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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 고농도 GABA를 생성하는 균주를 탐색하여 분리･동정하고 생장조건에 따른 GABA 함량을 측정하였으며, 미강 추출물로 최적화한 배지를 제조한 후 일반배지와 GABA 생성량을 비교하였다. 또한, 최적화한 미강 추출물의 배양액을 electrostatic spray를 이용하여 각종 곡류에 분주하여 기존 곡류가 가진 GABA 함량과 electrostatic spray로 처리하였을 때의 GABA 함량을 비교하여 제품으로 활용 가능성이 있는지 확인하고자 하였다.
- 본 연구는 유산균에 의한 gamma aminobutyric acid (GABA)의 생산 및 쌀겨 추출물을 이용한 최적 배지의 제조를 목표로 하고 electrostatic spray는 곡물에 GABA 함량을 증진시키기 위해 사용하였다. 분리한 Lactobacillus brevis CFM11을 MRS 배지를 이용하여 최적 조건(37℃, 24시간, pH 6.
제안 방법
- Electrostatic spray 처리 후 GABA의 온도 저항성을 알아보기 위해 최적화한 미강 추출물 배지에 배양된 L. brevis CFM11을 electrostatic spray로 곡류에 분주한 후 24시간 건조시킨 다음 온도별(50℃, 70℃ 및 100℃), 시간별(1시간, 2시간 및 3시간)에 따른 GABA량의 변화를 비교 분석하여 Table 5에 나타냈다. 쌀은 electrostatic spray로 처리 후 50℃에서는 GABA량이 비슷하게 유지되었고, 70℃에서는 2시간까지 증가하다 3시간 후 조금 감소하였고, 100℃에서는 228.
- Electrostatic spray를 이용해 쌀, 노란차좁쌀, 현미, 찰현미에 미강 추출물로 배양된 균주를 분주하였다. Electrostatic spray를 비교하기 위해 conventional spray(Tree, STD, Incheon, Korea)를 사용하였다.
- Electrostatic spray의 도포성을 확인하기 위해 농축된 Lactobacillus brevis CFM11 균체를 pyronin Y(P9172, Sigma-Aldrich Co.)로 10분간 염색한 후 여러 차례 원심분리를 통하여 세척하고 쌀에 1 m 떨어진 거리에서 conventional spray와 electrostatic spray를 이용하여 분주한 후 염색된 쌀알을 광학적 절편(optical sectioning)으로 연속적 영상을 재구성하여 관찰하였다.
- GABA 검량선을 얻기 위해 효소 Gabase 분석법을 바탕으로 1 mM GABA(A5835, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA), 0.5 M K4P2O7, 4 mM NADP(Sigma-Aldrich Co.), 2.0 units Gabase/mL(G7509, Sigma-Aldrich Co.), 20 mM α-ketoglutarate(KG)(K1750, Sigma-Aldrich Co.)를 제조하였다.
- GABA 생성량 측정 결과 탄소원, 질소원, 무기염류에서 GABA량이 가장 높은 배지를 선정하고 배지 조성에 대한 최적 조건을 설정할 때 하나의 요인을 여러 수준으로 놓고 나머지 요인들을 고정시켜 실험하는 “one factor at a time method(OFAT)”법(18)에 기초하여 한 요인을 다양한 수준으로 첨가하면서 다른 요인들을 고정시킨 값을 첨가한 미강 추출물 배지를 이용하여 37℃에서 24시간 동안 배양 후 GABA량을 측정하였다.
- L. brevis CFM11 균주는 미강 추출물 배지에 첨가되는 탄소원, 무기질, 질소원의 종류에 따라 GABA량이 다르게 나타났고 GABA 생산량이 가장 높은 sucrose, magnesium sulfate, skim milk를 선정하였다.
- MSG 첨가에 따른 GABA 생성량을 알아보기 위해 최적화 된 미강 추출물 배지에 MSG를 첨가시켰다. 고농도 GABA생성을 위해 배지에 MSG를 첨가한 결과는 최적화된 미강 추출물 배지에 0.
- 본 연구에서 사용된 미강, 쌀, 노란차좁쌀, 현미, 찰현미는 (주)천보내츄럴푸드(Icheon, Korea)에서 제공받아 사용하였다. 곡류에 미강 추출물로 배양된 균주를 접종하기 위해 electrostatic spray(SE-EB, ESS, Maxcharge, Watkinsville, GA, USA)를 사용하였다.
- 최적화된 미강 추출물에 배양된 균주를 5%(v/v) 접종하여 37℃에서 24시간 동안 배양한 후, 5 mL 배양액을 곡류로부터 1 m 떨어진 거리에서 electrostatic spray를 이용하여 분주하고 37℃에서 24시간 동안 건조시킨 후 GABA량을 측정하고 50℃, 70℃ 및 100℃에서 1시간, 2시간 및 3시간 동안 열처리를 하고 GABA량을 측정하였다. 그리고 electrostatic spray 처리한 곡류의 취반이 GABA 생성량에 끼치는 영향을 알아보기 위하여 최적화된 미강 추출물에 배양한 L. brevis CFM11을 electrostatic spray를 이용해 곡류 100 g에 분주하여 24시간 건조한 후 시료 무게의 5배의 증류수를 가하여 1분간 10회 저어주며 세척한 다음 GABA량 측정 실험에 사용하였다.
- 영양분이 풍부한 미강을 배지로 이용하여 유산균을 증식시킨다면 부산물의 부가가치 증진을 위한 산업용 소재로 활용할 수 있을 것이고 식품첨가제에 사용되는 electrostatic spray를 이용하여 GABA를 더 효과적으로 식품에 적용할 수 있을 것이다. 따라서 본 연구에서는 고농도 GABA를 생성하는 균주를 탐색하여 분리･동정하고 생장조건에 따른 GABA 함량을 측정하였으며, 미강 추출물로 최적화한 배지를 제조한 후 일반배지와 GABA 생성량을 비교하였다. 또한, 최적화한 미강 추출물의 배양액을 electrostatic spray를 이용하여 각종 곡류에 분주하여 기존 곡류가 가진 GABA 함량과 electrostatic spray로 처리하였을 때의 GABA 함량을 비교하여 제품으로 활용 가능성이 있는지 확인하고자 하였다.
- 멸균배지에 분리균주를 5%(v/v) 접종한 후 37℃에서 24시간 동안 배양하면서 optical density, pH 변화, GABA 생성량을 측정하였다. GABA 생성량 측정 결과 탄소원, 질소원, 무기염류에서 GABA량이 가장 높은 배지를 선정하고 배지 조성에 대한 최적 조건을 설정할 때 하나의 요인을 여러 수준으로 놓고 나머지 요인들을 고정시켜 실험하는 “one factor at a time method(OFAT)”법(18)에 기초하여 한 요인을 다양한 수준으로 첨가하면서 다른 요인들을 고정시킨 값을 첨가한 미강 추출물 배지를 이용하여 37℃에서 24시간 동안 배양 후 GABA량을 측정하였다.
- MRS broth에 monosodium glutamate(MSG)를 첨가하여 121℃에서 15분간 습열 멸균시킨 후 이에 분리균주를 5%(v/v) 접종하여 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 미리 구한 검량선을 이용하여 GABA량을 측정하였다.
- 유산균 배양배지인 MRS broth의 구성성분을 바탕으로 미강 추출물에 첨가할 탄소원(dextrose, sucrose, lactose, galactose), 질소원(beef extract, peptone, tryptone, skim milk), 무기염류(sodium acetate, dipotassium sulfate, magnesium sulfate, ammonium citrate)를 선정하고 이를 탄소원, 질소원은 2%(w/v)씩, 무기염류는 0.2%(w/v)씩 첨가 후, 121℃에서 15분 멸균하여 배지로 사용하였다.
- 최적화된 미강 추출물에 배양된 균주를 5%(v/v) 접종하여 37℃에서 24시간 동안 배양한 후, 5 mL 배양액을 곡류로부터 1 m 떨어진 거리에서 electrostatic spray를 이용하여 분주하고 37℃에서 24시간 동안 건조시킨 후 GABA량을 측정하고 50℃, 70℃ 및 100℃에서 1시간, 2시간 및 3시간 동안 열처리를 하고 GABA량을 측정하였다. 그리고 electrostatic spray 처리한 곡류의 취반이 GABA 생성량에 끼치는 영향을 알아보기 위하여 최적화된 미강 추출물에 배양한 L.
- 취반은 세척한 곡류 50 g에 1.3배의 증류수를 가하여 전기밥솥(CW-8500P, MediHeim, Seoul, Korea)에서 약 40분간 가열 취반하였으며 취반 후 GABA량 측정 실험에 사용하여 GABA량을 측정하였다.
대상 데이터
- (주)천보내츄럴푸드에서 제공받은 미강에 10배의 증류수를 가한 후 55℃에서 24시간 온수 추출하였다. 이를 No.
- Electrostatic spray를 이용해 쌀, 노란차좁쌀, 현미, 찰현미에 미강 추출물로 배양된 균주를 분주하였다. Electrostatic spray를 비교하기 위해 conventional spray(Tree, STD, Incheon, Korea)를 사용하였다.
- 본 연구에서 사용된 미강, 쌀, 노란차좁쌀, 현미, 찰현미는 (주)천보내츄럴푸드(Icheon, Korea)에서 제공받아 사용하였다. 곡류에 미강 추출물로 배양된 균주를 접종하기 위해 electrostatic spray(SE-EB, ESS, Maxcharge, Watkinsville, GA, USA)를 사용하였다.
- 본 연구에서는 충북대학교 식품생명공학과 식품미생물학 실험실에서 자체 보유하고 있는 Lactobacillus brevis CFM11을 실험에 사용하였다. 상업용 유산균은 한국생물지원센터(Korean Collection for Type Cultures, Wanju, Korea)에서 분양받은 것을 사용하였다.
- 본 연구에서는 충북대학교 식품생명공학과 식품미생물학 실험실에서 자체 보유하고 있는 Lactobacillus brevis CFM11을 실험에 사용하였다. 상업용 유산균은 한국생물지원센터(Korean Collection for Type Cultures, Wanju, Korea)에서 분양받은 것을 사용하였다. 전배양 및 본배양을 위한 생육배지로 Lactobacilli MRS broth를 사용하였고 균주는 50%의 glycerol이 함유된 배지에 접종하여 -85℃의 deep freezer(Ulter-low temperature freezer, MDF-192, Sanyo Electric Biomedical Co.
- 상업용 유산균은 한국생물지원센터(Korean Collection for Type Cultures, Wanju, Korea)에서 분양받은 것을 사용하였다. 전배양 및 본배양을 위한 생육배지로 Lactobacilli MRS broth를 사용하였고 균주는 50%의 glycerol이 함유된 배지에 접종하여 -85℃의 deep freezer(Ulter-low temperature freezer, MDF-192, Sanyo Electric Biomedical Co., Ltd., Osaka, Japan)에 보관하여 사용하였으며, 실험에 사용하기 전 3회 이상 계대 배양하여 활성화한 후 사용하였다.
데이터처리
- 실험 결과에 대한 통계분석은 SPSS(Statistical Package for the Social Science, Ver 12.0, SPP Inc., Chicago, IL, USA) 프로그램을 이용하여 각 실험군의 평균값으로 나타냈으며 one-way ANOVA로 처리한 후 Duncan’s multiple range test에 의해 실험군 간의 차이를 P<0.05에서 유의성을 검정하였다.
성능/효과
- 쌀알을 confocal laser scanning을 이용해 X position: 257, Y position: 257, Z position: 10~24층으로 왼쪽에서 오른쪽으로 갈수록 바깥층엔 연속 광학적 절편으로 나타냈다. Conventional spray에 비해 electrostatic spray가 더 넓게 분주되었고, 흡수된 정도도 큰 것으로 나타났다.
- Electrostatic spray 처리된 곡류를 취반한 결과 모두 GABA량이 감소했다. 쌀은 228.
- MRS broth에서 배양한 L. brevis CFM11의 GABA 생성량인 600.12 μg/mL와 비교했을 때 미강 추출물 배지에서 배양한 것은 이에 약 1/2 수준인 것으로 나타났다.
- MSG의 함량이 증가할수록 GABA량이 증가했으며, 0.8%(v/v)에서 2,002.93μg/mL로 가장 높은 GABA량이 측정되었다.
- 93μg/mL로 가장 높은 GABA량이 측정되었다. 그러나 통계분석 결과 0.4~1.0% MSG 첨가 후 GABA 생성량이 실험적으로 유의적 차이가 없는 것으로 나타났고, L. brevis CFM11의 GABA 생성량을 증가시키기 위해서는 0.4%의 MSG로도 충분할 것으로 보인다.
- 그리고 electrostatic spray로 분주했을 때는 쌀의 GABA량이 32.23 μg/g에서 228.10μg/g으로 약 7배 증가했고, conventional spray로 분주했을 때 87.60 μg/g보다도 약 3배 증가한 것으로 나타났다.
- 이 결과로 보아 균의 생장과 GABA 생성량은 큰 상관관계가 없는 것으로 예상된다. 그리고 탄소원과 무기질은 종류에 따라 GABA 생성량의 차이가 크게 나타났지만, 이에 반해 질소원은 종류에 큰 영향을 받지 않고 GABA량이 비슷하게 측정되었다. 따라서 미강 추출물 배지를 최적화하는 데 탄소원은 sucrose, 질소원은 skim milk, 무기질은 magnesium sulfate를 첨가하는 것이 L.
- Electrostatic spray로 인해 취반 과정 중 수세과정에서 곡류에 부착된 GABA가 씻겨나가 GABA량에 영향을 미치는 것으로 보인다. 따라서 electrostatic spray가 처리된 곡류를 취반한 후에는 GABA량이 감소한 것을 알 수 있었다(Table 6).
- 쌀 이외에도 다른 곡류에서도 마찬가지로 conventional spray로 분주했을 때보다 electrostatic spray로 분주했을 때 GABA 생성량이 증가하였다. 따라서 electrostatic spray의 정전기력으로 인해 목표 물체에 미강 발효물이 잘 부착하여 분포성이나 흡수성이 conventional spray보다 우수하고 GABA량을 향상시키는 데 효과적인 것을 알 수 있었다(Table 4).
- 그리고 탄소원과 무기질은 종류에 따라 GABA 생성량의 차이가 크게 나타났지만, 이에 반해 질소원은 종류에 큰 영향을 받지 않고 GABA량이 비슷하게 측정되었다. 따라서 미강 추출물 배지를 최적화하는 데 탄소원은 sucrose, 질소원은 skim milk, 무기질은 magnesium sulfate를 첨가하는 것이 L. brevis CFM11의 GABA 생성 능력을 높이는 것으로 생각된다.
- 6% 이상 첨가하면 GABA 전환이 더디어지는 것을 알 수 있었다. 따라서 최적화된 미강 추출물 배지에 MSG를 0.4% 첨가하면 L. brevis CFM11이 생성하는 GABA량이 더 증가할 것이다(Table 3).
- 고농도의 MSG는 GABA 전환을 감소시키는 것으로 보인다고 보고한 바 있다. 또한, MRS broth 배지에서는 0.8%일 때 GABA생성이 가장 우수했으나 미강 추출물 배지에서는 0.4%일 때 GABA 생성이 가장 우수했다. 단 0.
- 배지에 sucrose, magnesium sulfate, skim milk를 같은 양을 첨가하여 고정시킨 후 OFAT법에 기초하여 sucrose, magnesium sulfate, skim milk를 다양한 수준(0~2 g/20mL)으로 첨가하여 배양한 결과, sucrose 0.4 g에서 195.17μg/mL, magnesium sulfate 0.04 g에서 103.39 μg/mL, skim milk 0.2 g에서 267.61 μg/mL로 높은 GABA 생성량이 확인되었다(Table 2).
- 분리한 Lactobacillus brevis CFM11을 MRS 배지를 이용하여 최적 조건(37℃, 24시간, pH 6.5)에서 배양시킨 결과, 600.12 μg/mL의 GABA생성량을 나타냈고 0.8% MSG를 함유한 MRS 배지에서 배양시켰을 때 2,002.93 μg/mL의 GABA 생성량을 나타냈다.
- 쌀은 228.10 μg/g에서 취반 후 57.61μg/g으로 감소하여 네 가지 곡류 중 감소량이 가장 크게 나타났으며, 현미, 노란차좁쌀, 찰현미는 각각 161.98 μg/g에서 80.53 μg/g, 79.34 μg/g에서 49.67 μg/g, 46.28 μg/g에서 25.26 μg/g으로 약 1/2배씩 감소한 GABA량이 측정되었다.
- 쌀은 electrostatic spray로 처리 후 50℃에서는 GABA량이 비슷하게 유지되었고, 70℃에서는 2시간까지 증가하다 3시간 후 조금 감소하였고, 100℃에서는 228.10 μg/g에서 3시간 후 310.75 μg/g 정도로 증가한 것을 볼 수 있었다.
- 앞서 진행한 실험 결과를 토대로 탄소원은 2% sucrose, 질소원은 1% skim milk, 무기질은 0.2%를 첨가하여 미강 추출물 배지를 최적화하였고 최적화 전 미강 추출물 배지에서 배양한 L. brevis CFM11은 61.04 μg/mL의 GABA를 생성한 반면, 최적화 후 미강 추출물 배지에서 284.66 μg/mL의 GABA를 생성하여 4배 이상 GABA 생성량이 증가한 것을 확인할 수 있었다.
- 19 μg/mL로 높게 나타났다. 이 결과로 보아 균의 생장과 GABA 생성량은 큰 상관관계가 없는 것으로 예상된다. 그리고 탄소원과 무기질은 종류에 따라 GABA 생성량의 차이가 크게 나타났지만, 이에 반해 질소원은 종류에 큰 영향을 받지 않고 GABA량이 비슷하게 측정되었다.
- 61 μg/mL로 높은 GABA 생성량이 확인되었다(Table 2). 즉 2% sucrose, 0.02% magnesium sulfate, 1% skim milk를 첨가했을 때 GABA량이 가장 높게 나타났다.
- 찰현미는 온도에 관계없이 GABA량이 약 10~20 μg/g 정도 증가하다가 시간이 지남에 따라 감소하는 것으로 나타났다.
- 최적화 배지에 L. brevis CFM11을 배양시켜 얻은 GABA를 쌀 표면에 electrostatic spray 처리 후 GABA량은 228.10 μg/g으로 나타난 반면, 아무것도 처리하지 않은 곡류에서의 GABA량은 32.23 μg/g이었다.
- 탄소원은 lactose, 질소원은 tryptone, 무기질에서는 dipotassium sulfate에서 흡광도 값이 1.42, 1.59, 1.59로 균의 생장이 가장 높았으나, GABA 생성량은 탄소원인 sucrose에서 124.68 μg/mL, 질소원인 skim milk에서 216.47μg/mL, 무기질인 magnesium sulfate에서 105.19 μg/mL로 높게 나타났다.
- 75 μg/g 정도로 증가한 것을 볼 수 있었다. 현미는 다른 온도에 비해 100℃에서 GABA량이 2배 이상 증가하였고, 쌀과는 다르게 50℃, 70℃에서 3시간 후 GABA량이 증가한 것을 볼 수 있었다. 노란차좁쌀은 온도에 관계없이 GABA량이 비슷하게 유지되거나 감소하는 경향을 나타냈다.
후속연구
- GABA는 매우 다양한 생리기능을 가지고 있어 기능성 소재 개발을 위한 연구가 활발히 추진 중이다. 영양분이 풍부한 미강을 배지로 이용하여 유산균을 증식시킨다면 부산물의 부가가치 증진을 위한 산업용 소재로 활용할 수 있을 것이고 식품첨가제에 사용되는 electrostatic spray를 이용하여 GABA를 더 효과적으로 식품에 적용할 수 있을 것이다. 따라서 본 연구에서는 고농도 GABA를 생성하는 균주를 탐색하여 분리･동정하고 생장조건에 따른 GABA 함량을 측정하였으며, 미강 추출물로 최적화한 배지를 제조한 후 일반배지와 GABA 생성량을 비교하였다.
- 유산균은 발효식품의 주된 미생물로 정장 작용, 면역 조절, 항암 효과, 콜레스테롤 저하, 항알레르기 효과 등의 기능성이 있고 오랫동안 발효 유제품의 스타터로 이용되어 왔다(6). 유산균은 일반적으로 안전한 것으로 간주되며, 오랜 시간 동안 식품 산업에서 널리 사용되어서 유산균에 의한 GABA 생산이 안전하다는 것을 알 수 있고 유산균에 의해 생성된 GABA 및 유산균 자체의 건강 증진 특성을 충분히 활용할 수 있을 것으로 보인다.
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23 μg/g이었다. 이러한 결과로 보아 미강 추출물은 GABA 생산을 위한 MRS 배지의 대체물로서 산업적인 가치를 증가시킬
수 있을 것으로 판단된다.
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