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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 발아기간에 따른 유리형 및 결합형의 폴리페놀, 플라보노이드, 페놀산 및 안토시아닌의 변화를 조사함으로써 발아에 의해 팥의 기능성분이 증대한 요인에 대해 구명하여 발아 팥으로부터 기능성 식품소재 개발을 위한 기초자료를 제공하고자 하였다.
- 본 연구에서는 발아에 의한 팥의 기능성분 변화를 살펴보기 위하여 6일 동안 발아시키면서 유리형 및 결합형 폴리페놀, 플라보노이드, 페놀산 및 안토시아닌의 변화를 분석하였다. 유리형 폴리페놀 및 플라보노이드 함량은 발아기간이 증가함에 따라 각각 약 2.
제안 방법
- 45 μm syringe filter(Millipore)로 여과하여 유리형 분석 시료로 사용하였다. 또한, 발아 팥의 결합형 안토시아닌은 Macz-Pop 등(21) 및 Giusti와 Wrolstad(22)의 방법을 변형하여 추출하였다. 이 방법은 안토시아닌의 flavylium 이온 구조에 영향을 미치지 않으면서 o-glysoside 결합을 가수분해하는 방법으로 안토시아닌의 aglycone 분자를 유리화한다.
- 45 μm syringe filter(Millipore, Billerica, MA, USA)로 여과하여 유리형 분석시료로 사용하였다. 또한, 발아 팥의 결합형 페놀화합물은 Zielinski 등(18)의 방법을 변형하여 추출하였다. 유리형 페놀화합물을 추출한 후 여과한 잔여물에 4 M 수산화나트륨을 가한 후 90분 동안 초음파 처리하여 알칼리 가수분해 하였으며, 알칼리 가수분해물은 4 M HCl을 이용하여 pH 2로 조정한 후 2,200×g에서 원심분리한 상등액에 diethyl ether : ethyl acetate(1:1) 혼합액을 이용하여 페놀 화합물을 분리 용출하였다.
- 발아 팥의 유리형 안토시아닌은 Macz-Pop 등(21)의 방법을 변형하여 추출하였다. 일정량의 시료에 0.
- 발아온도는 25°C, 습도는 90%를 유지하면서 발아시켰고, 1일 3회씩 10분간 물주기를 하면서 발아시켰다. 발아기간은 1일에서 6일로 하였고, 발아시키지 않은 팥을 대조구로 하였다. 팥 및 발아 팥은 동결건조기(Freeze dryer, FD5508, Ilshin Lab Co.
- 발아온도는 25°C, 습도는 90%를 유지하면서 발아시켰고, 1일 3회씩 10분간 물주기를 하면서 발아시켰다.
- 분리 용출하여 얻어진 유리형 및 결합형 페놀화합물은 HPLC용 메탄올에 용해한 다음 0.45 μm syringe filter(Millipore)로 여과하여 HPLC(ACME 9000 system, Younglin, Anyang, Korea)로 분석하였다.
- 유리형 페놀화합물을 추출한 후 여과한 잔여물에 4 M 수산화나트륨을 가한 후 90분 동안 초음파 처리하여 알칼리 가수분해 하였으며, 알칼리 가수분해물은 4 M HCl을 이용하여 pH 2로 조정한 후 2,200×g에서 원심분리한 상등액에 diethyl ether : ethyl acetate(1:1) 혼합액을 이용하여 페놀 화합물을 분리 용출하였다.
- 이동상은 0.1% acetic acid가 포함된 증류수(A)와 0.1% acetic acid가 포함된 아세토니트릴(B)을 gradient 조건으로 흘려 주었고, gradient 조건은 A:B를 초기 92:8(%, v/v)에서 2분에 90:10, 27분에 70:30, 50분에 10:90, 51분에 0:100, 60분에 0:100, 70분에 92:8로 설정하였으며, 유속은 1 mL/min으로 하였고 주입량은 20 μL로 설정하였다.
- 이동상은 5% formic acid가 포함된 아세토니트릴(A)과 5% formic acid가 포함된 증류수(B)를 gradient 조건으로 흘려주었고, gradient 조건은 A : B를 초기 10:90(%, v/v)에서 24분에 40:60, 25분에 100:0, 28분에 100:0, 29분에 10:90, 40분에 10:90으로 설정하였으며, 유속은 1 mL/min으로 하였고 주입량은 20 μL로 설정하였다.
- 일정량의 시료에 0.3% HCl을 포함한 80% 메탄올을 가한 후 25°C에서 1시간 동안 3회 초음파 추출하였으며, 추출물은 2,200×g에서 10분 동안 원심분리 하여 100 mL로 정용한 다음 0.45 μm syringe filter(Millipore)로 여과하여 유리형 분석 시료로 사용하였다.
- 발아 팥의 유리형 페놀화합물은 Seo 등(16)과 Jung 등(17)의 방법을 변형하여 추출하였다. 일정량의 시료에 80% 메탄올을 가한 후 1시간 동안 3회 초음파 추출하였으며, 추출물은 여과지로 여과하여 감압농축 하고, 10% 메탄올 50 mL로 녹인 후 diethyl ether : ethyl acetate(1:1) 혼합액을 이용하여 페놀화합물을 분리 용출하였다. 분리 용출하여 얻어진 페놀화합물은 HPLC용 메탄올에 용해한 다음 0.
- 즉 각 추출물 100 μL에 2% Na2CO3 용액 2 mL를 가한 후 3분 방치하여 50% Folin-Ciocalteu’s reagent 100 μL를 가하였다.
- 즉 유리형 안토시아닌을 추출한 후 여과한 잔여물에 10 mL의 2 N HCl을 가한 다음 2시간 동안 100°C에서 가열하여 산 가수분해 하였으며, 산 가수분해물은 100 mL로 정용한 다음 0.45 μm syringe filter(Millipore)로 여과하여 결합형 분석시료로 사용하였다.
- 총 플라보노이드 함량은 Zhishen 등(20)의 방법을 변형하여 분석하였다. 폴리페놀 분석을 위한 추출물 250 µL에 증류수 1 mL와 5% 아질산나트륨 75 µL를 가한 다음 5분 후 10% 염화알루미늄 육수화물 150 µL를 가하여 6분간 방치하고 1 M 수산화나트륨 500 µL를 가하여 11분간 방치한 다음, 반응액의 흡광도를 510 nm에서 측정하였다.
- 페놀산 함량은 Seo 등(16)과 Jung 등(17)의 방법을 변형하여 분석하였다. 분리 용출하여 얻어진 유리형 및 결합형 페놀화합물은 HPLC용 메탄올에 용해한 다음 0.
- 폴리페놀 분석을 위한 추출물 250 µL에 증류수 1 mL와 5% 아질산나트륨 75 µL를 가한 다음 5분 후 10% 염화알루미늄 육수화물 150 µL를 가하여 6분간 방치하고 1 M 수산화나트륨 500 µL를 가하여 11분간 방치한 다음, 반응액의 흡광도를 510 nm에서 측정하였다.
- 실온에서 30분 방치 후 반응액의 흡광도 값을 750 nm에서 측정하였다. 표준물질로 gallic acid(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)를 5, 10, 25 및 50배로 희석하여 사용하였으며, 검량선 작성 후 총 폴리페놀 함량은 시료 1 g 중의 mg gallic acid로 나타내었다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 검정팥은 검구슬(Geomguseul)로 2015년도에 생산된 팥을 농촌진흥청에서 분양받아 사용하였다. 발아는 Lopez 등(15)의 방법에 따라 팥을 20°C의 증류수로 수세하고 5배의 증류수를 가수하여 24시간 동안 침지시킨 다음 발아기(WGC 450, Dahan Inc.
- 폴리페놀 분석을 위한 추출물 250 µL에 증류수 1 mL와 5% 아질산나트륨 75 µL를 가한 다음 5분 후 10% 염화알루미늄 육수화물 150 µL를 가하여 6분간 방치하고 1 M 수산화나트륨 500 µL를 가하여 11분간 방치한 다음, 반응액의 흡광도를 510 nm에서 측정하였다. 표준물질로 (+)-catechin hydrate(Sigma-Aldrich Co.)를 사용하여 보정선을 작성하였다.
- 6×250 mm, Kanto Chemical, Tokyo, Japan)을 사용하였고 칼럼 온도는 30°C로 설정하였다. 표준물질로는 cyanidin-3-glucose, delphinidin-3-glucose, petunidin-3-glucose, cyanidin 및 delphinidin을 사용하였다.
데이터처리
- 통계분석은 SPSS 통계프로그램(Statistical Package for the Social Science, Ver. 12.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 각 측정군의 평균과 표준편차를 산출하고 처리조건 간의 차이 유무를 one-way ANOVA(analysis of variance)로 분석한 뒤 Duncan’s multiple range test를 이용하여 유의성을 검정하였다.
이론/모형
- 발아는 Lopez 등(15)의 방법에 따라 팥을 20°C의 증류수로 수세하고 5배의 증류수를 가수하여 24시간 동안 침지시킨 다음 발아기(WGC 450, Dahan Inc., Seoul, Korea)로 발아시켰다.
- 안토시아닌 및 안토시아니딘 함량은 Choung(23)의 방법에 따라 HPLC(ACME9000 system, Younglin)로 분석하였다. 이동상은 5% formic acid가 포함된 아세토니트릴(A)과 5% formic acid가 포함된 증류수(B)를 gradient 조건으로 흘려주었고, gradient 조건은 A : B를 초기 10:90(%, v/v)에서 24분에 40:60, 25분에 100:0, 28분에 100:0, 29분에 10:90, 40분에 10:90으로 설정하였으며, 유속은 1 mL/min으로 하였고 주입량은 20 μL로 설정하였다.
- 총 폴리페놀 함량은 Dewanto 등(19)의 방법에 따라 Folin-Ciocalteu’s reagent가 추출물의 폴리페놀성 화합물에 의해 환원된 결과 몰리브덴 정색으로 발색하는 것을 원리로 측정하였다.
성능/효과
- 발아기간에 따른 유리형 및 결합형 안토시아닌 함량 변화는 Table 2와 같다. Cyanidin-3-glucose, delphinidin-3-glucoside, petunidin-3-glucose, cyanidin 및 delphinidin이 검출되었고 발아기간이 증가함에 따라 총 안토시아닌 및 안토시아니딘 함량은 감소하였다. 유리형 안토시아닌 및 안토시아니딘 함량은 발아 전 각각 29.
- 또한, cyanidin의 경우 catechin과 함께 cyanidin-catechin, proanthocyanidin 및 타닌의 구성성분으로서 발아가 진행됨에 따라 식물이 성장하면서 구조적인 세포벽을 지지하기 위한 타닌 및 타닌 중합체와 같은 고분자 화합물을 생합성하는 데 일부 이용된 것으로 판단된다(32). 결합형의 경우 산 가수분해에 의해 안토시아닌은 검출되지 않았으며, 안토시아니딘은 발아 기간이 증가함에 따라 원곡의 69.85 mg/100 g에서 발아 2일, 4일 및 6일 이후 17.54, 15.02 및 13.85 mg/100 g으로 발아 초기 급격하게 감소하여 대부분의 결합형 안토시아니딘이 침지 및 발아 초기과정에서 손실되는 것을 확인하였다. 안토시아닌은 극성의 수용성 색소로서 살수과정에 서 카로테노이드와 같은 지용성 색소보다 불안정하고, anthocyanin-β-glucosidase와 polyphenol oxidase와 같은 식물조직에 존재하는 효소가 안토시아닌 가수분해에 중요한 역할을 한다(33).
- 또한, homogentisic acid, chlorogenic acid, (+)-catechin, phloretic acid 및 p-coumaric acid 등 5종의 페놀산은 유리형 함량이 원곡에서 각각 3.40, 0.50, 6.44, 1.47 및 0.45 μg/g에서 발아 초기 9.48, 1.83, 6.44, 1.96 및 1.48 μg/g으로 증가하였지만, 발아 6일 이후 ND, ND, 6.00, 2.54 및 0.59 μg/g으로 검출되지 않거나 급격히 감소했지만 결합형 함량은 원곡에서 5.34, 0.35, 9.97, 1.55 및 1.30 μg/g에서 발아기간이 증가함에 따라 지속해서 증가하여 발아 6일 이후 16.70, 12.08, 25.84, 13.14 및 9.06 μg/g으로 높게 나타났다.
- 일반적으로 종자를 발아시키면 가수분해효소의 활성화에 따라 6’-O-feruloyl sucrose, 6’-O-sinapoyl sucrose, ferulic acid 및 sinapinic acid와 같은 플라보노이드 계열의 화합물의 용출이 용이해져 함량이 증가하는 것으로 알려져 있으며(27), 폴리페놀 결과와 마찬가지로 발아 초기 결합형 플라보노이드의 일부가 추출이 가능한 유리형 플라보노이드 형태로 전환됨에 따라 발아 초기 결합형 플라보노이드 함량의 감소와 함께 유리형 플라보노이드 함량이 증가한 것으로 판단된다. 또한, 발아기간에 따른 결합형 플라보노이드 함량은 발아 초기에 감소하였다가 발아 2일부터 지속해서 증가하는 경향을 보여 발아 전 2.29 mg/g에서 발아 1일 후 1.41 mg/g으로 감소하였다가 발아 2일에서 6일 사이에 1.65에서 2.17 mg/g으로 증가하였으며, 이러한 결과는 폴리페놀 함량 결과와 유사한 경향이었다(Fig. 1). 하지만 플라보노이드의 경우 유리형 플라보노이드 증가율보다 결합형 플라보노이드의 감소율이 높아 총 플라보노이드 함량이 발아 전 2.
- 발아기간에 따른 검정팥의 플라보노이드 함량 변화는 Fig. 2에서 보는 바와 같이 발아일수가 증가함에 따라 유리형, 결합형 및 총 플라보노이드 함량이 유의적으로 증가하였다. 유리형 플라보노이드 함량은 발아 초기보다는 발아 후기에 많은 증가를 보였는데 발아 전 0.
- 발아기간에 따른 유리형 및 결합형 구성 페놀산 조성 변화는 Table 1과 같이 ferulic acid, veratric acid, hesperidin, salicylic acid, naringenin 및 hesperitin은 총 페놀산 함량 경향과 유사하게 유리형 및 결합형 페놀산 함량이 모두 증가하였으며, 유리형 및 결합형을 포함하는 총 함량이 발아 전 0.70, ND, 0.91, 0.82, 0.02 μg/g 및 ND로 검출되지 않거나 미량이었지만 발아 6일 이후 6.07, 9.37, 3.51, 26.41, 34.66, 18.09 μg/g으로 많이 증가하였다.
- 발아기간에 따른 구성 페놀산의 변화의 경우 ferulic acid, veratric acid, hesperidin, salicylic acid, naringenin 및 hesperidin과 총 페놀산은 유리형 및 결합형 페놀산 함량이 모두 증가하였지만, 안토시아닌 및 안토시아니딘은 침지 및 발아과정에서 손실되어 감소하였다. 본 연구 결과 팥을 발아시킬 경우 폴리페놀, 플라보노이드 및 페놀산 함량이 증가함에 따라 팥에 함유된 기능성분의 이용성을 증대시키기 위해서는 발아공정의 적용이 효과적이라고 판단된다.
- Cyanidin-3-glucose, delphinidin-3-glucoside, petunidin-3-glucose, cyanidin 및 delphinidin이 검출되었고 발아기간이 증가함에 따라 총 안토시아닌 및 안토시아니딘 함량은 감소하였다. 유리형 안토시아닌 및 안토시아니딘 함량은 발아 전 각각 29.51 및 28.72 mg/100 g에서 발아 6일 이후 4.51 및 13.12 mg/100 g으로 발아기간이 증가함에 따라 감소하였으며, 안토시아니딘보다 안토시아닌의 감소폭이 크게 나타났다. 이러한 결과는 살수과정에서 수용성 색소인 안토시아닌 및 안토시아닌이 손실되는 것과 함께 anthocyanin-β-glucosidase와 같은 안토시아닌 가수분해 효소의 활성화에 따라 안토시아닌이 안토시아니딘으로 전환됨에 따른 결과로 판단된다(25).
- 본 연구에서는 발아에 의한 팥의 기능성분 변화를 살펴보기 위하여 6일 동안 발아시키면서 유리형 및 결합형 폴리페놀, 플라보노이드, 페놀산 및 안토시아닌의 변화를 분석하였다. 유리형 폴리페놀 및 플라보노이드 함량은 발아기간이 증가함에 따라 각각 약 2.6배 및 5배 정도 증가하였으며, 결합형 폴리페놀 및 플라보노이드 함량은 발아 초기 감소하였다가 발아 3일 및 2일 이후 각각 증가하였다. 발아기간에 따른 구성 페놀산의 변화의 경우 ferulic acid, veratric acid, hesperidin, salicylic acid, naringenin 및 hesperidin과 총 페놀산은 유리형 및 결합형 페놀산 함량이 모두 증가하였지만, 안토시아닌 및 안토시아니딘은 침지 및 발아과정에서 손실되어 감소하였다.
- 이는 팥의 발아가 진행됨에 따라 총 폴리페놀 함량이 발아 144시간까지 증가한다는 Woo 등(24)의 연구와 유사하였으며, 발아 초기에 유리형의 폴리페놀 함량이 증가한 원인은 결합형 폴리페놀 함량이 감소함에 따라 나타난 결과라고 생각된다. 즉 발아기간에 따른 검정팥의 결합형 폴리페놀 함량은 발아 전 4.99 mg/g이었지만 발아 2일 이후 4.10 mg/g으로 감소하였다. 세포벽의 결합형 폴리페놀 및 플라보노이드는 일반적으로 셀룰로스, 펙틴, 다당류 등의 세포벽 성분과 공유결합을 하고 있으며, 발아 초기 결합형 폴리페놀의 일부가 추출이 가능한 유리형 폴리페놀 형태로 전환됨에 따라 유리형 폴리페놀의 증가와 함께 결합형 폴리페놀 함량이 감소한 것으로 판단된다.
- 총 결합형 페놀산 함량 또한 발아기간이 증가함에 따라 20.06~115 μg/g 범위로 증가하여 유리형 페놀산 함량과 유사한 경향을 나타내었다.
- 총 유리형 페놀산 함량은 발아기간이 증가함에 따라 지속해서 증가하여 원료곡의 함량은 16.04 μg/g이었지만 발아 2일, 발아 4일 및 발아 6일 이후 35.06, 52.37 및 91.37 μg/g으로 증가하였다.
- 1). 하지만 플라보노이드의 경우 유리형 플라보노이드 증가율보다 결합형 플라보노이드의 감소율이 높아 총 플라보노이드 함량이 발아 전 2.89 mg/g에 비해 발아 1일 이후 2.09 mg/g으로 감소하였다. 이처럼 발아 초반 함량이 일시적으로 감소하는 것은 살수과정에서 수용성 항산화 성분이 씻겨 내려가 감소하는 것으로 생각되며(24) 추후 정확한 감소 원인 규명과 감소 최소화 제조조건의 구명이 필요할 것으로 생각된다.
후속연구
- 안토시아닌은 극성의 수용성 색소로서 살수과정에 서 카로테노이드와 같은 지용성 색소보다 불안정하고, anthocyanin-β-glucosidase와 polyphenol oxidase와 같은 식물조직에 존재하는 효소가 안토시아닌 가수분해에 중요한 역할을 한다(33). 따라서 발아과정에서 안토시아닌 함량이 감소한 것은 침지 및 발아 과정에서 수용성 분자인 안토시아닌이 씻겨 내려가 손실된 것과 함께 안토시아닌 가수분해 및 고분자 플라보노이드 생합성 효소의 활성화에 따른 결과로 판단되며, 추후 발아과정 중의 안토시아닌 감소 최소화 조건의 구명이 필요할 것으로 생각된다.
- 09 mg/g으로 감소하였다. 이처럼 발아 초반 함량이 일시적으로 감소하는 것은 살수과정에서 수용성 항산화 성분이 씻겨 내려가 감소하는 것으로 생각되며(24) 추후 정확한 감소 원인 규명과 감소 최소화 제조조건의 구명이 필요할 것으로 생각된다.
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