 산물의 크기를 최대한 고려하여 제작하였기 때문에 아가로스 겔 전기영동으로 명확하게 판별이 가능하며, 차후 종판별 문제를 야기시키는 유사 어종에 대한 추가적인 적용에 용이할 것이다. 또한, 개발된 분석법은 수산물의 안전성 확보 및 유통질서 확립과 소비자 보호를 위해 유용하게 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
- 본 연구에서는 참조기와 유사 어종인 부세, 흑조기, 그리고 긴가이석태를 대상으로 미토콘드리아 DNA의 COI 유전자 영역을 분석하였고, 종 특이적 primer를 제작하여 참조기류의 종판별을 위한 MSS-PCR 분석법을 개발하였다. 분석에 사용된 primer는 각 종별 PCR 산물의 크기를 최대한 고려하여 제작하였기 때문에 아가로스 겔 전기영동으로 명확하게 판별이 가능하며, 차후 종판별 문제를 야기시키는 유사 어종에 대한 추가적인 적용에 용이할 것이다. 또한, 개발된 분석법은 수산물의 안전성 확보 및 유통질서 확립과 소비자 보호를 위해 유용하게 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
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